Abstract
Genomisk amplifisering av 19q12 forekommer i flere krefttyper, inkludert kreft i eggstokkene, hvor det er forbundet med primær behandlingssvikt. Vi attenuert systematisk ekspresjon av gener innenfor den minimalt definert 19q12 region i ovarie cellelinjer ved hjelp av korte interfererende RNA (siRNA) for å identifisere driver onkogen (e) i amplikonet. Knockdown av
CCNE1
resulterte i G1 /S-fasen arrest, redusert celle levedyktighet og apoptose bare i forsterkerførende celler. Selv
CCNE1
knockdown økt cisplatin motstand i kortsiktige analyser, klonogene overlevelse ble hemmet etter behandling. Gevinst av 20q11 var sterkt korrelert med 19q12 forsterkning og spredte en 2,5 Mb regionen, inkludert
TPX2
, en centromeric protein nødvendig for mitotisk spindel funksjon. Uttrykk for
TPX2
var sterkt korrelert med genamplifisering og med
CCNE1
uttrykk i primære svulster. siRNA inhibering av
TPX2
redusert cellelevedyktighet, men denne effekten ble ikke amplicon avhengig. Disse funnene viser at
CCNE1
er en viktig driver i 19q12 amplicon nødvendig for overlevelse og clonogenicity i celler med locus forsterkning. Co-forsterkning på 19q12 og 20q11 innebærer tilstedeværelse av et samarbeidsmutasjons nettverk. Disse observasjonene har implikasjoner for anvendelse av målrettet terapi i
CCNE1
avhengige eggstokkreft
Citation. Etemadmoghadam D, George J, Cowin PA, Cullinane C, Kansara M, Australian Ovarian Cancer Study Group , et al. (2010) Amplicon-Dependent
CCNE1
Expression er kritisk for klonogene Overlevelse etter Cisplatin behandling og er korrelert med 20q11 Gain i eggstokkreft. PLoS ONE 5 (11): e15498. doi: 10,1371 /journal.pone.0015498
Redaktør: Nathalie Wong, Chinese University of Hong Kong, Kina
mottatt: 31 august 2010; Godkjent: 17 oktober 2010; Publisert: 12.11.2010
Copyright: © 2010 Etemadmoghadam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av en National Health and Medical Research Council (NHMRC) prosjektstøtte 628779 (www.nhmrc.gov.au). Den australske Ovarian Cancer Study er støttet av US Army Medical Research og forsyningskommando i henhold DAMD17-01-1-0729, The Cancer Council Victoria, Queensland Cancer Fund, The Cancer Council of New South Wales, The Cancer Council South Australia, The Cancer Foundation of Western Australia, The Cancer Council Tasmania og NHMRC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Avansert scenen serøs svulster står for størsteparten av invasiv eggstokkreft og til tross for en generelt god initial respons på cytoreduserende kirurgi og platina-basert kjemoterapi, de fleste kvinner står overfor en høy risiko for tilbakefall og dårlig langsiktig overlevelse [1 ]. Platinabaserte midler, slik som cisplatin og karboplatin, er giftige for delende celler på grunn av dannelse av DNA-addukter som resulterer i dobbeltstrengbrudd, aktiverende DNA-skade-medierte apoptotiske signaler [2]. Respons på kjemoterapi er imidlertid vanskelig å forutsi, og det er foreløpig ingen prediktive biomarkører for serøs eggstokkreft i klinisk bruk. Vi har tidligere kartlagt en region av 19q12 forsterkning i forbindelse med behandlingsresistent serøs ovarietumorer ved å utføre et genom-wide undersøkelse av kopiantall endring [3]. Disse funnene var i samsvar med tidligere rapporter om amplifisering bli assosiert med dårlig total overlevelse [4], [5]. Tilsvarende har tilbakevendende forsterkning av 19q12 blitt rapportert i en rekke kreftformer, inkludert esophageal [6], gastrisk [7], lunge [8] og endometriale tumorer [9].
19q12 forsterkning er et høy-nivå fokal forsterkning som er rettet mot en klynge av bare flere gener på kromosom 19.
CCNE1 plakater (Cyclin E) har tidligere blitt foreslått som mål for forsterkning i eggstokk-kreft [4], [10], [11], men en systematisk analyse av kjente gener innenfor amplicon har ikke blitt utført. Videre mens
CCNE1
forsterkning sannsynlig gir en onkogen stimulans gjennom aktivering av cellesyklusen, er det ikke åpenbart hvordan det kan bidra til primær kjemoterapi motstand. For eksempel, over-uttrykk for
CCNE1 in vitro
gjør eggstokkreft celler mer følsomme for platina agenter, antagelig på grunn av økt spredning [12]. Det er mulig at den biologiske konsekvensen av 19q12 forsterkning ikke er begrenset til over-ekspresjon av
CCNE1
, og at andre gener i amplikonet bidra til tumorvekst og progresjon. Videre andre co-eksisterende mutasjons hendelser andre steder i kreftgenomet kan samarbeide eller forsterke onkogene effekten av
CCNE1
over-uttrykk.
Vi utførte en siRNA knockdown skjermen av alle kommenterte gener innenfor og umiddelbart flankerer 19q12 amplicon i eggstokkreft cellelinjer med eller uten regional forsterkning. Vi fant
CCNE1
å være den eneste gen målet innen den amplikon som redusert cellelevedyktighet i amplikonet holdige OVCAR-3 cellelinjen etter siRNA knockdown.
CCNE1
knockdown indusert cellesyklus og apoptose, og samtidig svekke klonogene overlevelse etter cisplatin behandling, til tross for økende
in vitro
legemiddelresistens i en kortsiktig cytotoksisitet analysen. I en sykdom byr disse resultatene tyder på at behandlingssvikt i
CCNE1
amplifiserte tumorer kan være knyttet til hurtig repopulation av tumoren etter kjemoterapi og ikke cellulær medikamentresistens spesifikt. Vi har også funnet
TPX2
forsterkning og over-uttrykk for å være signifikant korrelert med
CCNE1
kopiantall status antyde tilstedeværelsen av et samarbeidsmutasjons nettverk mellom disse genene.
Resultater
Focal forsterkning av 19q12 er felles for ulike krefttyper
Vi først søkt å sammenligne minimal regionen kromosom gevinst på 19q12 tvers av flere krefttyper. Vi har innhentet data fra SNP-baserte høyoppløselige kopi nummer studier inkludert 15 krefttyper [9], [13] for en sammenligning med våre funn [3] (Figur 1a). Minimale målrettede regioner av amplifikasjon ble definert ved GISTIC, et analyseverktøy som vurderer den statistiske signifikansen av kopitall hendelser basert på frekvens og amplitude [14]. Betydelig forsterkning av 19q12 var til stede i en tredjedel av krefttyper som ble analysert. Av tumortyper med 19q12 forsterkning, omtrent 25% av individuelle prøver viste kopitall forsterkning, bortsett fra for endometriale tumorer hvor en høyere frekvens ble observert (~45%) [9]. Minimal amplicon grenser ble funnet å målrette en region mindre enn 2 Mb i størrelse, sentrert på ca kl 35,0 Mb på kromosom 19. I begge eggstokkene tumor datasett analysert [3], [13] minimal kartlagt regionen gevinst innlemmet samme fem gener (
POP4
,
PLEKHF1
,
C19orf12, CCNE1 og C19orf2
), med tilsvarende overlappende områder oppdaget i endometrial og brystsvulster. I kontrast til den minimale regionen kartlagt i ikke-småcellet lungekreft innlemmet bare
CCNE1
mens et bredt område ble kartlagt i esophageal svulster (~9.5 Mb), som strekker seg over 110 kommenterte gener. Kopiantall endring av 19q12 locus viste en grad av tumor spesifisitet, ved at forsterkningen ikke ble sett i 10 andre tumortyper hvor det betydelig data var tilgjengelige, inkludert småcellet lungekarsinom, hepatocellulær, kolorektal- og prostatakreft (data ikke vist). Vi ser også at forsterkningen av 19q12 har blitt identifisert av cDNA matrise-CGH analyse av mage svulster [15], [16], men dette tumortype ble ikke inkludert som vår analyse var begrenset til høyoppløselige SNP kopi talldata.
(A) Peak regioner av forsterkning mellom 30-46 Mb på kromosom 19 i
1non-småcellet [8], [13], [40], [41], [42];
2ovarian [3],
3 [13];
4endometrial [9];
5breast [13], [43], [44]; og
6esophageal svulster [42]. Frekvens og gener stede i rush grenser angitt. (B) Affymetrix SNP 6,0 kartlegging microarray kopiantallet av kromosom 19 i ovarie tumorcellelinjer og (C) mellom 34-36 Mb for OVCAR-3 og SK-OV-3 cellelinjer. Kopier nummeret som vises er gjennomsnittet bevegelig vindu av 20 markører kartlagt Human mars 2006 (hg18) genom enheten (kilde: Sanger Cancer Genome Project Arkiv). (D) Gene uttrykk bestemmes av qPCR i ovčar-3 celler i forhold til SK-OV-3.
Å identifisere cellelinjer som var representativ for primærsvulster for funksjonelle studier vi analysert med høy oppløsning SNP kopi talldata for 22 eggstokkreft cellelinjer på kromosom 19q12 (Sanger Cancer Genome Project Arkiv) og identifisert syv cellelinjer (ovčar-3, ovčar-4, Kuramochi, RMG-I, Caov-4, EFO-21, OVCAR-8) som hadde overlappende forsterkning på 19q12 (Figur 1B og figur S1). Av de syv cellelinjer, OVCAR-3 inneholdt en brennvidde på høyt nivå forsterkning som best rekapitulert data fra primær ovarietumorer (figur 1C). Kvantitativ-PCR (qPCR) viste at de fem genene innen regionen på høyt nivå forsterkning i OVCAR-3 (
POP4
,
PLEKHF1
,
C19orf12
,
CCNE1 og C19orf2
), men ikke flankerer gener (
UQCRFS1 Hotell og
ZNF536
), var over-uttrykt i forhold til SK-OV-3 kontroll cellelinje mangler 19q12 forsterkning ( Figur 1D). Av de fem genene,
PLEKHF1 Hotell og
CCNE1
viste det høyeste uttrykk. Den 19q12 amplicon kan derfor være tilordnet til en region som strekker seg over 34,4 til 35,4 av kromosom 19 og involverer 5 kommenterte gener, som hver er over-uttrykt i OVCAR-3.
Cells linjer med forsterkning på 19q12 er spesielt sensitiv til
CCNE1
knockdown
Kort interfering RNA (siRNA) ble brukt til å knockdown uttrykket av de sju gener i og ved siden av høyt nivå 19q12 amplicon i OVCAR-3 og SK-stekeovnen 3 pluss
GAPDH
og ikke-lyddemping (NS) kontroller. En skjematisk av eksperimentell design som brukes for den kombinerte siRNA knockdown strategi og påfølgende medikamentbehandlingsprotokoll er vist i figur 2A. Transkripsjonsnivåer for alle målrettede gener ble effektivt og spesifikt redusert opp til 96 timer etter transfeksjon siRNA, med unntak av
ZNF536
, som flankeres regionen av forsterkning (figur 2B). Ved avhør data fra en tidligere studie [17] fant vi
ZNF536
uttrykk for å være lav eller fraværende i primær serøs ovarietumorer, noe som kan forklare en uobserverbar reduksjon i genuttrykk (data ikke vist). Genekspresjon ble også overvåket i nærvær av cisplatin, i forberedelse for funksjonelle eksperimenter.
PLEKHF1
,
CCNE1
,
C19orf2 Hotell og
ZNF536
ble litt oppregulert ved cisplatin behandling i en eller begge cellelinjene imidlertid siRNA knockdown var fortsatt effektive (figur 2B).
(A) Eksperimentell skjematisk for kombinert siRNA transfeksjon og medikamentell behandling. (B) qPCR heatmap viser log
2 genuttrykk forholdet til utransfekterte OVCAR-3 (øverst) og SK-OV-3 (nederst) celler for hver siRNA (kolonner) i genet mål (rader) med eller uten cisplatin behandling 72 timer etter transfeksjon. (C) Celleviabilitet normalisert til ingen siRNA kontrollceller etter transfeksjon med hver siRNA. Statistisk signifikans (t-test) beregnet ved sammenligning med ikke-stanse (NS) siRNA i den samme cellelinje ved å bruke data fra tre uavhengige MTS-analyser utført med triplikatbrønner pr tilstand. Gjennomsnittlige normaliserte absorbans ved 490 nm og SEM plottet (n = 3), ** p-verdi 0,01. (D) Andel apoptotiske celler vurdert av TUNEL flekker på ingen siRNA kontrollceller eller etter transfeksjon med NS eller
CCNE1
målrettet siRNA. Viste data fra tre uavhengige eksperimenter med to brønner analysert per tilstand. Gjennomsnittlig prosent av apoptotiske celler og SEM plottet (n = 3). *** P-value 0,0001 (Chi kvadrat) beregnet ved sammenligning av det totale celletall mellom ovčar-3 celler behandlet med en
CCNE1
siRNA og alle andre forhold. (E) CCNE1 protein uttrykk ved western blot for å bekrefte siRNA-mediert
CCNE1
knockdown på eksperimentell endepunkt. (F) Celleviabilitet i flere cellelinjer etter transfeksjon med
CCNE1
eller ikke-tie sirnas normalisert til hver cellelinje uten siRNA til. Statistisk signifikans (t-test) beregnet ved sammenligning med NS siRNA i den samme cellelinje. Gjennomsnittlige normaliserte absorbans fra MTS-analyse og SEM plottet (n = 3); * P-verdi 0,05, ** p-verdi. 0,01
Av de genene som ble testet, bare
CCNE1
knockdown viste en signifikant reduksjon i celle levedyktighet i OVCAR- 3 (til ca. 60% av NS kontrollceller; p 0,01; figur 2C).
CCNE1
knockdown hadde ingen effekt på SK-OV-3 celler. På grunn av dets rolle i G1 /S overgang, forventet vi at uttømming av syklin E1 protein ville forårsake G1 rest (se nedenfor), og resultere i en økning av apoptotiske celler. TUNEL-farging av ubehandlede celler var sammenlignbare (SK-OV-3, 0,1%, OVCAR-3, 0,2%) (figur 2D), mens
CCNE1
knockdown resulterte i en signifikant økning i apoptose bare i OVCAR-3 (p 0,0001). Reduksjon i protein overflod ble også validert i begge cellelinjene etter genet knockdown (figur 2E).
Etter å ha identifisert spesifikke følsomheten OVCAR-3 til
CCNE1
knockdown, vi forsøkte å validere dette funnet i uavhengige cellelinjer og bestemme hvorvidt den observerte virkning var fragment avhengig. Vi utvidet derfor analysen for å inkludere ytterligere tre cellelinjer med forsterkning ved 19q12 (OVCAR-4, Kuramochi og OVCAR-8) og en ytterligere unamplified linje (IGROV-1). En statistisk signifikant korrelasjon mellom kopiantallet og genuttrykk av
CCNE1
ble funnet på tvers av alle linjer. Men OVCAR-8 ikke viser økt
CCNE1
uttrykk i forhold til genamplifikasjon (figur S2 A).
CCNE1
ekspresjon og syklin E1 proteinnivåer ble effektivt redusert i hver linje i forhold til basislinje-ekspresjon ved siRNA-mediert knockdown (fig S2 B og C). Som observert i OVCAR-3,
CCNE1
knockdown spesielt redusert levedyktighet i flere linjer med 19q12 forsterkning, og bare marginalt i unamplified linjen IGROV-en (figur 2F). Dermed ovarietumorceller med forsterkning på 19q12 er spesielt sensitiv overfor utarming av cyclin E1, sammenlignet med unamplified linjer.
CCNE1
knockdown reduserer akutt følsomhet for cisplatin
Gitt foreningen av 19q12 forsterkning med primær behandlingssvikt [3] og dårlig resultat [4], [5] vi søkt å utforske effekten av genet knockdown på narkotika følsomhet. Selv om vår analyse hadde identifisert en konkret avhengighet av
CCNE1
i forsterkede linjer, vi først revurderes alle syv amplicon assosierte gener for innvirkning på kjemoterapi respons i OVCAR-3 og SK-OV-3 ved hjelp av en 72- time cytotoksisitet analysen. Celler ble behandlet ved litt over en forhåndsbestemt IC50 (se Methods S1) og levedyktighet målt. Knockdown av gener innenfor amplicon ikke signifikant innvirkning på cisplatin følsomheten enten cellelinje. Uventet, ble cisplatin-indusert cytotoksisitet i OVCAR-3 behandlede celler svekkes av
CCNE1
hemming (figur 3A). Vi utførte en dose-responsanalyse for å karakterisere ytterligere effekt av cisplatin behandling etter
CCNE1
knockdown. En statistisk signifikant forskyvning i dose-responskurve ble observert i OVCAR-3 (p 0,05, figur 3B), men ikke SK-OV-3 ytterligere å demonstrere motstand av OVCAR-3 til cisplatin på
CCNE1
inhibering. I samsvar med dette funnet, cisplatin ikke hadde noen differensial virkning på cellelevedyktighet i
CCNE1
knockdown celler sammenlignet med kontroller siRNA i to av de tre ekstra 19q12 forsterkede linjer (Kuramochi og OVCAR-4) (figur 3C). I motsetning til dette genet knockdown forbedret effekt av cisplatin på cellelevedyktighet i begge cellelinjer med lav baseline
CCNE1
uttrykket (OVCAR-8 og 19q12 unamplified styreledningen IGROV-1).
( A) Celleviabilitet etter transfeksjon med individuelle sirnas og cisplatin behandling normalisert til cisplatin-behandlede kontrollceller uten siRNA. Cisplatin dose på 3 uM eller 6 uM ble anvendt for OVCAR-3 og SK-OV-3-celler respektivt. Gjennomsnitt normalisert absorbans (490 nm) fra tre uavhengige analysene MTS (triplikate brønner pr tilstand) og SEM plottet (n = 3). (B) Cisplatin dose respons etter transfeksjon med
CCNE1
eller ikke-tie siRNA i OVCAR-3 og SK-OV-3 cellelinjer. Pil viser medikamentell behandling dose brukt i startskjermen; p-verdien indikerer betydningen av forskjellen mellom montert kurver. Gjennomsnittlige normaliserte MTS assay absorbans til celler uten cisplatinbehandling, SEM og fire-parameters tilpasset Hill skråning plottes (n = 3 for hver medikamentkonsentrasjon). (D) Celleviabilitet etter transfeksjon med
CCNE1
eller NS sirnas og cisplatin behandling normalisert til cisplatin behandlet ingen siRNA kontrollceller for hver cellelinje. Statistisk signifikans beregnet ved å sammenligne med NS siRNA, cisplatin-behandlede celler i samme cellelinje. Gjennomsnittlige normaliserte absorbans fra MTS-analyse og SEM plottet (n = 3). Se tabell S4 for cisplatin behandlingsdoser.
For å undersøke cisplatin resistent fenotype observert i ovčar-3 celler med
CCNE1
knockdown, brukte vi flowcytometri å analysere cellesyklus distribusjon følgende cisplatin behandling. Cisplatin behandling av OVCAR-3 resulterte i en forlenget S-fasen (figur 4A), mens SK-OV-3-celler arrestert hovedsakelig i G2-fasen av cellesyklus (figur 4B). I samsvar med kravet til Cyclin E1 i G1 /S overgang [18],
CCNE1
siRNA knockdown indusert G1 arrest i OVCAR-3, mest tydelig i nærvær av cisplatin (figur 4A). I motsetning til cellesyklusen fordeling av SK-OV-3 var uforandret ved inhibering av
CCNE1
uttrykk med eller uten cisplatin (figur 4B). Disse observasjonene var konsekvent i
CCNE1
forsterket Kuramochi og OVCAR-4 celler (Figur S3). Delvis G1 arrest ble også observert i 19q12 unamplified IGROV-1 celler etter
CCNE1
knockdown, men bare i respons til cisplatin behandling. Som observert i levedyktighet analysen, etter
CCNE1 forsterket men lave-uttrykke OVCAR-8 celler oppførte seg på samme måte til å kontrollere linjer. Vi konkluderer derfor med at avhengigheten av OVCAR-3, Kuramochi, og OVCAR-4 høie
CCNE1
ekspresjon resulterte i en cellesyklus-stans etter genet knockdown, også i nærvær av cisplatin, mest sannsynlig regnskap for den tilsynelatende cisplatin motstand observert i kortsiktige levedyktighet analyser.
(A) OVCAR-3 celler og (B) SK-OV-3 cellesyklusen profil (til venstre) og andel av celler i G1, S eller G2 fase ( høyre) for PI fargede celler analysert ved flowcytometri 72 timer etter transfeksjon med
CCNE1
eller NS siRNA med eller uten cisplatin behandling (3 mikrometer eller 6 mikrometer for OVCAR-3 og SK-OV-3 celler henholdsvis).
for å forstå den langsiktige virkningen av
CCNE1
utarming på celle overlevelse etter cisplatin behandling vi analysert den clonogenicity linjer med og uten forsterkning av 19q12 locus (se skjematisk figur 5A ).
CCNE1
knockdown dypt redusert klonogene kapasiteten OVCAR-3, men ikke SK-OV-3 i fravær av medikament (figur 5B og 5C). I motsetning til økt motstand mot cisplatin i kortsiktige cytotoksisitetsassayer,
CCNE1
demping redusert klonogene overlevelse av OVCAR-3-celler etter cisplatin behandling (figur 5B). Vi gjorde ikke utforske
in vivo
effekter av
CCNE1
knockdown i eggstokkene tumor linjer med 19q12 forsterkning, som vi ikke var i stand til å generere levedyktige linjer med stabil lentivirus integrering av kort hårnål RNA (shRNA) rettes til
CCNE1 plakater (data ikke vist).
(A) Eksperimentell tidsforløpet for klonogene overlevelse analyse etter siRNA transfeksjon og cisplatin behandling. Representative krystallfiolett farget (B) SK-OV-3, og (C) OVCAR-3 kolonier (topp) og gjennomsnittlig andel av adskilte kolonier dannet (nederst) sammenlignet med kontrollceller uten siRNA eller en time cisplatinbehandling (3 pM eller 6 pM for OVCAR-3 og SK-OV-3-celler henholdsvis). Feilfelt indikerer SEM (n = 3), ** p-verdi. 0,001
CCNE1
forsterkning er prediktive for dårlig resultat i primærsvulster
CCNE1
kopiantall ble målt i 43 primær ovarietumorer fra pasienter med avansert stadium, serøs invasiv sykdom. I tillegg inkluderte vi data fra 52 tumorer fra vårt tidligere genomisk analyse av platina-resistens i ovarialkreft [3] og oppnådd som samsvarer med genuttrykk data for alle prøver [17]. Alle pasientene gjennomgikk primær kirurgi etterfulgt av platina-basert kjemoterapi. Klinisk informasjon som brukes til å korrelere
CCNE1
status med overlevelse hadde over to år med ytterligere akkumulert pasientoppfølgingsdata (per juni 2010) fra våre tidligere studier.
Pasientene ble stratifisert basert på
CCNE1
kopiantall status som vurderes av qPCR (se Materialer og metoder). Ingen forskjell ble observert mellom kliniske kjennetegn ved hver gruppe bortsett fra alder, med yngre pasienter over-representert i
CCNE1
unamplified gruppe (tabell 1 og figur 6A).
CCNE1
genuttrykk viste en sterk sammenheng med kopi nummer (figur 6B) og begge ble korrelert med progresjonsfri overlevelse (PFS) (figur 6C D).
CCNE1
kopiantall, men ikke genekspresjon, ble også forbundet med total overlevelse (OS) (figur 6E F). Den mest signifikant korrelasjon observert var graden av
CCNE1
gevinst og PFS (figur 6C), slik at alle saker med høyt nivå forsterkning viste progressiv sykdom i løpet av ca tolv måneder fra diagnose (gjennomsnittlig PFS på 10,7 måneder, tabell 1 ).
(A) pasient~~POS=TRUNC stratifisert etter
CCNE1
forsterkning status. Kruskal-Wallis p-verdi rapportert, linjene viser gjennomsnittlig og SEM. (B) Sammenheng mellom
CCNE1
kopiere nummer av qPCR og genuttrykk signal ved mikromatriser. (C) Kaplan-Meier analyse av
CCNE1
unamplified (n = 68), fikk (n = 21) og forsterket (n = 6) eggstokkreft kreftpasienter og (D)
CCNE1
lav (n = 31), middels (n = 28) og høy (n = 36) som uttrykker prøver for progresjon overlevelse og (E 1 x 10
-5) (B) Betydningen av kopiantall sammenheng til
CCNE1
forsterkning på tvers av kromosom 20. Betydningen terskel brukes for å definere korrelasjonstopp grenser som er angitt ved stiplet linje. (C)
TPX2
uttrykk sammenheng med locus kopiantall og
CCNE1
uttrykk (kilde: TCGA). (D) Korrelasjonen av
CCNE1 Hotell og
TPX2
genuttrykk i et uavhengig datasett (Tothill et al., 2009).
For å begrense genet kandidater innenfor de tre regionene mest sannsynlige til å samhandle med
CCNE1
, vi neste korrelert uttrykket av gener innenfor hver region med
CCNE1
uttrykk (tabell 2). Uttrykk for
TPX2
var mest signifikant assosiert med
CCNE1
uttrykk, og ble også korrelert til sin egen forsterkning status (figur 7C). Forholdet mellom
CCNE1 Hotell og
TPX2
genekspresjon ble ytterligere bekreftet i en andre uavhengige datasett (figur 7D). Den sterke sammenhengen mellom
TPX2 Hotell og
CCNE1
forsterkning og uttrykk ble spennende gitt at TPX2 er en centromeric protein nødvendig for mitotisk spindel funksjon under celledeling [22].
20q11 forsterkning gjør cellene er resistente mot TPX2 knockdown
for å teste om det var en funksjonell avhengighet av
TPX2
i cellelinjer med forsterkning av 20q11 locus og om det kommuniserer med
CCNE1
, vurderte vi
TPX2
status på linjer som brukes for våre knockdown eksperimenter.
TPX2
ble forsterket (figur 8A) og over-uttrykt (figur 8B) i alle tre
CCNE1
forsterkes og over-uttrykker cellelinjer (ovčar-3, OVCAR-4 og Kuramochi) sammenlignet til styreledningen, SK-OV-3. I tillegg har vi ytterligere identifisert OAW-28 som har høyt nivå 20q11 forsterkning (figur 8A, data fra Sanger Cancer Genome Project Arkiv), og det høyeste nivået av genekspresjon på tvers av de testede cellelinjer (figur 8b).
(A) Affymetrix SNP 6,0 mapping microarray kopiantall av kromosom 20 i eggstokkene tumor cellelinjer som angir plasseringen av
TPX2
. (B) Sammenheng mellom
TPX2
kopiere nummer og genuttrykk ved qPCR i cellelinjer. (C) Celleviabilitet avbildet som normalisert MTS absorbans (490 nm) fra tre uavhengige analyser til celler behandlet uten siRNA i siRNA dobbel knockdown eksperimenter. Gjennomsnittlige normaliserte absorbans fra MTS-analyse og SEM plottet (n = 3). (E) TPX2 protein uttrykk ved western blot for å bekrefte siRNA-mediert knockdown ved eksperimentelle endepunktet for cellelinjer og CCNE1 i OAW-28 celler.
I motsetning til det nære forholdet mellom
CCNE1
forsterkning og cellulær følsomhet for genet knockdown, en invers sammenheng ble observert mellom
TPX2
kopiere antallet og effekten av
TPX2
siRNA (figur 8C). For eksempel SK-OV-3 celler med lav genekspresjon (figur 8B) og minimal påviselig TPX2 protein (figur 8D), var svært følsomme for genet knockdown, mens OAW-28 celler var hovedsakelig resistente. RT-PCR (figur S4) og western blot (figur 8D) analyser som viste effektiv knockdown av
TPX2
, men protein var fortsatt påvises i enkelte cellelinjer som i utgangspunktet hadde høye nivåer av TPX2 protein. Vi har også observert at knockdown av
CCNE1
resulterte i redusert
TPX2
genuttrykk i 19q12 forsterket linjer (figur S4 A) tankevekkende at
er TPX2
uttrykk påvirket nedstrøms Cyclin E1 .
Gitt sammenhengen mellom
CCNE1 Hotell og
TPX2
forsterkning, vi også undersøkt om samtidig knockdown av både gener vil ytterligere redusere levedyktigheten i cellelinjer som inneholder både presiseringer (figur 8C ). Etter at vi åpnet for en konkurransedyktig effekt av å kombinere siRNAs (se Methods) ingen åpenbar interaksjon ble observert med samtidig knockdown av
TPX2 Hotell og
CCNE1
. Knockdown av
CCNE1
hatt minimal effekt på OAW-28 celle levedyktighet til tross for effektiv protein reduksjon i doble knockdown eksperimenter (figur 8D). Dette funnet er i samsvar med våre første resultatene, som OAW-28 cellene ikke har 19q12 forsterkning (se Figur S1 for OAW-28 kopiantall på dette locus).
Diskusjoner
Vi utførte første systema siRNA knockdown av alle gener innenfor minimal definert 19q12 amplicon i eggstokkreft viser at
CCNE1
er nøkkelen onkogene målet. Gitt kjente roller av Cyclin E1 i kreft, inkludert de-regulering av cellesyklus og fremme genomiske ustabilitet, var det sannsynlig at føreren av 19q12 locus, men andre gener som ikke er blitt utelukket. For eksempel
C19orf2
, som er rett ved siden av
CCNE1
, har nylig blitt kommentert å kode URI, en ukonvensjonell prefoldin protein. Studier av
C. elegans
URI homolog foreslå et engasjement i kromatin remodeling, forebygge og /eller reparasjon av endogen gentoksisk DNA-skader og vedlikehold av genomet integritet [23]. Mer nylig, URI er blitt identifisert som en nøkkel inhibitor av proteinfosfatase 1γ (PP1γ) og er involvert i regulering av mTOR /S6K1 overlevelsesreaksjonsveien basert på næringsstoffer og vekstfaktor tilgjengelighet [24]. Til tross for disse spennende biologiske foreninger, fant vi ingen bevis for URI som en driver av 19q12 locus.
Reduksjon i celle levedyktighet etter
CCNE1
knockdown var spesifikk for cellelinjer med 19q12 forsterkning, med begrenset eller ingen effekt i ikke-forsterket linjer, noe som indikerer en «avhengighet» [25] til
CCNE1
deregulering. Våre funn validere en fersk rapport som viser forsterkning spesifikke følsomhet for
CCNE1
demping i OVCAR-3 og IOSE-29 celler [26]. Unamplified linjer ut til å omgå siRNA mediert G1 /S sjekkpunkt og apoptose, muligens gjenspeiler
CCNE1
uavhengige mekanismer for cellesyklus de-regulering og distinkte onkogene prosesser. Interessant nok har økt uttrykk av CCNE1 nylig vist i serøs tubal intraepitelial karsinom (STIC), en foreslått forløper for høyverdig serøs kreft [27]. Dette funnet styrker betydningen av
CCNE1
de-regulering i eggstokkreft og antyder er det en tidlig krav i tumor evolusjon.
19q12 forsterkning er sterkt assosiert med primær behandlingssvikt i ovarietumorer [3 ], og er derfor både en potensiell prognostisk markør og terapeutisk mål. Etter å ha identifisert
CCNE1
som føreren av 19q12 forsterkning vi søkt å forstå hvordan den bidrar til primær behandlingssvikt. I korttids cytotoksisitetsassayer, over-uttrykk for cyclin E1 øker følsomheten for cisplatin [12].
