Abstract
Sperm protein (SP17) er et attraktivt mål for eggstokkreft (OC) vaksiner på grunn av sin over-uttrykk i grunnskolen samt i metastatiske lesjoner, i alle faser av sykdommen. Våre studier tyder på at en SP17 basert vaksine kan indusere en varig vern mot OC utvikling i C57BL /6 mus med ID8 celler, etter profylaktiske og terapeutiske behandlinger. Dette er første gang det ble vist en mus motstykke av en kreft testikkel antigen (SP17) som skal uttrykkes i en OC musemodell, og at vaksinering mot dette antigenet vesentlig kontrollert tumorvekst. Vår studie viser at CpG-adjuvated SP17 vaksine seirer utstedelse av immunologisk toleranse, den største hindring for utvikling av effektive immunterapi for OC. Videre tilveiebringer denne studien en bedre forståelse av biologien OC ved å vise at Th-celler 17 aktivering og tids immunsuppressiv T-reg-celler inhibering er nødvendig for vaksineeffektivitet. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at profylaktiske og terapeutiske vaksiner kan indusere langvarig beskyttelse mot OC og forsinkelse tumorvekst, noe som tyder på at denne strategien kan gi ytterligere behandlinger av menneskelig OC og forebygging av sykdomsutbruddet hos kvinner med en familie historie av OC.
Citation: Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. (2010) Kreft testikler Antigen Vaksinasjon gir god og langvarig beskyttelse i en murine modell av eggstokkreft. PLoS ONE fem (5): e10471. doi: 10,1371 /journal.pone.0010471
Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children forskningsfond, USA
mottatt: 21 februar 2010; Godkjent: 12 april 2010; Publisert: 12. mai 2010
Copyright: © 2010 Chiriva-Internati et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Billy og Ruby Strøm Endowment for kreftforskning og Laura W. Bush institutt for kvinners helse og Senter for kvinnehelse og kjønnsbasert medisin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OC) er den sjette vanligste kreftformen og den syvende største årsaken til kreftdød blant kvinner [1], [2]. Blant OC, er 90% av tilfellene representert ved epitelial eggstokkreft (EOC), som oppstår fra Epitel fôr, ovarial overflaten eller fra inklusjons cyster [3], [4]. Dødeligheten av OC stammer fra den manglende evne til å påvise sykdommen på et tidlig organ-begrenset trinnet og fra mangelen på effektive behandlinger for avansert stadium sykdommen [4]. Den avdøde diagnose og den høye frekvensen av resistens mot kjemoterapi begrense behandlingstilbud tilgjengelig. OC pasienter med en familie historie av OC står for 10% av alle tilfeller [5]. Kliniske alternativer for disse pasientene er kirurgisk inngrep som fører til infertilitet, eller chemoprevention med p-piller, ofte forbundet med alvorlige bivirkninger [6], [7]. Immunterapi strategier, inkludert kreftvaksiner vurderes som mindre giftig og mer spesifikk enn dagens behandling [8], og derfor har potensial til å gi fordeler for OC pasienter med tydelig sykdom og for høy risiko OC pasienter. På grunn av deres spesifisitet av handlingen, potent og varige effekter og anvendbarhet til nesten enhver type svulst, er anti-kreftvaksiner driver interesse av kliniske onkologer. Et viktig skritt i utviklingen av grunnleggende kreftvaksiner er gjennomføring av vaksinasjonsstrategier slik at for konsekvent induksjon av immunresponser mot tumorantigener. I dette henseende, er valget av egnede antigener, basert på både frekvens og spesifisitet av deres ekspresjon i kreftvev, av største betydning. Kreft /testis antigener (CTA) [9], [10], [11], [12], som inkluderer SP17 antigen [9], [13], [14], [15], [16], dukker som lovende kandidater for spesifikke immunterapeutiske mål. CTA representerer en underklasse av tumor-assosierte antigener (TAA) som er ikke-muterte selv antigener uttrykt eller overuttrykt i tumorer, og er anerkjent av CD8 T-celler [12], [14], [17], [18], [19], [20]. Den immunogene SP17-protein har blitt grundig karakterisert v [10], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Menneskelig SP17 er svært konservert, med 70% homologi med kanin og mus, og 97% homologi med bavian [25]. SP17 har en molekylvekt på 17,4 kDa, kodes for av et gen lokalisert på kromosom 11, og blir avvikende uttrykt i kreftformer av urelaterte histologisk opprinnelse [25], inkludert multippel myelom (MM) og OC [21], [22]. SP17-spesifikke CTL, generert fra normale donorer, MM og OC-pasienter, har vist seg å drepe HLA-tilpasset tumorcellelinjer og friske tumorceller som presenterer SP17 epitoper bundet til HLA klasse I-molekyler [13], [14], [21] . Disse observasjoner støtter nylige studier antyder at SP17 kan være et egnet antigen for immunterapi i OC [13], [25]. Rekombinante proteiner er vanligvis brukes i utviklingen av antivirale vaksiner, og kan utgjøre attraktive kandidat antitumorvaksiner [11], [26], [27], [28], [29]. Profesjonell antigen-presenterende celler (APC) detektere patogener gjennom en rekke reseptorer så som de Toll-lignende reseptorer (TLR), som gjenkjenner patogen-assosiert molekylære mønster, inkludert CpG-oligodeoksynukleotider (CpG ODN) som er definert med flankerende sekvenser [27], [ ,,,0],29], [30], [31]. CpG-motiver, som ofte uttrykkes i bakteriegenomet men genomisk trykt i virveldyr, anses som fremmed av immunsystemet og, som et resultat, stimulere vertsforsvarsmekanismer [11], [27], [29], [32], [33], [34]. CpG-ODN oppviser et stort potensiale i terapeutisk behandling av kreft på grunn av deres evne til å aktivere medfødt og adaptiv immunitet [15], [26], [27], [28]. Den TLR9-bindende CpG induserer sekresjon av Th1- cytokiner, inkludert IFN-γ og TNFa, og produksjon av antigen-spesifikk IgG2a ved B-celler [11], [12], [32], [33], [34]. I denne studien, vurderte vi det forebyggende og terapeutisk immunrespons utløses ved gjentatt vaksinering med SP17 rekombinant protein administreres med CpG. Vi brukte den murine ID8 OC-cellelinjen, avledet fra en spontan
in vitro
malign transformasjon av C57BL /6 mus ovarie overflate epitelceller å indusere tumorvekst hos mus [34]. Våre resultater viser for første gang at grunning med SP17 protein og CpG er en effektiv strategi for å indusere varig OC terapi.
Resultater Karakterisering av SP17 og MHC-I uttrykk i ID8 celler
SP17 mRNA (Figur 1a) og SP17-protein (figur 1b) ble påvist i ID8 cellelinje. Ytterligere karakterisering av immunocytokjemi (ICC) og immunfluorescens (IF) viste cytoplasma og overflate farging av disse cellene (Figur 1c). Den cytospin av ID8 permeabilisert (P) celler utviser en positiv, cytoplasmatisk farge for SP17, som ble bekreftet ved IF. I tillegg er ikke permeabilized (NP) celler viser også klart uttrykk gjennom IF (figur 1c, lavere kvadranter) men mindre av ICC (figur 1c, øvre kvadranter). Vi videre analysert SP17 overflate uttrykk gjennom flow-cytometri analyse som viste høy frekvens av SP17 positive celler (figur 1d). Tilsvarende flowcytometri analyse viste at 60% av ID8 celler farget positivt for MHC-I i henhold til basaldyrkningsbetingelser, mens tilsetning av 100 IU /ml IFN-γ i 72 timer resulterte i 98% MHC-I-positive celler.
SP17 mRNA i muse-ID8 tumorceller og i mus testikkel (positiv kontroll). MRNA-nivåene ble analysert ved hjelp av RT-PCR for SP17 ekspresjon. Et cellehusholdningsgenet, B-aktin, ble inkludert som en kontroll. En PCR-bare kontroll (ingen RT trinn) ikke klarte å generere et produkt, noe som indikerer at det var ingen DNA-kontaminering i prøvene. I tillegg til RT-PCR (se figur 1A), ble Western blot utført, og figur 1b viser ekspresjonen av SP17 på proteinnivået. Den ID8 cellelinjen ble videre karakterisert ved en immunocytokjemi (ICC) og immunfluorescens (IF). Denne figuren viser en cytospin av ID8 cellene permeabilisert (P) og en positiv farging for SP17 i cytoplasmaet nivå. I tillegg ble SP17 bekreftet ved IF i cytoplasma. I tillegg, i figur 1c, non permeabilized (NP) celler viser klart uttrykk via IF og mindre av ICC. Panel d viser ID8 karakterisering for overflate uttrykk av SP17 og MHC-I; Isot. ctrl, isotypisk kontroll antistoff; prosent indikere positive-flekker celler. MHC-I uttrykk ble evaluert med eller uten IFN-g stimulering.
In vivo
vekst av ID8 celler etter intraperitoneal injeksjon
Fire forskjellige doser av ID8 celler (10
5, 5 x 10
5, 10
6 og 2 x 10
6) ble injisert inn i fire grupper av mus (fem pr gruppe) for å bestemme den optimale dose for induksjon av tumor /ascites formasjon. Hvert sett av eksperimentelle vaksiner med forskjellige doser av ID8-celler ble utført minst tre ganger. Dyr fra hver svulst titrering gruppe ble avlivet på forskjellige tidspunkter, der en post mortem undersøkelse ble utført på hele dyr og dissekerte organer (ikke vist). Optimal tumorvekst (basert på tid og dimensjon) ble observert med en av de 4 forhold (2 × 10
6 ID8 celler) ble testet. Figur 2a viser at en i.p. injeksjon av 10
5 ID8 celler generert en tumorvekst etter 120 dager, mens 5 × 10
5 ID8 celler generert en svulst masse /ascites i 90 dager (figur 2b). En dose på 106 celler viste en betydelig tumormasse /ascites vekst etter rundt 60 dager (figur 2c), og når 2 × 106 ID8 celler ble injisert, ble de optimale tumormasse /ascites oppnådd i 40 til 45 dager (figur 2d), og de fleste dødsfallene skjedde mellom 50-65 dager, enten på grunn av tumormassen eller offer for å unngå overdreven ubehag for mus. Figur 3a viser en mus injisert med den optimale dose (2 x 10
6) av ID8 celler for å generere tumormasse /ascites (44 mm bredde) på mindre enn 45 dager, og en kontrollgruppe mus (20 mm bredde) som ikke ble injisert med ID8 celler. Figur 3b viser generering av ascites fra en ip injeksjon av 2 × 10
6 ID8 celler i mindre enn 40 dager, og viser også en detaljert visning av bukhulen med musen etter å aspirere 22 ml ascites, avslører flere metastatisk noder og tumormasser. Videre, figur 3 bekrefter at cellene i peritoneum fra mus injisert med ID8 celler uttrykker SP17 ved immunhistokjemi (IHC), mens celler fra en mus uten tumor-injeksjon var negative for SP17 (figurene 3E, f og g). Disse resultater viser at SP17 er uttrykt i ID8 cellelinje,
in vivo
. For å bekrefte tumormassen /ascites stammer fra ID8 cellene, ble prøver av peritoneal, tumormasse /noder, lunge, lever, ascites, milt og eggstokker undersøkt ved hjelp av RT-PCR. Resultatene er vist i figur 3d, (representativt bilde av 5 mus pr forsøket, gjentatt i triplikat) for ID8-injiserte mus (figur 3d-1) og kontrollmus (figur 3d-2). Videre ble en fluorescens-basert lokaliseringsanalyse utført for å påvise GFP-positive ID8 celler
in vivo
, og bekreftet peritoneal lokalisering av ID8 celler (figur 3 timer).
Viser progressive dannelsen av ascites /svulster når ip injisert med ID8 celler. ID8 injisert mus er vist som m1-M5. Kontroll mus ble injisert med PBS alene. 1a viser mus injisert med 10
5 ID8 celler. Svulstene ikke nådde en betydelig størrelse før etter 150 dager. 2b viser progressive dannelsen av ascites /svulster når i.p. injisert med 5 × 10
5 ID8 celler. Tumorene nådde ikke en betydelig størrelse før etter 120 dager. 2c viser progressive dannelsen av ascites /svulster når i.p. injisert med 10
6 ID8 celler. Svulstene nådd en betydelig størrelse på 90-120 dager. 2d viser progressive dannelsen av ascites /svulster når i.p. injisert med 2 × 10
6 ID8 celler. Svulstene nådd en betydelig størrelse i 35-60 dager (p 0,0001); et synlig utvidelse av musene ble lagt merke til på 30 dager.
et show på venstre side en kontroll mus (bredde av mus 20 mm) ikke injisert med ID8 celler og på høyre side en mus injisert med 2 × 106 ID8 celler etter 40 dager (bredde av mus 44 mm). Disse musene representerer forsøk med lignende resultater. b viser hele bukhulen av ascites indusert fra en ip injeksjon av 2 × 106 ID8 i 40 dager (til venstre) og en åpen visning av hulrommet med flere metastatisk noder og tumormasser (midtre og høyre, etter å aspirere 22 ml ascites) . c viser en bukhule negativ for SP17 fra en kontroll mus ikke injisert med ID8 celler. f viser en positiv uttrykk for SP17 på peritoneum av en mus injisert med 2 × 106 ID8 celle etter 40 dager. Testikkel er den positive kontrollen for SP17 av ICH (g). Figur d viser PCR for SP17 DNA (og B-aktin kontroll): et vev panel avledet fra (1) organer av en 2 x 106 ID8 injiserte mus var positiv for SP17 og et panel av vev avledet fra organer hos en frisk mus avslørte ikke uttrykk for SP17. Positive kontroller (ID8 og testis) for SP17 er også vist. Panel h viser in vivo fluorescens bilder av en kontroll (til venstre) og ID8-injisert (høyre) mus for lokalisering av GFP-positive ID8 celler.
Immunisering regimer og måling av tumorvekst
musene ble vaksinert med ulike formuleringer: SP17 bare; CpG bare; og SP17 + CpG, samtidig. Totalt 22 mus ble immunisert med hvert vaksinepreparat. Musene ble immunisert intramuskulært (i.m) med 50 ug av SP17-protein og 20 ug CpG ved forskjellige tidspunkter som beskrevet ovenfor. Evaluering av tumorvekst og /eller ascites ble overvåket hver tredje uke ved hjelp av ingeniør calipers. Overlevelse ble fulgt til svulster nådd volum på mer enn 1000 mm
3, i samsvar med våre Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer.
Evaluering av overlevelse etter profylaktiske og terapeutiske SP17 /CpG vaksinasjoner
Tumorceller celler~~POS=HEADCOMP ble injisert 30 dager etter 3
rd vaksinering av profylaktisk regime, eller 21 dager før den første terapeutisk vaksinering. Alt SP17 + CpG vaksinerte mus (100%) var tumorfrie 91 dager etter tumorinjeksjon med ID8-celler (2 x 10
6), mens ingen av de vaksinerte dyr (ID8 only) var i live. Figur 4a viser overlevelse av mus som fikk profylaktiske vaksiner: 12,5% av SP17 + CpG vaksinert musene små tumormasser og ascites etter 91 dager og døde 180 dager etter med tung belastning svulster. Videre 8% av de vaksinerte musene utviklet svulster og ascites, og døde etter 200 dager. Imidlertid er disse tumorer var betydelig mindre enn de ovarietumorer av kontrollmusene som ble vaksinert med PBS bare. Den totale overlevelsen av SP17 + CpG vaksinert mus var 79% i over 300 dager. Analyse utført av en Log-rank (Mantel-Cox) Test viste at de totale overlevelseskurver var statistisk signifikant (p 0,0001) for gruppen vaksinert med SP17 + CpG sammenlignet med de andre vaksine titreringer. Figur 4b viser overlevelse av mus som fikk terapeutiske vaksiner. Mindre enn 11% av SP17 + CpG vaksinert musene små tumormasser og ascites etter 150 dager, og døde etter 210 dager med tung belastning svulster. Videre, mindre enn 10% av de vaksinerte mus utviklet svulster og ascites, og døde etter 280 dager. Den totale overlevelsen av SP17 + CpG vaksinert mus var 80% for over 300 dager. Analysene ble utført av en Log-rank (Mantel-Cox) Test og viste at de totale overlevelseskurver var statistisk signifikant (p 0,0001) for gruppen vaksinert med SP17 + CpG sammenlignet med de andre vaksine titreringer. Til slutt, kontrollgrupper vaksinert med SP17 alene og CpG alene viste noen eller ingen beskyttelse, det var ikke statistisk signifikant (figur 4a og 4b).
Generell overlevelse av mus fra de fire profylakse (a) eller terapeutiske (b ) gruppene, er beskrevet i teksten (svulsten gratis, SP17 + CpG vaksinert, uvaksinerte, SP17 eller CpG vaksinert). Tumor-bærende mus var i.p. injisert med 10
6 ID8 celler for både forebyggende og terapeutiske regimer. Tumorceller ble injisert 30 dager etter 3
rd vaksinering av profylaktisk regime, eller 21 dager før den første terapeutisk vaksinering. I det terapeutiske gruppe, den midlere forskjellen i vekt mellom tumor-utfordret og tumorfrie dyr var 10 gram ved begynnelsen av vaksinasjonsregimet. Horisontale aksen viser tiden uttrykt dager fra behandlingsstart. Log-rank test indikerte statistisk signifikant forskjell mellom uvaksinert og SP17 + CpG vaksinert mot uvaksinerte eller CpG behandlede gruppen (p 0,0001). For begge regimene
Måling av SP17-spesifikke antistoffresponser og cytokin uttrykk av ELISA-analyse
Analyse av SP17-spesifikke antistoffrespons genereres i den vaksinerte mus er vist i figur 5. den representative ELISA-analysen ble utført for å analysere immunresponsen fra 3 forskjellige vaksinepreparater: SP17 + CpG; CpG bare; og bare SP17. Påfølgende vaksinasjoner økt spesifikke anti-SP17 antistoffresponser sammenlignet med første vaksinasjon. I figur 5b, viste vi en høy mengde av spesifikke anti-SP17 antistoffer fra både SP17 formuleringer på 3
rd vaksinasjon. Vi har undersøkt den gjentatte vaksinasjonsprogram fordi, i et klinisk miljø, er pasienter som er i remisjon ofte fortsatte å bli vaksinert slik at det ikke er noen tilbakefall av tumor. Imidlertid var det en liten nedgang av mengden av immunresponsen sammenlignet med den 3
rd vaksinering analyser i alle tre formuleringene ved 9
th vaksinasjon (figur 5c), men anti-SP17 IgG-nivåer i SP17 + CpG vaksinerte gruppe var fremdeles statistisk høyere sammenlignet med de andre vaksineformuleringer (p 0,001). I det terapeutiske regimet gruppe, SP17 + CpG vaksinerte mus viste en signifikant høyere (p 0,01) produksjon av IgG anti-SP17 etter 270 dager, sammenlignet med mus behandlet med de andre formuleringer (figur 5d). I figur 6 viste vi uttrykket av cytokiner ved dag 270 (ved 9
th vaksinering) i både profylaktisk (6a) og terapeutiske (6b) regimer. Serum ble samlet opp og analysert ved hjelp av ELISA-analyse (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF) fra mus vaksinert med SP17 + CpG og sammenlignet med serum fra mus vaksinert med SP17 alene, CpG alene eller PBS alene. Interessant nok IFN-γ fra SP17 + CpG vaksinert mus ble økt med nesten to folder sammenlignet med de SP17 vaksinerte dyr eller rundt tre folder, sammenlignet med CpG vaksinerte dyr (figur 6a og b). Ved profylaktisk vaksinerte mus, ble TNF-α fra SP17 + CpG formuleringen øket mer enn tre folder, sammenlignet med den CpG vaksinerte mus og bare to folder sammenlignet med SP17 vaksinerte mus (figur 6a). trinn på GM-CSF var tre folder høyere enn CpG vaksinerte mus og mindre enn to folder høyere versus SP17 vaksinerte mus (figur 6a). I terapeutisk vaksinerte dyr, TNF-a fra SP17 + CpG formuleringen ble øket to folder i forhold til CpG og med SP17 alene formuleringer (figur 6b). GM-CSF vist to ganger, og mer enn en ganger økning sammenlignet med CpG og SP17 formuleringer alene, respektivt (figur 6b). Vedrørende de andre cytokiner, var det ingen signifikant ekspresjon av IL-2, IL-4, IL-5 og IL-10 (se figur 6a og b).
Serum fra mus som har gjennomgått forskjellige behandlinger ble samlet opp og analysert ved hjelp ELISA for nivået av sirkulerende anti-IgG SP17. X-aksen viser seriefortynninger av serum. a, b og c viser resultater oppnådd i de forebyggende vaksinering ordningene, mens d viser responsen hos mus fra terapeutisk regime. På dag 7 (a) immunresponsen var lav for SP17. På dag 97 (b), immunresponsen var høyere enn på dag 7. På dag 270 (c), responsen for SP17 var litt mindre enn på dag 97.
På dagen 300, serum ble oppsamlet og analysert ved ELISA for måling av de indikerte cytokinnivåer i profylaktisk (a) eller terapeutisk (b) vaksinerte mus. For begge regimer, IFN-gamma, TNF-alfa og GM-CSF-statistisk signifikante økninger ble detektert bare i SP17 + CpG vaksinerte mus, sammenlignet med kontroller (PBS). Ingen signifikante forskjeller ble påvist for IL-2, IL-4, IL-5 eller IL-10 nivåer.
Evaluering av CTL antitumor responser
I figur 7a, ELISPOT IFN -γ analyse ble utført på dag 270 (9
th vaksinering) ved anvendelse av miltceller av SP17 + CpG profylaktisk immuniserte mus. Strategien med gjentatte vaksiner i denne dyremodell er å reflektere dagens kliniske studier. Disse resultater antyder at frekvensen av SP17-spesifikk CTL økning i den optimale gruppen (SP17 + CpG vaksinerte mus) og viste 220 ± 30 positive flekker i miltcellene versus SP17 vaksinerte (184 ± 18) og sammenlignet med de CpG-vaksinerte mus det var så lite som 9 ± 2. I figur 7b, ble ELISPOT-TNF-α-analyse utført på dag 270 (9
th vaksinering av profylaktisk plan) under anvendelse av miltceller av SP17 + CpG-immuniserte mus (som var den beste formulering for en sterk immunrespons). Disse resultater antyder at frekvensen av SP17-spesifikk CTL økning i den optimale gruppen (SP17 + CpG vaksinerte mus), som viser 240 ± 35 positive flekker i miltcellene i forhold til SP17 vaksinert eneste (200 ± 31) og i forhold til CpG vaksinerte mus som var så lav som 12 ± 2. Analogt, i det terapeutiske vaksinasjonsregimet, hyppigheten av SP17-spesifikk CTL økte i SP17 + CpG gruppe med 259 ± 20 IFN-γ og 159 ± 30 TNF-a-positive flekker, versus 100 ± 20 IFN-γ og 70 ± 10 TNF-a positive flekker i SP17 og CpG bare formuleringer, henholdsvis (figur 6c og D). Disse resultatene samlet foreslå en høy og spesifikk immunreaksjon utløst av SP17 når det gis samtidig med CpG, uavhengig av den vedtatte vaksinasjonsprogram for cytotoksisitet analysen av
51 Cr-release måling, splenocytes var samlet på tidspunktet for en
st, 3
rd og 9
th vaksiner fra SP17 vaksinerte mus, CpG vaksinert mus, og SP17 + CpG vaksinert mus. CTL analysen viste sterkere CTL-responser i SP17 + CpG vaksinerte mus sammenlignet med mus immunisert med SP17 eller CpG bare, både i profylaktisk (figur 8) og terapeutisk (figur 9) regimer. Fordi i normale ID8 kulturbetingelser
in vitro
, det er en lav ekspresjon av MHC klasse I-molekyler ID8-celler ble behandlet
in vitro
med IFNy (100 IU /ml i 72 timer) for å indusere høyere uttrykk nivåer, som tidligere rapportert (figur 1D, nedre panel). ID8-celler aktivert med IFN-γ ble anvendt som bedre mål for cytotoksisitet analysen.
På dag 270 (9
th vaksine) splenocytter fra forskjellige formuleringer av de vaksinerte mus og kontroller ble samlet og analysert ved hjelp av ELISPOT analyse. a, b) frekvens av IFN-gamma og TNF-alfa-positive celler i profylaktiske vaksiner; c, d) frekvens av IFN-gamma og TNF-alfa-positive celler i terapeutiske vaksiner. Disse resultatene er presentert som spotdannende celler per 10
6 splenocytes. Spot tall representerer gjennomsnittet av ti mus i hver vaksinert gruppe; barer, SE.
Splenocytter fra tre forskjellige formuleringer av profylaktisk vaksinerte mus og kontroller ble samlet og analysert ved hjelp av
51Chromium frigivelse assay på dagene 7 (første vaksine), 97 (tredje vaksine) og 270 (niende vaksine), ved hjelp av splenocytter som effektorceller og ID8 som målceller. Disse resultater ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. X-aksen viser effektor: target forholdstall
Splenocytter fra de tre ulike formuleringer av terapeutisk vaksinerte mus og kontroller ble samlet og analysert ved
51Chromium-release assay.. Disse resultatene viser tre uavhengige eksperimenter etter tredje vaksine (dag 97) og niende vaksine (dag 270), ved bruk av splenocytter som effektorceller og ID8 som målceller. X-aksen viser effektor. Target forhold
Evaluering av Th-17 og T-reg celle frekvens
Figur 10 viser frekvensen av Th-17 eller T-reg celler i SP17 + CpG vaksinert eller styre mus splenocytes, samlet på ulike tidspunkter (ingen svulst: dag 0; ID8 bare: dag 45; profylaktisk og terapeutisk dag 270).
splenocytter fra mus som fikk profylaktisk eller terapeutisk vaksinasjon eller kontroller (mus uten tumor eller tumor-bærende mus uten vaksinasjoner) ble samlet ved forskjellige tidspunkter (ingen tumor: dag 0; ID8 bare: dag 45; profylaktiske og terapeutiske vaksiner: dag 270) ble analysert ved flow-cytometri for måling av en ) Th-17 befolkning (CD4 /IL-17-dobbel positiv) eller b) T-reg befolkningen (CD4 /foxp3-dobbel positiv) frekvens.
Både profylaktiske og terapeutiske vaksiner fremkalte en betydelig økning i Th-17 og en reduksjon i T-reg-celle midlere frekvenser (3-og 1,5-folder henholdsvis fig. 10) sammenlignet med tumor-utfordret-vaksinerte dyr (uparet t-test p 0,001, for vaksinert mot kontroll ubehandlede mus) . Behandling og forebyggende vaksiner består i SP17 eller CpG alene også induserte en økning i Th17 frekvenser; var imidlertid slik effekt ikke signifikant (uparet t-test p 0,05, for SP17- eller CpG- bare vaksinert mot kontroll ubehandlet mus). SP17 eller CpG administreres alene redusert T-reg populasjons frekvenser ved en høyere grad sammenlignet med kombinerte SP17 + CpG formuleringer i både terapeutiske og profylaktiske regimer; denne reduksjonen var signifikant sammenlignet med svulst utfordret uvaksinert mus (uparet t-test p 0,01), men ikke sammenlignet med SP17 + CpG vaksinasjoner (uparet t-test p 0,05).
Diskusjoner
letalitet av ovarialcancer først og fremst stammer fra den manglende evne av leger for å påvise sykdommen på et tidlig organ-begrenset og vanligvis asymptomatisk scene, kombinert med mangel på effektive behandlinger for avansert stadium sykdommen [14], [33], [35], [36]. Den avdøde diagnose og den høye frekvensen av cellegift-motstand av denne formen for kreft viser et behov for nye terapeutiske mål og en bedre forståelse av de som er involvert i spredningen av OC mekanismer.
I denne studien, vurderte vi effekten av SP17 rekombinant protein pluss CpG i profylaktiske og terapeutiske innstillinger i murine ID8 modell. SP17 er vist her for å uttrykkes sterkt i cytoplasma og på overflatemembraner av ID8 celler (ved ICC, IF og flowcytometri). Vi var i stand til å følge tumorvekst ved hjelp av SP17 som en biomarkør (figurene 1 og 3). Denne murine modellen genererer ascites som vist i figurene 3a og 3b, og slik at det ser ut til å reflektere den patologi av de mest aggressive og hyppig form av human ovarian sykdom ved trinn III og IV. Genereringen av tumor noder og sammensmelting av peritoneum også ligner den humane prosessen (se figur 3b), så vel som de typiske peritoneal lokalisering dokumentert
in vivo
av fluorescens imaging (figur 3h). Bruken av denne dyremodell har blitt rapportert for forskjellige studier knyttet til tumor målretting og vaskulær-vekstfaktor [23], [37], men dette er den første gang at en mus motstykke av en human tumorassosiert antigen, SP17, er vist å bli uttrykt i en OC musemodell.
en av de viktigste kriteriene i å avgjøre hvilken kandidat selv antigen til mål for forebyggende eller terapeutiske strategier er å skape en immunrespons på en sikker måte, og bevisene her tyder på at SP17 kan være en slik kandidat. Vi har tidligere vist at adoptivt overført SP17-spesifikke T-celler har anti-tumoraktivitet [13], [14], [21], [22], men SP17-målrettet terapeutisk eller profylaktisk vaksinasjon er ikke testet i en tumormodell. Disse resultatene viser tydelig at samtidig bruk av SP17 + CpG i.m. injisert hver 30. dag i totalt ti vaksiner hindret dannelsen av tumorer opptil 300 dager, med en overlevelsesrate på 77% for profylaktisk gruppen og 80% for terapeutisk vaksinasjon gruppe. Spesielt, effekten av vaksinen i profylaktiske og terapeutiske regimer var like. Begge regimer induserte en sterk immunitet som forhindret tumorvekst i tumor utfordret mus. Musene som til slutt bukket under for sykdommen viste forsinket utvikling av tumorveksten sammenlignet med de ikke-vaksinerte mus. Vi hypotese at vår behandlingsregime vil være effektive i å avvise annerledes iscenesatt OC, siden våre terapeutiske vaksiner ikke starter før de ID8 svulster viste en betydelig vekst, med funksjoner som vanligvis observeres i menneskets stadium III-IV OC, inkludert kreften spredt utover bekkenet, til slimhinnen i magen eller til lymfeknutene (www.ovariancancer.org) [38]. Tumor-injisert, vises uvaksinerte dyr tumor spredning til bukhinnen, lymfe-noder, lunger, lever og milt. Faktisk er den midlere forskjellen i vekt mellom tumor-utfordret og tumorfrie gruppene var 10 g, tilsvarende ca. 50% bety at dyrets vekt før tumor injeksjoner (20 gram).
aktivering av en sterk immunrespons mot SP17 ble påvist ved hjelp av ELISA og ELISPOT-analyser, viser en økning i anti-SP17-antistoffer i mus serum, ekspresjon av Th1-assosierte cytokiner og tumor-spesifikke cytotoksiske responser. Det er bemerkelsesverdig at ingen vesentlig serologiske reaktivitet til SP17 var påvisbar før vaksinasjonen, hvilket indikerer muligheten av vaksine for å prime spesifikke naive B-celler. Sammenligning av resultatene av SP-17 spesifikke antistoff titere som ble oppnådd med forskjellige terapeutiske vaksineformuleringer, fant vi bare en liten, men tydelig økning av anti-SP17 antistoffproduksjon i CpG + SP17 vaksinerte dyr sammenlignet med de andre gruppene, spesielt som følge av 9
th vaksinasjon. Derfor kan vi ikke bedømme om svulst avvisning følgende CpG + SP17 vaksiner kan tilskrives humorale responser. Gitt at forskjellene i antistofftitre mellom gruppene er små, vil vi konkludere med at tumor antigen-spesifikke cellulære immunresponser vi oppdaget mest trolig gjøre et større bidrag til tumor avvisning i CpG + SP17-vaksinert bare dyr. Interessant, samtidig bruk av SP17 + CpG var bedre enn SP17 alene eller CpG alene som et adjuvans. Det er godt dokumentert at i.m. injeksjoner av proteiner som vanligvis ikke induserer signifikant immunresponser med mindre de er blandet med hjelpestoffer [30], [32], [39]. Effektiv adjuvans utstilt på minst 2 virkningsmekanismer: en depot effekt som fører til langvarig antigeneksponering i verten, og en evne til å utløse det medfødte immunsystemet gjennom aktivering av dendrittiske celler (DC) via toll-like reseptorer (TLRs) [35 ]. Ved riktig antigenpresentasjon, aktivert DC spille en sentral rolle i induksjon av T-celle-responser [29], [34], [40], [41], [42].
