Abstract
Bakgrunn
Tumor-infiltrere CD8 + T-celler er korrelert med langvarig progresjon og total overlevelse i ovarialcancer (EOC). En betydelig fraksjon av EOC pasienter montere autoantistoffresponser på forskjellige tumor-antigener, men forholdet mellom autoantistoffer og tumor-infiltrerende T-celler er ikke undersøkt i EOC eller en hvilken som helst annen kreft hos mennesker. Vi antok at autoantistoff og T-celle responser kan være korrelert i EOC og rettet mot de samme antigener.
Metodikk og hovedfunnene
Vi har innhentet matchet serum og svulstvev fra 35 pasienter med høy klasse serøs eggstokkreft. Serumprøver ble bedømt ved ELISA for autoantistoffer mot den felles tumorantigen NY-ESO-1. Svulstvev ble undersøkt av immunhistokjemi for uttrykk for NY-ESO-1, ulike T cellemarkører (CD3, CD4, CD8, CD25, foxp3, TIA-en og granzyme B) og andre immunologiske markører (CD20, MHC klasse I og MHC klasse II). Lymfatisk infiltrerer varierte mye mellom svulster og inkludert celler positive for CD3, CD8, TIA-en, CD25, foxp3 og CD4. Tjueseks prosent (9/35) av pasientene viste serum IgG-autoantistoffer mot NY-ESO-1, som var positivt korrelert med ekspresjonen av NY-ESO-1 antigen av tumorceller (r = 0,57, p = 0,0004). Autoantistoffer mot NY-ESO-1 var assosiert med økt tumor infiltrere CD8 +, CD4 + og foxp3 + celler. I en individuell HLA-A2 + pasient med autoantistoffer mot NY-ESO-1, CD8 + T-celler isolert fra solid svulst og ascites var reaktiv til NY-ESO-1 av IFN-y ELISPOT og MHC klasse I pentamer farging.
Konklusjon og betydning
Vi viser at kreftspesifikke autoantistoffer og tumor infiltrerende T-celler er korrelert i menneskelig kreft og kan rettes mot det samme målet antigen. Dette innebærer at autoantistoffer kan samarbeide med tumor-infiltrerende T-celler til å påvirke kliniske utfall i EOC. Videre kan serologiske screeningmetoder være nyttig for å identifisere klinisk relevante T-celle antigener for immunterapi
Citation. Milne K, Barnes RO, Girardin A, Mawer MA, Nesslinger NJ, Ng A, et al. (2008) Tumor-infiltrerende T-celler korrelerer med NY-ESO-1-spesifikke autoantistoffer i eggstokkreft. PLoS ONE 3 (10): e3409. doi: 10,1371 /journal.pone.0003409
Redaktør: Aric Gregson, University of California Los Angeles, USA
mottatt: 6 juni 2008, Godkjent: 17 september 2008; Publisert: 15 oktober 2008
Copyright: © 2008 Milne et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. British Columbia Cancer Foundation, Kanari Foundation, US Department of Defense (OC000018). Ingen av sponsorene hadde noen rolle i utformingen og gjennomføringen av studien, i innsamling, analyse og tolkning av data, eller i forberedelse, vurdering, eller godkjenning av manuskriptet
Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
ovarialcancer (EOC) er en utfordrende sykdom som rammer mer enn 190.000 kvinner verden over hvert år (International Agency for Research on Cancer) . Den høye dødeligheten skyldes det faktum at de fleste pasienter er diagnostisert med disseminert sykdom, ofte med omfattende ascites. Standard behandling innebærer cytoreduserende kirurgi etterfulgt av taxan og platina-basert kjemoterapi [1]. Over 80% av pasientene er svært mottakelig for Frontline behandling, men 60-70% opplever tilbakefall av sykdommen i løpet av 2-5 år og til slutt gi etter for sin sykdom [2], [3].
Til tross for disse uheldige statistikken, 20-30% av EOC pasientene overlever fem år eller mer etter diagnose. Gunstige prognostiske faktorer inkluderer tidlig stadium, ikke-serøs histologi, lav karakter, god ytelse status, og optimal kirurgisk debulking [4], [5]. I tillegg har flere nyere studier vist en sammenheng mellom tumor-infiltrerende CD3 + CD8 + T-celler og gode resultater [6], [7]. Zhang
et. al.
først rapportert at pasienter med CD3 + T-celle infiltrerer i tumor epitel hadde økt progresjonsfri og total overlevelse [8]. Dette har blitt bekreftet av to andre studier [9], [10], og to grupper har utvidet dette funnet til CD8 + T-celleundersett spesielt [11], [12]. I tillegg er tilstedeværelsen av CD3 + CD56 + -T-celler i ascites vært knyttet til platina følsomhet [13]. Disse funn er i overensstemmelse med tidligere studier som viser en positiv sammenheng mellom overlevelse og ekspresjon av interferon-γ (IFN-γ) [14], [15], IFN-γ reseptor [16], IL-18 [17], og MHC klasse i [18], [19], som alle er karakteristisk for CD8 + T-celleresponser. I motsetning til dette er tilstedeværelsen av tumor-infiltrerende CD25 + foxp3 + -T-celler i EOC korrelert med dårligere overlevelsen [11], [20] – [22]. Det synes således at balansen av CD8 + T-celler til CD25 + foxp3 + regulatoriske T-celler er en viktig determinant for kliniske resultater i EOC.
I tillegg til tumor-infiltrerende T-celler, mange EOC pasienter montere serum-autoantistoff svar på en rekke tumorantigener, inkludert NY-ESO-1, HOXA7, Ep-CAM, HSP-90, MUC-1 og p53 [23] – [25]. I type I diabetes og andre autoimmune tilstander, utvikling av autoantistoffresponser bebuder vevsinfiltrasjon og ødeleggelse av autoreaktive T-celler [26]. Vi har derfor en hypotese om at EOC pasienter kan vise en tilsvarende forhold mellom tumor-spesifikke autoantistoffresponser og tumor-infiltrerende lymfocytter. Denne hypotesen ble testet i en kohort av 35 avansert stadium, høy klasse serøs EOC saker som matchet serum og vevsprøver var tilgjengelig. Ved hjelp av NY-ESO-1 som en prøveantigenet, demonstrerer vi for første gang en korrelasjon mellom tumorspesifikke antistoffer og tumor-infiltrerende T-celler. Våre funn øke muligheten for at autoantistoffer kan spille en rolle i den tidligere anerkjent forhold mellom tumor-infiltrerende T-celler og kliniske resultater i EOC.
Resultater
Study kohorten
undersøkte forholdet mellom tumorspesifikke antistoffer og tumor-infiltrerende lymfocytter ved hjelp passet tumor og serumprøver fra en retrospektiv kohort av 35 pasienter med høy grad av serøs EOC (tabell 1). Vi har valgt å fokusere på en enkelt histologisk subtype, som andre undergrupper av EOC utviser forskjellige biologiske og kliniske egenskaper som kanskje har han brakte analyse [27]. Alle blodprøver ble oppsamlet før kirurgi eller kjemoterapi, og alle tumorprøver ble oppnådd ved tidspunktet for primær cytoreduktiv kirurgi før kjemoterapi. Kontrollblodprøver ble tatt fra 60 alderstilpassede kvinner uten kjent personlige historie av kreft.
Analyse av tumor-infiltrerende lymfocytter
Tumor-infiltrerende lymfocytter ble vurdert ved immunhistokjemi (IHC ) ved anvendelse av antistoffer mot en rekke immunologiske markører (figur 1, tabell 2). Alle rå IHC data kan finnes i Utfyllende Tabeller S1 og S2. Kun 23% (8/35) av de evaluerbare svulster viste betydelige CD20 + B-celle infiltrater. I motsetning til 94% (33/35) av tumorer hadde påvisbare CD3 + T-celle-infiltrater. Farging med antistoffer mot CD4 og CD8 viste at 59% (20/34) og 69% (24/35) av de evaluerbare svulster hadde betydelige CD4 + og CD8 + cellulære infiltrater, henholdsvis. CD4 + og CD8 + celler ble sterkt korrelert (r = 0,69, p 0,0001). Alle evaluerbare tumorer (27/27) uttrykt MHC klasse I til en viss grad, noe som indikerer at de kan teoretisk sett foreliggende antigen overfor den infiltrerende CD8 + T-celler. Sytti-to prosent (18/25) av svulster uttrykte MHC klasse II og dermed kan teoretisk tilstede antigen til CD4 + T-celler.
Siden mange svulster hadde tette CD8 + T-celle infiltrater, vi analysert vev for TIA-1 og granzyme B, som begge er uttrykt ved CD8 + cytotoksiske T-celler, så vel som naturlige dreperceller [28] – [30]. Sytti-tre prosent (25/34) av svulster hadde betydelige TIA-1 + cellulære infiltrater, som viste en positiv sammenheng med CD8 + infiltrater (r = 0,83, p 0,0001) (figur 2). I motsetning til dette, bare 20% (7/35) av tumorene hadde signifikant granzyme B + cellulære infiltrater (data ikke vist); som forventet, 6 av de 7 positive tumorer var også positivt for CD8 + celler.
Svulster ble også analysert for cellulære infiltrater uttrykker foxp3, en markør for aktiverte T-celler og regulatoriske T-celler [31]. Seksti-seks prosent (23/35) av de evaluerbare svulster hadde signifikant foxp3 + infiltrater (figur 2), som var sterkt korrelert til CD4 + celler (r = 0,73, p 0,0001). Vi evaluerte også uttrykk for CD25, en ekstra markør for aktiverte og regulatoriske T-celler [32]. Femti prosent (17/34) av tumorer hadde signifikant CD25 + cellulære infiltrater (figur 2), som var sterkt korrelert med CD4 + -celler (r = 0,58, p = 0,0003) og foxp3 + -celler (r = 0,75, p 0,0001).
Vi ytterligere stratifisert T-celle-infiltrater i henhold til deres epitelisk eller stromal sted inne i svulsten, som intraepitelial CD3 + /CD8 + T-celler har særlig blitt korrelert med øket overlevelse hos EOC [8] – [12]. For denne analysen, vi først målte tumoren preparat som definert av epithelial:stromal forholdet i hvert vev kjerne og deretter beregnes tettheten av T-celler per enhet av epitel eller stroma. Som oppsummert i tabell 3, tettheten av CD3 + T-celler per enhet av tumor epitel varierte 0-17, med en median på 4,6. Til sammenligning er tettheten av CD3 + T-celler per enhet av tumor stroma varierte 0-138, med en median på 16,3. Generelt er tettheten av CD3 + T-celler i tumoren epitelium og stroma var bare svakt korrelert (r = 0,34, p = 0,048), og det var mange eksempler på tumorer med tett CD3 + infiltrerer i epitelet, men ikke stroma, og omvendt, i stroma men ikke epitel. I likhet med CD3 + celler, CD8 +, CD4 +, foxp3 + og TIA-1 + -celler var generelt denser i tumor stroma enn tumor epitel (tabell 3).
Sammensetning av tumor-infiltrerende lymfocytter etter neoadjuvant kjemoterapi
TMA brukes i ovennevnte analyser inneholdt også en ekstra kohort av 15 svulster fra kvinner som, som ledd i en klinisk studie hadde gjennomgått neoadjuvant platina /taxan-basert kjemoterapi før deres primære kirurgi. Som med 35-case årsklasse, disse kvinnene hadde høyverdig serøs EOC. Svulster hadde blitt resected etter tre sykluser av carboplatinum /taxol-basert kjemoterapi. Selv om størrelsen på utvalget var liten, dette ga en unik mulighet til å evaluere effekten av kjemoterapi på tumor-infiltrerende lymfocytter. Ved de fleste parametre, lymfatisk infiltrater var lik mellom behandlede og ubehandlede tumorer. Men behandlede svulster viste en jevn trend mot økt infiltrasjon av alle undergrupper av T-celler som vurderes, og denne økningen var signifikant høyere for CD3 + (median 80 vs 35, p = 0,02) og CD8 + (median 78 vs 30, p = 0,013) celler (data ikke vist)
Serum autoantistoff svar på NY-ESO-1
Selv om kreftpasienter på eggstokkene demonstrere autoantistoffresponser til et bredt repertoar av antigener [23] – [25]., vi fokusert på en av de mest immunogene antigener, NY-ESO-1 [24], [33], [34]. Seksti kontrollsera ble analysert med hensyn på IgG-autoantistoffer mot rekombinant NY-ESO-1, og middelverdien og standardavviket av OD-verdiene ble beregnet (Utfyllende Tabeller S1 og S2). Individuelle sera ble bedømt som positive hvis deres OD-verdien var lik eller større enn to standardavvik fra middelverdien for kontrollpersoner. I samsvar med publiserte resultater, 26% (9/35) av eggstokkreft tilfeller påvist IgG antistoffer til NY-ESO-1, sammenlignet med bare 5% (3/60) av kontroller (figur 3A).
( A) Serumautoantistoff svar på NY-ESO-en i 35-pasient kohort. Autoantistoffresponser rapporteres som antall standardavvik fra gjennomsnittet av 60 alders- og kjønns matchet kontroller med ingen kjente personlig historie av kreft. (B, C) Immunhistokjemisk analyse av NY-ESO-1 uttrykk i to representative serøs ovarietumorer med høy (B) og negativ (C) uttrykk for antigenet.
For å finne ut om autoantistoffresponser til NY-ESO-1 korrelert med ekspresjonen av det tilsvarende antigen, passet tumorprøver ble analysert ved hjelp av IHC for ekspresjon av NY-ESO-1. Av 34 evaluerbare svulster, fem (14,7%) scoret positive for NY-ESO-1 antigen (Figur 3B). Alle fem av disse tilfellene var også positiv for autoantistoffer mot NY-ESO-1. I kontrast, 4 tilfeller var positive for NY-ESO-1-spesifikk autoantistoffer, men negativt for NY-ESO-1 antigen uttrykk.
Korrelasjon mellom autoantistoffresponser og lymfatisk infiltrerer
Vi neste undersøkt om serum autoantistoffer mot NY-ESO-1 var korrelert med tumor-infiltrerende lymfocytter. For denne analysen, vurderte vi epitelisk og stromal T-celle-infiltrater hver for seg, som beskrevet ovenfor. Vi klassifisert tilfeller som å være positiv eller negativ for autoantistoffer mot NY-ESO-1 ved hjelp av en cut-point av to standardavvik fra gjennomsnittet av kontrollgruppen (Utfyllende Tabeller S1 og S2). Av Mann Whitney t-test, pasienter med autoantistoffer mot NY-ESO-1 hadde en betydelig større stromal tetthet av CD8 + celler (p = 0,011), foxp3 + celler (p = 0,013), og CD4 + celler (p = 0,026). Dermed autoantistoffer mot NY-ESO-1 viste en signifikant korrelasjon til T-celle infiltrater, spesielt i tumor stroma.
Godkjenning av NY-ESO-1 av autoantistoffer og tumor infiltrere CD8 + T-celler fra samme pasient
sammenhengen mellom autoantistoffer mot NY-ESO-1 og tumor-infiltrerende T-celler antydet muligheten for at tumor-infiltrerende T-celler kan gjenkjenne NY-ESO-1 i seropositive pasienter. For å løse dette problemet, samlet vi blod, svulst og ascites prøver fra en prospektiv kohort av 15 nydiagnostiserte serøs EOC pasienter. To pasienter var positive for serum autoantistoffer mot NY-ESO-1. Av disse er det ene tilfellet (IROC013) var HLA-A2 +, slik at T-celler til å være nummerert ved flowcytometri med HLA-A2-pentamerer lastet med en kjent CD8 + epitop fra NY-ESO-1 (figur 4A). NY-ESO-1-spesifikke CD8 + T-celler var sjeldne i perifert blod fra denne pasient (0,22% av CD8 + -celler), men ble anriket i ascites og fast tumor (1,53% og 6,64% av CD8 + -celler, respektivt). Videre T-celler fra ascites og solid tumor produsert IFN-γ svar på NY-ESO-1-peptidet (figur 4B), men ikke kontroll peptider avledet fra p53, HER-2 /
neu
eller WT-1 ( data ikke vist). Faktisk, i ascites responsen på NY-ESO-1 var nesten like sterk som det som sees til de CEF-viral kontroll peptider. Intriguingly, tumorvev fra denne pasient viste tette CD3 + og CD8 + T-celle-infiltrering av tumor stroma men ikke epitelet (figur 4C), likt det mønster som vanligvis ses med autoantistoffpositive pasienter i den retrospektive kohort. Til tross for montering av en sterk humoral og T-celle respons på NY-ESO-1, solid tumor fra denne pasienten farget negativt for ekspresjon av NY-ESO-1-antigen; imidlertid, ascites fra denne pasienten inneholdt NY-ESO-1-positive celler (figur 4C).
(A) MHC klasse I pentamer analyse demonstrere anrikning av NY-ESO-1-spesifikke CD8 + T-celler i ascites og fast tumor sammenlignet med perifert blod. Eske områder og tilhørende tall representerer prosentandelen av pentameren-positive celler i forhold til summen CD8 + celler. (B) ELISPOT analyse av IFN-γ produksjon av T-celler etter stimulering med et HLA-A2-bindende peptid fra NY-ESO-1. Dataene er presentert som antallet av IFN-y-produserende celler per 1 x 10
6 bulk-celler fra de angitte vevsområder. (C) Immunhistokjemisk analyse av tumor-infiltrerende CD3 + og CD8 + T-celler i tumoren stroma, og ekspresjon av NY-ESO-1 antigen. Mens den faste tumoren var negativ for ekspresjon av NY-ESO-1, en fraksjon av celler fra ascites var positive. Den cellulære brøkdel av ascites inneholdt også cytokeratin-positive epitelceller, antagelig av tumor opprinnelse (data ikke vist).
Diskusjoner
Ved hjelp matchet serum og vevsprøver fra 35 pasienter med høyt -grade serøs EOC, har vi vist en korrelasjon mellom tumor-infiltrerende T-celler og tumorspesifikke antistoffer. Så vidt vi vet, er dette den første studien å identifisere en slik sammenheng i enhver menneskelig kreft. Nærmere bestemt nærværet av NY-ESO-1-spesifikke IgG-antistoffer i serum korrelert med infiltrering av tumor stroma av celler som uttrykker CD8, CD4 og foxp3. Videre, i en individuell pasient med autoantistoffer mot NY-ESO-1, tilsvarende ascites og faste tumorprøver ble vist å være anriket for NY-ESO-1-reaktive CD8 + T-celler, som bestemt ved MHC klasse I pentamer beising og IFN-γ ELISPOT. Disse funnene øke muligheten for at autoantistoffresponser kan samarbeide med tumor-infiltrerende T-celler til å påvirke kliniske utfall i EOC.
I tillegg til NY-ESO-1-spesifikke antistoffer, har flere faktorer uttrykt av ovarietumorer vist en positiv korrelasjon med tumor-infiltrerende T-celler, inkludert kjemokiner CXCL9, CCL21, CCL22 [8], CCL2 og CCL5 [35]; p53 mutasjoner [36]; og MHC klasse I [37]. Omvendt, tumor-infiltrerende T-celler viser en negativ korrelasjon med VEGF [8], B7-H1 /PD-L1 [12], CD68 + makrofager [38] og endotelin B-reseptoren [39]. Således flere faktorer påvirke sammensetningen av tumor-infiltrerende T-celler i EOC.
Selv om denne studien fokusert på en enkelt, allment anerkjent tumorantigen, NY-ESO-1, et stort antall andre autoantistoff mål-antigener blitt identifisert i EOC, inkludert HOXA7, Ep-CAM, HSP-90, MUC-1 og p53 [23] – [25]. Faktisk, tumor-spesifikke autoantistoffresponser er vanlig blant EOC pasienter. For eksempel, Stone et al. funnet at 44% av nylig diagnostiserte EOC pasientene hadde en autoantistoffrespons til minst en av et panel av 12 tumorantigener [24]. Fremtidig arbeid vil bestemme om autoantistoffresponser med andre tumorantigener også korrelerer med tilstedeværelse av tumor-infiltrerende T-celler.
I motsetning til serologisk respons, mindre er kjent om målantigener av tumor-infiltrerende T-celler i EOC . T-cellereseptoren (TCR) spectratyping studier har vist at tumor-infiltrerende T-celler i EOC representere oligoklonale populasjoner, som er konsistent med antigen-fremkalt klonal ekspansjon [40] – [44]. Mange studier har vist gjenkjennelse av autologe tumorceller ved tumor-infiltrerende T-celler [45] – [50]. Dessuten har tidligere arbeidet identifisert T-celler spesifikke for HER2 /
neu product: [44], [51] – [53], p53 [54] og folat-bindende protein [55], [56] blant tumor- infiltrerende eller tumorassosierte T-celler. Så vidt vi vet, er den første til å demonstrere anerkjennelse av NY-ESO-1 av tumor-infiltrerende og tumor-assosiert studien (dvs. ascites avledet) T-celler, som dokumentert av resultatene for pasienten IROC013. Forbløffende T-celle responser til NY-ESO-1 var umulig å oppdage i perifert blod fra denne pasienten, som indikerer en sterk berikelse av T-celle subpopulasjon i svulsten og ascites. Faktisk, IFN-y ELISPOT respons på NY-ESO-1 var av liknende størrelse som den som sees med CEF kontroll peptider. Ikke desto mindre, representerte NY-ESO-1-spesifikk subpopulasjon bare 6,6% av tumor-infiltrerende CD8 + -T-celler i dette faget, noe som indikerer det er sannsynlig at mange andre antigener som gjenkjennes av infiltrerende T-celler. Spesielt, over 80% av ovariekreft utviser tap av BRCA1 og /eller BRCA2 funksjon, som fører til svekket DNA-reparasjon [57], [58]. Man kan spekulere at den resulterende genetisk ustabilitet fører til ekspresjon av unormale proteiner som kan tjene som neoantigener til vertens immunsystem.
Selv om tumor infiltrerende T-celler er assosiert med forlenget progresjon-fri og total overlevelse i EOC, det er fortsatt uklart om dette gjenspeiler en aktiv eller passiv rolle av T-celler. Med andre ord, har T-celler som aktivt motarbeide tumorvekst, eller de er ganske enkelt markører for noen annen funksjon av tumoren som driver resultater? Det er flere linjer med bevis til støtte for den tidligere muligheten. Først er ikke alle T-celle undergrupper forbundet med prognose; snarere er gode resultater knyttet til CD8 + delsettet og dårlige resultater for CD25 + foxp3 + undergruppe [11], [12], [20], [21]. For det andre, er det flere faktorer som er knyttet til aktive CD8 + cytolytiske respons også knyttet til gode resultater, inkludert ekspresjon av IFN-γ [14], [15], IFN-γ reseptor [16] og IL-18 [17]. MHC klasse I har også vært knyttet til økt overlevelse i ovariekreft [18], [19]. I denne studien, som fokuserte utelukkende på serøs subtype, alle evaluerbare svulster uttrykte MHC klasse I. Lignende resultater har blitt rapportert av andre for serøs EOC [59], noe som tyder på det store flertallet av serøse svulster er MHC klasse I positive og har kapasitet til å presentere antigen for å tumor-infiltrerende CD8 + T-celler. Tredje, tumor-infiltrerende T-celler viser betydelig cytotoksisitet mot ovarietumorer
in vitro product: [43], [45], [47], [60], [61]. Det er imidlertid verdt å merke seg at bare et mindretall av svulster i denne og en annen studie [59] hadde betydelige granzyme B-positive immun infiltrater, noe som tyder på at cytotoksiske funksjon kan undertrykkes
in vivo
. Og til slutt, som diskutert ovenfor, tumor-infiltrerende T-celler som viste tegn på klonal ekspansjon [40] – [44] og gjenkjennelse av spesifikke antigener [44], [51] – [56], som er vist her for NY-ESO-1 (figur 4). Dermed er bevis akkumuleres i favør av konseptet at tumor-infiltrerende T-celler spiller en aktiv rolle i å fremme gode kliniske resultater i EOC. Tilsvarende, i kolorektal kreft, er funksjonelle markører assosiert med aktiv Th1-lignende cytolytiske T-celle-responser forbundet med gunstige kliniske resultater [62]. Dette tyder på at immunmodulerende strategier som forbedrer disse naturlig forekommende T-celleresponser kan bedre kliniske resultater ytterligere.
I motsetning til T-celle infiltrater, forholdet mellom tumorspesifikke antistoffer og klinisk utfall er mindre klar. Dette problemet har blitt studert mest omfattende for svulst antigen p53, som utløser autoantistoffrespons hos 20-25% av EOC pasientene. Goodell et. al. rapportert en positiv sammenheng mellom autoantistoffer mot p53 og økt total overlevelse i EOC [63]. Imidlertid har andre studier funnet en negativ korrelasjon [64], [65] eller ingen sammenheng [66], [67]. Som for NY-ESO-1, fant vi en trend mot dårlige resultater blant pasienter med autoantistoffer mot NY-ESO-en i 35-case kohort studert her (data ikke vist), men denne trenden ble ikke sett i en uavhengig kohort av 35 pasienter fra en tidligere studie [24] (data ikke vist). Som omtalt ovenfor, immunresponsen til EOC involverer flere antigener, derfor tror vi at den prognostiske betydningen av autoantistoffer er best håndteres ved hjelp av en utvidet panel av tumorantigener og større pasient kohorter.
Den autoantistoff reaksjon på NY-ESO -1 korrelert til T-celle-infiltrasjon av tumor stroma i motsetning til tumor epitel. Dette kan reflektere en statistisk problem, som det absolutte antall av T-celler var høyere hos tumor stroma sammenlignet med epitel, slik at stromale verdier for å oppnå statistisk signifikans. Faktisk Spearman rank korrelasjonsanalyse viste en positiv sammenheng mellom autoantistoffer mot NY-ESO-1 og infiltrasjon av tumor epitel av CD3 + og CD8 + celler, men dette var ikke statistisk signifikans (data ikke vist). Alternativt kan det være et biologisk forklaring. I Th1 /Th2 paradigmet, blir immunresponser tenkt å polar mot humorale eller cytolytiske effektor mekanismene [68]. Anvendt til våre resultater, vil dette antyder at pasienter med sterke autoantistoffresponser ville ha svake cytolytiske respons, noe som kan resultere i ufullstendig (dvs. stromal) infiltrasjon av tumorvev ved T-celler. En annen mulighet er foreslått av murine modeller hvor autoantistoffresponser har vært knyttet til svak CD8 + cytolytiske T-celle-responser [69]. I dette tilfelle ble det foreslått at autoantistoffer til rette for opptak og presentasjon av tumorantigener av B-cellene på bekostning av dendrittiske celler. Ettersom B-celler er mindre potente antigenpresenterende celler enn dendrittiske celler, er nettoresultatet en mindreverdig T-cellerespons mot tumoren [69]. En endelig betraktning er at i den foreliggende undersøkelse, autoantistoffresponser på NY-ESO-1 ble korrelert med infiltrering av tumoren ved ikke bare CD8 + -T-celler, men også av CD4 + og foxp3 + T-celler. De sistnevnte celler kan representere regulatoriske T-celler, noe som kan hemme cytolytiske T-celler responser og begrense graden av tumorinfiltrasjon [32]. Vi er for tiden å samle matchet blod og vevsprøver fra en større prospektiv kohort av EOC pasienter for å bedre forstå forholdet mellom tumorspesifikke autoantistoffer, tumor-infiltrerende T-celler og kliniske resultater.
Selv om det ikke er hovedfokuset på dette papiret, hadde vi muligheten til å vurdere effekten av neoadjuvant kjemoterapi på tumor-infiltrerende T-celler i 15 pasienter. Generelt behandlede tumorer viste økt infiltrasjon av alle undergrupper av T-celler, og dette var statistisk signifikant for CD3 + og CD8 + celler. Dette minner om studier ved brystkreft som viste økt T-celle infiltrasjon etter kjemoterapi med taxaner [70] og andre agenter [71] og en forening med gunstige kliniske respons. Taxaner kan også fremme svulst immunitet ved å styrke T og NK celle aktivitet [72] – [75] og antigen presentasjon [76]. Likeledes kan platinaderivater forbedre cytokinsyntese av humane T-celler [77], oppheve suppressor-T-celleaktivitet [78] og sensibilisere EOC celler til Fas-mediert apoptose [79]. Dermed kan platina /taxan-basert kjemoterapi har gunstige effekter på verten immunitet mot EOC, en hypotese vi undersøker i en prospektiv pasient kohort.
Flere grupper har forsøkt adoptiv immunterapi av kreft i eggstokkene ved hjelp av T-celler utvidet fra tumor-infiltrerende T-celler [50], [80] – [89]. Selv lovende anekdotiske reaksjoner er rapportert, har dette arbeidet vanligvis møtt med begrenset suksess. Det er bemerkelsesverdig at fast tumorvevet fra pasient IROC013 var i stor grad negativ for ekspresjon av NY-ESO-1, til tross for at NY-ESO-1-spesifikke T-celler i tumoren og ascites. Hvis dette scenariet er representative for andre EOC pasienter, vil det tyde på at mange tumor-infiltrerende T-celler som gjenkjenner antigener som er dårlig uttrykt ved tumorvevet, muligens på grunn av immun utvalg i løpet av tumorutvikling. Hvis vi skal realisere løftet om immunterapi for EOC, det er et stort behov for å identifisere mål antigener som er avgjørende for vekst og overlevelse av tilbakevendende, kjemoterapi-resistente svulster. Våre resultater tyder på at autoantistoffresponser holde praktisk verdi for antigen identifisering og garanterer videre studier i forhold til sin rolle i verts svulst immunitet og kliniske resultater.
Materialer og Metoder
forsøkspersonene
Alle prøver og kliniske data ble oppnådd med informert samtykke i henhold til protokoller godkjent av Forskningsetisk styret i BC Cancer Agency og University of British Columbia. Den retrospektive tilfellet kohorten besto av 35 kvinner med høy grad av serøs eggstokkreft fra hvem matchet serum og svulstvev var tilgjengelig (OvCaRe Ovarian tumor Bank, Vancouver, BC, Canada). Tumorvev ble oppnådd ved tidspunktet for primær kirurgi før noen annen behandling. Tabell 1 viser de generelle kliniske karakteristika for 35-sak kohort. Den retrospektive kohort også inkludert vev fra ytterligere 15 kvinner som fikk neoadjuvant kjemoterapi før primær kirurgi; disse sakene diskuteres separat i resultater. Blod, ascites og tumorprøver ble også samlet inn fra en prospektiv kohort av 15 pasienter gjennom BC Cancer Agency Tumor Tissue Repository. Kontrollserumprøver ble tatt fra 60 kvinner med ingen kjente personlig historie med eggstokkreft eller andre kreftformer. Alle kontrollpersoner selvrapportert mottar et negativt mammografisk resultat i det siste året. Aldersfordelingen av kontrollgruppen (gjennomsnitt 62,0 år, standardavvik 12,3 år, range 45,9 til 88,9 år) ble lik som saken kohorten.
svulsten og serumprøver
Retrospektiv kohort .
svulstvev ble oppnådd under primær cytoreduserende kirurgi. Vev hadde en iskemi tid på mindre enn 30 minutter, og brukt mindre enn 48 timer i formalin før den ble behandlet i parafin. En vev microarray (TMA) ble konstruert ved å ta dupliserte 0,6 mm kjerner fra tumorvev etter gjennomgang av hematoxylin- og eosin-farget deler av en patolog. Kjerner ble valgt ut fra områder av svulsten med representative andeler av epitel og stroma, og samtidig unngå svært nekrotiske områder. TMA ble satt sammen ved hjelp av en patologi Devices vev arrayer (Westminster, MD). Serumprøver fra saker ble samlet inn før kirurgi eller kjemoterapi. Blodprøver ble behandlet ved hjelp av standard laboratoriefremgangsmåter.
prospektiv.
Blod ble samlet før kirurgi i heparanized Vacutainer-rør, og perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert ved hjelp av Ficoll tetthetssentrifugering. HLA-A2 status ble bestemt ved flowcytometri på en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, California) etter overflatefarging PBMC med anti-HLA-A2-antistoff (klone BB7.2, BD Pharmingen, San Diego, California). Ascites innsamlet under operasjonen ble sentrifugert (1200 rpm i 10 min), og røde blodceller (RBC) ble fjernet ved behandling med ACK lyseringsbuffer (Sigma, St. Louis, MO). Solid svulst fjernet under operasjonen var oppmalt med skalp til ca. 2 mm
2, og ble deretter fordøyd over natten ved 4 ° C i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende kollagenase type I og IV (hver på 0,05 mg /ml) , 0,025 mg /ml hyaluronidase og 0,01 mg /ml DNAse I (alle fra Sigma, St. Louis, MO). Etter fordøyelse, ble materialet ført gjennom en 100 pm sterilt celle sil for å fjerne klumper, og den resulterende enkeltcellesuspensjon ble pelletert som beskrevet ovenfor.
Immunhistokjemi og immunocytokjemi
TMA ble seksjonert ved 5 mikrometer på Superfrost pluss lysbilder (Fisher Scientific, Ottawa, ON) og inkubert over natten ved 37 ° C. Etter deparaffinization, ble platene plassert i en Ventana Discovery XT Autostainer (Ventana, Tucson, AZ) for immunhistokjemisk farging. Ventana standard CC1 protokoll ble benyttet for antigen gjenfinning. Primære antistoffer er oppført i tabell 2.
TMA ble inkubert med primære antistoffer i 60 minutter, og den aktuelle kryss-adsorbert, biotinylert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) ble søkt om 32 minutter.
