Abstract
Scoparone, en naturlig forbindelse isolert fra
Artemisia capillaris
, har vært brukt i kinesisk urtemedisin for å behandle neonatal gulsott. Signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) bidrar til vekst og overlevelse av mange humane tumorer. Denne undersøkelsen ble gjennomført for å undersøke antitumoraktivitet av scoparone mot DU145 prostatakreftceller og for å bestemme om dens effekter medieres ved inhibering av STAT3 aktivitet. Scoparone hemmet spredning av DU145 cellene via cellesyklus arrest i G
1 fase. Forbigående transfeksjon analyser viste at scoparone undertrykket både konstitutive og IL-6-indusert transkripsjonen aktivitet av STAT3. Western blot og kvantitativ real-time PCR-analyser viste at scoparone trykt transkripsjon av Stat3 målgener som cyclin D
1, c-myc, survivin, Bcl-2, og Socs3. I samsvar med dette, redusert scoparone fosforylering og kjernefysisk opphopning av STAT3, men ikke redusere fosforylering av Janus kinase 2 (JAK2) eller Src, de store oppstrøms kinaser ansvarlige for STAT3 aktivering. Dessuten ble transkripsjonen aktivitet av en konstitutivt aktiv mutant av STAT3 (STAT3C) inhiberes av scoparone, men ikke ved AG490, en JAK2 inhibitor. Videre scoparone behandling trykkes forankringsuavhengig vekst i myk agar og tumorvekst av DU145 xenotransplantater i nakne mus, samtidig med en reduksjon i STAT3 fosforylering. Computational modellering antydet at scoparone kan binde SH2 domenet STAT3. Våre funn tyder på at scoparone utløser en anti-tumoreffekt mot DU145 prostatakreftceller delvis ved å hemme STAT3 aktivitet.
Citation: Kim J-K, Kim J-Y, Kim H-J, Park K-G, Harris RA, Cho W-J, et al. (2013) Scoparone Utøver antitumoraktivitet mot DU145 prostata kreft celler via hemming av STAT3 aktivitet. PLoS ONE 8 (11): e80391. doi: 10,1371 /journal.pone.0080391
Redaktør: Michael Muders, Universitetssykehuset Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 02.10.2013; Publisert: 15.11.2013
Copyright: © 2013 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Hans arbeid ble støttet med tilskudd fra National Research Foundation [2012R1A2A2A01043867, 2012R1A2A1A03670452, og Basic Science Research Program, (2012-0001350)] finansiert av departementet for vitenskap, IKT Fremtidig planlegging og et tilskudd av Korea Health teknologi R D Project, Ministry of Health Velferd, Republikken Korea (A111345). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest vanligste kreftformen og den sjette største årsaken til kreftdød i menn over hele verden [1]. Selv om metastatisk prostatakreft reagerer i første omgang å androgen deprivasjon terapi, de fleste pasientene etter hvert utvikle seg til en tilstand av kastrering resistent prostatakreft (CRPC) [2,3]. Selv med docetaxel-basert kjemoterapi, er fortsatt behandling av pasienter med metastatisk CRPC en stor klinisk utfordring. I denne sammenheng er det signal transduseren og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) signalveien har blitt vurdert som en lovende terapeutisk mål på metastatisk prostatakreft: dette protein er avvikende aktivert i prostata cancer og bidrar til å fremme metastatisk progresjon [4,5 ].
STAT3, en av syv STAT familie transkripsjonsfaktorer, fungerer som en nedstrøms effektor av forskjellige cytokiner, vekstfaktorer og hormoner, inkludert IL-6, epidermal vekstfaktor (EGF), og leptin [6-9]. Som respons på ekstracellulære stimuli, er STAT3 aktivert gjennom fosforylering ved Y705 og S727 av ikke-reseptor tyrosinkinaser, inkludert JAK2 og Src, og ved mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) [10-12]. Fosforylert STAT3 proteiner danne dimerer som translocate inn i kjernen, hvor de regulerer transkripsjonen av nedstrøms målgener. Selv om sin fosforylering er forbigående og strengt regulert i normale ikke-transformerte celler, er STAT3 vedvarende aktivert i en rekke humane tumorer, inkludert hematologiske maligniteter (leukemi, multippelt myelom og lymfom), og faste tumorer (hode og nakke platecelle-karsinom [HNSCC] , melanom, tykktarm, lever, bryst og prostata kreft) [13-17]. Et stort antall studier har gitt overbevisende bevis for den onkogene rollen som konstitutivt aktiv STAT3 [13-20]. Vedvarende aktivering av STAT3 fremmer forskjellige tumorigen og metastatiske prosesser gjennom transkripsjonsregulering av forskjellige gener som er involvert i celleformering (syklin D
1, c-Myc, og p21), overlevelse (Bcl-2, Mcl-1, og Survivin), metastase (MMP-2 og MMP-9) og angiogenese (VEGF). Derfor er STAT3 nå anses å representere en lovende molekylære mål for utvikling av anti-kreftbehandling ved hjelp av både direkte og indirekte tilnærminger [13,14,21].
Scoparone (6,7-dimethoxycoumarin), en stor bestanddel av den kinesiske urten
Artemisia capillaris plakater (yin hake), har blitt brukt til behandling av neonatal gulsott i Asia [22,23]. Den beskyttende effekt av scoparone mot hyperbilirubinemi medieres ved aktivering konstitutive androstan-reseptor (CAR), en nukleær hormonreseptor som virker som en transkripsjonsfaktor for å oppregulere ekspresjon av enzymer involvert i bilirubin klaring. Scoparone besitter også flere andre biologiske egenskaper, inkludert anti-koagulant, hypolipidemiske, vasorelaxant, anti-oksidanter, og anti-inflammatorisk virkning [24-28]. Inhibering av den transkripsjonelle aktivitet av nukleær faktor-kappaB (NF-kB) synes ansvarlig for sin anti-inflammatorisk aktivitet [28]. Men den potensielle anti-tumor aktivitet av scoparone og dets molekylære mål på andre enn CAR og NF-kB er ikke blitt omfattende undersøkt. I denne studien evaluerte vi den anti-tumor aktivitet av scoparone mot DU145 androgen-uavhengige prostata-cancerceller, og fant at dets molekylære virkningsmekanismer som er forbundet med inhibering av STAT3 aktivitet.
Materialer og Metoder
Reagenser og plasmidkonstruksjoner
Scoparone (6,7-dimethoxycoumarin), AG490 (en inhibitor JAK2), TNF-α, forskolin (FSK), og forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). IL-6 ble hentet fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). M67-Luc reporter konstruere og ekspresjonsvektorer for villtype STAT3 eller et konstitutivt aktiv form for STAT3 (STAT3C) [20] var snill gaver fra Dr. James E. Darnell (The Rockefeller University, New York, NY, USA) . Reporter konstruksjoner (NF-kB-Luc, AP-1-Luc, CRE-Luc, og Egr-en-Luc) og ekspresjonsvektor for Egr-en ble beskrevet tidligere [29]. Den pTOPFLASH luciferase reporter-konstruksjonen [30] og ekspresjonsvektoren for dominerende aktiv mutant av human β-catenin (Sn-β-catenin) inneholdende et i-ramme N-terminal delesjon av aminosyrer 29-48 [31] ble vennlig gitt av Dr. Hans Clevers (University Medical Center Utrecht, Utrecht, Nederland) og Dr. Frank McCormick (University of California, San Francisco, CA, USA), henholdsvis. For å generere Vxy Puro-Luc konstruere, cDNA som koder ildflue luciferase ble forsterket av PCR og satt inn i
Bam
H1
/Xho
1 steder av plasmid Vxy-puro [12].
Etikk uttalelse
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til de aktuelle institusjonelle retningslinjer for dyreforsøk. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Kyungpook National University (Permit Number: 2013-0015).
Cellekultur og transient transfeksjon assay
human prostatacancercellelinjer (DU145 og PC-3), en immortalisert human prostata epitelcellelinje (RWPE-1), humane brystcancercellelinjer ( MCF-7 og MDA-MB-231), menneskelige leverkreft cellelinjer (HepG2 og Hep3B), en livmorhalskreft cellelinje (HeLa), og tykktarmskreft cellelinjer (HT-29, HCT-116, og HCT-15) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). DU145, PC-3, MDA-MB-231, HeLa, HT-29, HCT-116 og HCT-15-celler ble dyrket i RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS ; Hyclone, Logan, UT, USA) og antibiotika. MCF-7 og Hep3B-celler ble dyrket i DMEM (Invitrogen) medium supplementert med 10% FBS og antibiotika. RWPE-1-celler ble dyrket i fullstendig keratinocytt serumfritt medium (SFM-K; Invitrogen) inneholdende 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt, 5 ng /ml humant rekombinant EGF, og antibiotika. HepG2-celler ble dyrket i MEM (Invitrogen) supplert med 10% FBS og antibiotika. For transient transfeksjon assays, HepG2 (8 x 10
4), DU145 (3 x 10
4), og PC-3 (3 x 10
4) celler ble sådd i 24-brønns plater og transfektert med M67-Luc reporter konstruksjon (200 ng /brønn), med eller uten uttrykk vektor (100 ng /brønn) for enten villtype eller konstitutivt aktiv mutant STAT3 (STAT3C) ved hjelp av transitt-LT1 transfeksjon reagens (Mirus Bio LLC, Madison, WI, USA). HepG2-celler ble også transfektert med pTOPFLASH og EGR-1-Luc rapportør plasmider (200 ng /brønn) sammen med eller uten ekspresjonsplasmidene (100 ng /brønn) for Cyclin E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), og β-aktin (Sigma-Aldrich). Etter vasking ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) – eller IRDye-konjugert (IRDye 800CW og IRDye 680LT, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) sekundære antistoffer, og signalene ble påvist ved anvendelse av ECL Western blot deteksjonssystem (Amersham , Buckinghamshire, UK) eller Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE, USA), henholdsvis. β-aktin ble benyttet som protein lasting kontroll. Signal intensiteter ble kvantifisert ved densitometri hjelp Image J programvare og normalisert mot de tilsvarende p-aktin signaler.
kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse
DU145 cellene ble inkubert med scoparone for 1, 3, 6, 12 eller 24 timer. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av QIAzol lysereagensen (Qiagen, Valencia, CA, USA), og en mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av RevertAid First Strand cDNA syntese kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i henhold til produsentene « bruksanvisning. For QRT-PCR, ble 25-50 ng cDNA brukes til PCR forsterkning (glødetemperatur: 60 ° C) ved hjelp av Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) med VIIa ™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems ). Surt ribosomalt phosphoprotein P0 (RPLP0; 36B4) ble brukt som en intern kontroll. PCR tilstand og primer sekvenser er oppført i tabell S1.
Immunofluorescensanalyse
DU145 cellene ble sådd på dekkglass og lov til å feste i 24 timer. Basert på våre Western blot resultater som viser vedvarende reduksjon i STAT3 fosforylering 2-6 timer etter scoparone behandling ble cellene behandlet med scoparone (0,5 mmol /L) i 4 timer. Celler ble fiksert med 95% etanol i 15 minutter ved -20 ° C, og deretter inkubert med antistoffer mot pSTAT3 (Y705) eller STAT3 etterfulgt av inkubasjon med Alexa Fluor 488 eller Alexa Fluor 568 merkede sekundære antistoffer, henholdsvis. Cellekjerner ble farvet med DAPI og konfokale bilder ble oppnådd og slått sammen.
forankrings-uavhengig vekst assay
soft agar-kolonidannelsesanalyser ble utført som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [12]. DU145 (1 x 10
4) celler i 1,5 ml vekstmedium ble blandet med 1,5 ml 0,5% agarose i oppvarmet vekstmedium inneholdende bærer (0,1% DMSO) eller 50, 100 eller 200 pmol /L av scoparone og lagvis på 0,5% basen agar i 60 mm-cellekultur retter. Kultur medium som inneholder scoparone ble lagt inn bare én gang; senere, medium uten scoparone ble lagt inn hver uke i 21 dager til store kolonier var tydelig. Cellene ble farget med krystallfiolett for kolonitelling.
Molekylær modellering og docking studie
molekylær modellering og docking Studien ble utført ved hjelp Surflex-Dock i SYBYL versjon 8.1.1 av Tripos Associates (St . Louis, MO, USA) som tidligere beskrevet [33]. Krystallstrukturen av STAT3 ble hentet fra Protein Data Bank (PDB ID-koden 1BG1) og raffinert for forankringsprosessen [34]. Strukturen i scoparone ble opprettet ved hjelp av SYBYL pakke med standard obligasjons lengder og vinkler, og minimert bruk av konjugert gradient metode til gradient var 0.001 kcal /mol med Tripos kraftfelt. Den Gasteiger-Huckel kostnad, med en avstand avhengig dielektrisk funksjon, ble brukt for minimering prosessen. Bildet av den anslåtte interaksjon ble opprettet med den molekylære grafikkprogram MOLCAD. Etter å ha kjørt Surflex-Dock, den konformer med beste totalscore ble valgt og brukt til å forutsi de detaljerte bindingsmønstre i hulrommet.
Etablering av stabile cellelinjer som uttrykker ildflue luciferase
For å generere retrovirus uttrykker ildflueluciferase, Phoenix A-celler ble transfektert med den Vxy Puro-Luc -konstruksjonen som tidligere beskrevet [12]. DU145-celler ble transdusert med retroviruser som uttrykker ildflue luciferase og valgt med puromycin (1 pg /ml) i 2 uker. Valgt DU145 (DU145-Luc) celler ble bekreftet for luciferaseaktivitet og for den anti-proliferative effekt av scoparone (upubliserte data).
Xenotransplantat tumormodell og immunhistokjemiske analyser
Seks uker gamle atymiske BALB /c naken (nu /nu) mus (Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan) ble akklimatisert under kontrollerte standardbetingelser for en uke før forsøket i henhold til guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Health. DU145-Luc (5 x 10
6) celler i 100 ul PBS ble injisert subkutant i høyre dorsale flanke feltet av mannlig atymiske nakne mus (BALB /c Slc-
nu /nu
, 7 uker gammel). Diameteren av tumoren ble målt eksternt med et skyvelære linjal hver 2 dager, og volumet av tumoren (mm
3) ble beregnet. Etter 7 dager, når tumorer nådde en gjennomsnittlig størrelse på ca 20-25 mm
3, mus ble fotografert på IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) 10 minutter etter intraperitoneal injeksjon av 100 ul XenoLight D-luciferin (30 mg /ml, Caliper). Dyrene ble deretter tilfeldig delt inn i to grupper (n = 8 /gruppe) og gitt intraperitonealt (i.p.) injeksjoner av enten bærer eller scoparone (30 mg /kg) hver 2-3 dag i 18 dager. Mus ble bedøvet med natrium pentobarbital (Entobar; Hanlim Pharmaceutical, Yong-In, Korea) og avbildes på IVIS Imaging System. Xenografttumorer ble skåret ut for volummåling og immunhistokjemi. For immunhistokjemisk analyse, ble tumorvev fjernet, formalinfiksert og parafininnebygd. Serielle 4-um tumorsnitt ble deparaffinized i xylen, rehydrert ved synkende kvaliteter av etanol, og enten farget med hematoksylin og eosin (H 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Scoparone utløser en anti-proliferativ effekt på DU145 menneskelige prostata kreft celler ved å indusere cellesyklus arrest i G
1 fase
for å evaluere den anti-kreft potensialet av scoparone på prostatakreftceller
in vitro
, utførte vi en WST-8-celleproliferasjonsanalyse på to androgen-uavhengige humane prostatacancercellelinjer (DU145 og PC-3) og en immortalisert human prostata epitelcellelinje (RWPE-1). Scoparone behandling i 72 timer i betydelig grad hemmet proliferasjonen av DU145-celler, med en IC
50 verdi på 41,3 umol /l. Imidlertid stoffet som utøves liten vekst-inhibitorisk effekt på PC-3 og RWPE-3-celler ved den konsentrasjonen (figur 1A). Ikke desto mindre, begge cellelinjer viste redusert spredning ved høyere konsentrasjoner av medikamentet ( 100 umol /L), som også ble observert i flere andre cellelinjer avledet fra brystkreft (MCF-7 og MDA-MB-231), hepatocellulært karsinom (HepG2 og Hep3B), livmorhalskreft (HeLa), og tykktarm kreft (HCT-15 HCT-116 og HT-29) (figur 1A og figur S1), noe som tyder på at scoparone har en generell anti-proliferativ effekt på kreftceller.
A og B. Scoparone hemmer proliferasjonen av humane kreftcellelinjer. Prostatakreftceller (DU145 og PC-3), RWPE-1 (en immortalisert human prostata epitelial cellelinje) og brystkreftceller (MCF-7 og MDA-MB-231) ble serum sultet i 24 timer. Cellene ble deretter inkubert i vekstmedium supplementert med 10% FBS i nærvær av bærer (0,1% DMSO) eller de indikerte konsentrasjoner av scoparone i 72 timer, og celleformering ble bestemt ved WST-8-analyse. Data er uttrykt som prosentandeler av bærerkontrollen (definert som 100%) og representerer gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. B. Scoparone induserer cellesyklus arrest på G
en fase i DU145 cellene. Serum-sultet DU145-celler ble stimulert med 10% FBS i nærvær av kjøretøyet eller scoparone (0,5 og 1 mmol /L) i 28 timer, og deretter utsatt for flowcytometrisk analyse av cellesyklusen. Søylediagram viser prosentandelen av celler i G
1 fase. Dataene er gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i duplikat.
*
P
0.001 vs. kjøretøy kontroll;
#
P
0.005,
##
P
0.001 vs. serum stimulering. C. Representative Western blot-analyse av cellesyklusrelaterte proteiner. DU145-celler ble behandlet med scoparone (0,5 mmol /L) i de angitte tidsrom, og deretter høstet for Western blot-analyse. D. Kvantifisering av relative protein nivåer. Signalintensiteter ble kvantifisert ved densitometrisk analyse og normalisert til den av den tilsvarende β-aktin signal. Ekspresjonsnivået av hvert protein ble uttrykt som et forhold i forhold til nivået i kontroll ved tid 0 h, som ble definert som 1. Dataene representerer middel verdier ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter.
*
P
0,05,
#
P
0,005 vs. kjøretøy kontroll på hvert tidspunkt.
For å kunne fastslå om den anti-proliferativ effekt av scoparone skyldes hemming av cellesyklusprogresjon eller induksjon av apoptose, gjennomførte vi en flowcytometrisk analyse av cellesyklusen i DU14 celler, som var den mest følsomme for den veksthemmende virkning av scoparone. I samsvar med en tidligere rapport [32], ble prosentandelen av DU145-celler utvikler seg inn i S-fasen av cellesyklusen betydelig øket etter 28 timer med serumstimulering. I nærvær av scoparone, ble serum-stimulert økning i S-fase cellepopulasjon redusert, og antallet celler i G
1 fase ble samtidig øket (figur 1 B). Men sub G
1 topp, en indikasjon på en apoptotisk celle befolkningen ble ikke økt med scoparone. Således, i DU145-celler, induserer scoparone cellesyklus-stans ved G
en fase uten induksjon av apoptose.
G
1-fase cellesyklus-stans fremkalt av scoparone ble ytterligere bekreftet ved å undersøke de cellulære nivåer av cellesyklusregulerende proteiner som fremmer G
1-S-overgangen. Western blot-analyser viste at scoparone økte nivåer av cellesyklus inhibitoriske proteiner slik som p21 og p27, som er inhibitorer av syklin /Cdk-kompleks (figur 1C og D). I motsetning til det betydelig reduserte nivåer av cellesyklusen fremme proteiner Cyclin D
1 og fosforylert pRb (ppRb), selv om det hadde liten effekt på ekspresjonen av Cyclin E. Disse funn viser at scoparone induserer G
1-fase cellesyklus arrest ved å endre nivået av proteiner som påvirker cellesyklusprogresjon.
Scoparone hemmer konstituerende og IL-6-stimulert transkripsjonen aktivitet av STAT3
å identifisere transkripsjonsfaktorer som er målrettet av scoparone, vurdert vi dens effekt på transkripsjonen aktivitet av flere transkripsjonsfaktorer som spiller viktige roller i kreftcelle spredning. Interessant, scoparone trykkes kraftig IL-6-stimulerte STAT3 transkripsjonen aktivitet (figur 2A) og som rapportert, undertrykte TNF-α-stimulerte NF-kB transkripsjonen aktivitet. Scoparone også litt hemmet PMA-indusert AP-1 aktivitet og Egr-en aktivitet, mens det utøves liten effekt på enten CREB- eller β-catenin avhengig transkripsjon (figur S2).
A. Effekten av scoparone på aktiviteter til transkripsjonsfaktorer. HepG2 celler ble transient transfektert med ulike luciferaserapportørplasmid plasmider drevet av syntetiske arrangører som inneholder bindingsseter for relevante transkripsjonsfaktorer. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med de aktuelle oppstrøms stimulatorer og scoparone i 24 timer og deretter høstet for luciferase og β-galaktosidase analyser. RLU, relative luminescence enheter. Dataene er gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i duplikat.
*
P
0,0005,
#
P
0,005 vs. reporter alene;
**
P
0.005,
***
P
0.001,
##
P
0,01 vs. stimulering. B. Scoparone hemmer både konstitutive og IL-6-stimulerte transkripsjonen aktivitet av STAT3. DU145-celler ble transient transfektert med M67-Luc, en syntetisk promoter som inneholder fire eksemplarer av STAT3 bindingssetet. PC-3-celler ble ko-transfektert med M67-Luc konstruere og ekspresjonsvektoren for vill-type STAT3. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med IL-6 i nærvær av scoparone i 24 timer. Dataene er gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i duplikat.
*
P
0.005,
#
P
0,05,
##
P
0,01 vs. reporter alene;
**
P
0,01,
***
P
0,005 vs. IL-6 stimulering. C og D. QRT-PCR og Western blot analyser av Stat3 nedstrøms målgener. DU145-celler ble behandlet med scoparone (0,5 mmol /L) i de angitte tidsrom, og deretter høstet for QRT-PCR (C) og Western blot (D) analyser. mRNA-nivåene av STAT3 målgener ble bestemt ved QRT-PCR-analyse (C) og normalisert mot nivået av RPLP0 /36B4. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer.
*
P
0,05,
#
P
0,005 vs. bærerkontroll ved hvert tidspunkt. Protein ekspresjonsnivåer (D) ble kvantifisert ved densitometrisk analyse og normalisert mot de tilsvarende nivåer av β-aktin. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter.
*
P
0,05,
#
P
0,005 vs. kjøretøy kontroll på hvert tidspunkt.
For å validere den hemmende effekten av scoparone på transkripsjonen aktivitet av STAT3, vi utført transient transfeksjon analyser ved hjelp av DU145 celler som uttrykker konstitutivt aktiv STAT3 og PC-3 celler mangler STAT3 [35]. Scoparone signifikant hemmet konstitutiv og IL-6-forsterket transkripsjonen aktivitet av STAT3 i DU145-celler (figur 2B, til venstre). I STAT3-negative PC-3-celler, som forventet, basal luciferase-aktivitet var ekstremt lav; Videre, har IL-6-behandling ikke øke reportergen aktivitet, som ikke ble påvirket av scoparone (figur 2B, til høyre). Imidlertid overekspresjon av vill-type STAT3 ført til økning i luciferaseaktivitet i respons til IL-6 stimulering av PC-3-celler. Scoparone behandling reduserte IL-6-stimulerte STAT3 aktivitet betraktelig. Disse resultatene tyder på at scoparone hemmer både konstitutive og IL-6-stimulerte transkripsjonen aktivitet av STAT3.
For ytterligere å undersøke om scoparone kan undertrykke transkripsjon av Stat3 nedstrøms mål, vi utført kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyser for Stat3 målgener som Cyclin D
1, c-myc, survivin, Bcl-2, og Socs3. QRT-PCR-analyser viste at scoparone reduserte mRNA uttrykk nivåer av STAT3 målgener (Figur 2C). Etter avtale med QRT-PCR resultater, det også betydelig redusert proteinnivåer av disse genene (Figur 2D). Disse funnene viser at scoparone undertrykker av STAT3 mål gentranskripsjon.
Scoparone hemmer fosforylering og kjernefysisk opphopning av STAT3 uavhengig av JAK2 og Src
For å avgrense de molekylære mekanismene bak hemming av STAT3 aktivitet ved scoparone, evaluert vi dens effekt på STAT3 fosforylering i DU145 cellene. Scoparone betydelig redusert nivåene av STAT3 fosforylering på Tyr705 (pSTAT3 Y705) og Ser727 (pSTAT3 S727) i DU145 cellene 2 timer og 30 minutter etter behandling, henholdsvis (figur 3A). Det er også redusert IL-6-forbedrede fosforylering av STAT3 (figur 3B). Totalt protein nivåer av STAT3 ble ikke påvirket av scoparone behandling (figur 3A og B, og figur S3). I samsvar med disse funn immunofluorescens farging av pSTAT3 Y705 viste at pSTAT3 proteiner ble hovedsakelig er lokalisert i kjernen av DU145-celler (Figur 3C). Atom pSTAT3 signal ble kraftig redusert i scoparone-behandlede celler. Disse resultater viser at scoparone hemmer konstitutiv og IL-6-stimulert fosforylering og atom akkumulering av pSTAT3 i DU145-celler.
A og B. Scoparone hemmer både konstitutive (A) og IL-6-forsterket (B) fosforylering av STAT3 på Tyr705 og Ser727. DU145-celler ble behandlet med bærer eller scoparone (A), eller serum-sultet i 24 timer, etterfulgt av behandling scoparone (0,5 mmol /L) i 4 timer før stimulering med IL-6 (B) i de angitte tidsrom. Cellene ble høstet for Western blotting ved hjelp av antistoffer mot pSTAT3 (Y705), pSTAT3 (S727), og STAT3. Proteinnivåer ble kvantifisert ved densitometri og normalisert mot de tilsvarende nivåer av β-aktin. Ekspresjonsnivået av hvert protein iss uttrykt som et forhold i forhold til nivået i kontroll ved tid 0 timer (definert som 1). De data som representerer de midler verdier ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter.
§
P
0,0005 og
§§
P
0,005 vs. kontroll ved tid 0;
*
P
0,0005,
**
P
0.005,
#
P
0,01
##
P
0,05 vs bærerkontroll ved hvert tidspunkt. C. Scoparone reduserer atom opphopning av fosforylert STAT3. DU145-celler ble behandlet med scoparone i 4 timer og behandles for farging immunofluorescens med antistoffene mot pSTAT3 (Y705) eller STAT3. Cellekjerner ble farget med DAPI, og confocal bilder ble innhentet og slått sammen. Scale bar indikerer 10 mikrometer. D. Scoparone hemmet ikke fosforylering av JAK2 og Src, to store Stat3 oppstrøms kinaser. DU145-celler ble behandlet med scoparone i de angitte tidsrom, og deretter høstet for Western blot-analyse. Signalintensiteter ble kvantifisert ved densitometrisk analyse og normalisert mot de tilsvarende p-aktin-signaler. Ekspresjonsnivået av hvert protein er uttrykt som et forhold i forhold til nivået i kontroll ved tid 0 h, som ble definert som 1.
*
P
0,05 vs. kjøretøy kontroll på hvert tidspunkt.
For å finne ut om den hemmende effekten av scoparone på STAT3 fosforylering skyldes undertrykkelse av oppstrøms signal hendelser, vurdert vi effekten av scoparone på fosforylering av JAK2 og Src, to store oppstrøms kinaser ansvarlige for STAT3 aktivering. Scoparone ikke redusere protein nivåene av konstitutivt fosforylert JAK2 (figur 3D) og Src-fosforylering ble ikke redusert, men heller litt forhøyet, ved scoparone. De totale protein og mRNA nivåer for JAK2 og Src ble ikke endret ved scoparone behandling (Figur 3D og figur S4). Sammen er disse observasjonene tyder på at scoparone hemmer fosforylering og kjernefysisk opphopning av STAT3 uavhengig av oppstrøms kinaser JAK2 eller Src.
Scoparone kan hemme transkripsjonen aktivitet av STAT3 ved direkte binding til SH2 domenet STAT3
For ytterligere å bekrefte om scoparone kunne regulere STAT3 aktivitet uavhengig av oppstrøms signalering, ble PC-3 celler transient transfektert med STAT3C, en konstitutivt aktiv mutant av STAT3 som etterligner virkningen av fosforylert STAT3 ved substitusjon av to cysteinrester innen sitt SH2 domene og aktiverer målgenet transkripsjon uten oppstrøms stimuli [20].
