Abstract
En spredning-induserende ligand (april) er sterkt uttrykt i tykk- og endetarmskreft (CRC) vev og cellelinjer. Men de biologiske funksjoner og presise signaler utløst av april i CRC er ikke fullt ut forstått. Her har vi brukt små interfering RNA selektivt utarme april og til å bestemme sine tumorigene effekter i en CRC cellelinje SW480 både
in vitro Hotell og
in vivo
. Knockdown av april i SW480 celler var assosiert med modulering av celleproliferasjon, samt reduksjon av celle migrasjon og invasjon
in vitro
. Videre april-knockdown SW480 celler vises markert hemmet tumorvekst og redusert metastaser til leveren i immunodeficient mus ved subkutan injeksjon. Viktigere, observerte vi at nedregulering av april i SW480 celler resulterte i sterkt redusert aktivitet av phosphoinositide 3-kinase (PI3K) /Akt veien. I tillegg observerte vi at rekombinant human april mediert aktivering av PI3K /Akt reaksjonsveien i CRC-celler som resulterer i indusert ekspresjon av viktige cellesyklusproteiner og matriksmetalloproteinaser i et PI3K /Akt avhengig måte. Dette var samtidig med markert cellevekst levedyktighet samt økt celle migrasjon og invasjon. Sammen utgjør disse overbevisende data tyder på at april-indusert tumorigenesis og metastasering av CRC-celler kan utføres ved aktivering av PI3K /Akt pathway. Disse funnene kan føre til en bedre forståelse av de biologiske effektene av april og kan gi ledetråder for å identifisere nye terapeutiske og forebyggende molekylære markører for CRC
Citation. Wang G, Wang F, Ding W, Wang J, Jing R, Li H, et al. (2013) april induserer tumordannelse og metastasering av tykktarmskreft celler via Aktivering av PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 8 (1): e55298. doi: 10,1371 /journal.pone.0055298
Redaktør: Claudio M. Costa-Neto, Universitetet i São Paulo, Brasil
mottatt: 19 september 2012; Godkjent: 20 desember 2012; Publisert: 29 januar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (tall 81201351 og 81201350). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er et stort folkehelseproblem i USA og globalt. I USA, er det den tredje vanligste kreftformen og den tredje største årsaken til kreft dødelighet hvis menn og kvinner vurderes separat [1]. Forekomst av metastaser på grunn av tumorprogresjon er årsaken til de fleste kreftrelaterte dødsfall. Til tross for mye fremgang i diagnostiske og terapeutiske metode, prognosen for CRC pasienter forblir fattige. Nylig, fremskritt innen molekylærbiologi har ført til økt kunnskap om mekanismene bak CRC utvikling. Siste storskala sekvensering og andre genomiske analyser av menneskelige kolorektal tumorer tyder på at det er opp til 80 nonsilent mutasjoner i hver svulst, og at enkelte svulster har forskjellige mutasjoner. Selv om mutasjoner er mange og varierte, klassifisering av vanlige og sjeldne mutasjoner avdekket at 38 veier er avbrutt med bestemt frekvens, og mange av disse banene krysser phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signal- [2]. Den PI3K signalveien spiller en avgjørende rolle i kreftcelle spredning, overlevelse, metabolisme, motilitet og invasjon. Det er ofte deregulert i CRC celler, noe som gjør det til et attraktivt terapeutisk mål [2], [3], [4]. Oppregulert cytokiner, vekstfaktorer og deres reseptorer observeres i CRC-celler via PI3K sannsynligvis representerer et hovedbidrag til tumorgenese.
april (en spredning-induserende ligand, også kjent som TRDL-1, TALL-2, og TNFSF13 ), er et medlem av tumornekrosefaktor (TNF) superfamilien, med homologe struktur og funksjon til flere andre cytokiner i denne familien. Det ble oppdaget som et cytokin over-uttrykt av transformerte celler, og kunne stimulere cellulær proliferasjon [5], [6]. APRIL uttrykkes hovedsakelig av tumorvev som tykktarmskreft, bukspyttkjertelkreft, magekreft, og ved normale immunceller slik som B-celler, monocytter, makrofager, dendrittiske celler, neutrofiler, epiteliale celler, T-celler, og etter noen ikke-immunceller slik som osteoklaster. Nyere studier har analysert svulsten fremmende rolle april hos pasienter med hematologiske maligniteter eller med solide tumorer. Avvikende ekspresjon av april og den påfølgende aktivering av pro-overlevelsesreaksjonsveier kan tillate overlevelse av flere hematologiske maligniteter [6], [7], [8], [9]. I solide tumorceller, har studier vært begrenset til spredning eller overlevelse aktivitet implisert i den naturlige vekst av tumorer, som er i overensstemmelse med den aktuelle konseptet at inflammatoriske reaksjoner utgjør en viktig del av tumorutvikling [5], [10], [11 ]. Det er ulike meninger om utskillelsen av april produsert av kreftceller eller tumor-infiltrerende celler. Mhawech-Fauceglia et al [10] viste at tumor-infiltrerende nøytrofile stede i stomien i stedet for kreftceller, var den største kilden til april. Dette er i motsetning til en nylig studie av V Lascano et al [12], som viste at april produseres av både tumor- og ikke-tumorceller hadde en klar tumor-fremmende effekt i kolorektal tumorigenesis. Men nedstrøms signalkaskader aktiveres av april som kan være involvert i tumordannelse har ennå til å være preget. Vi har nylig bekreftet at april er overuttrykt i fordøyelsessystemet karsinom, spesielt i tykktarm og bukspyttkjertel [13], [14], [15]. April er mer høyt uttrykt i tumorer enn i normal tykktarm og april-knockdown hemmet migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler in vitro [16]. Videre serum APRIL nivåer målt ved ELISA i pasienter med kreft i bukspyttkjertelen antydet at april har en positiv diagnose og prognose verdi for kreft i bukspyttkjertelen [15]. Disse foreløpige undersøkelser tyder på at april kan ha en viktig rolle i kreftutvikling og tumorprogresjon.
Denne studien undersøkte rollen april i kolorektal kreftutvikling og preget april-mediert signaltransduksjon. Menneske CRC cellelinjer og immunsvikt mus ble brukt for å evaluere effektene av knockdown av april på viktige trekk ved kreftfremkallende og metastatisk prosess. Vi vurderte rolle april i celleproliferasjon, cellesyklus, migrering og invasjon i CRC-cellelinjer og identifisert de tilhørende molekylære og cellulære komponenter. Ved hjelp av disse CRC celler og xenograft modell vev, foreslår vi at april kan være relatert til tumorigenesis og metastasering. Videre observerte vi at april stimulering formidlet PI3K /Akt pathway signaler som er involvert i regulering av cellesyklus og invasjon av carcinoma celler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studieprotokoller ble godkjent av Animal Care og forskningsetiske komiteen, College of Medicine, Nantong University. Alle dyr arbeidet ble gjennomført i henhold til gjeldende retningslinjer (Kontrakt 2010-0089). Alle pasientene ga sin skriftlig informert samtykke til å delta i studien.
Pasienter og prøver vev
CRC vev ble samlet inn fra kirurgisk fjerning eksemplarer av åtte pasienter som ikke hadde gjennomgått strålebehandling eller cellegift i Affiliated Hospital of Nantong Universitetet mellom april 2008 og mai 2009. alderen varierte fra 45 til 71 år, med en gjennomsnittsalder på 56,9 år. Hannen: Kvinneandelen var 5: 3. Diagnosen ble bekreftet histologisk i alle tilfeller. Vevsprøver ble umiddelbart behandlet etter kirurgisk fjerning. Protein ble analysert i åtte snap-frosset tumorous og tilstøtende nontumorous vevsprøver som ble lagret ved -80 ° C.
Cell kultur og reagenser
Alle menneskelige CRC cellelinjer (SW480, HT-29 Colo-205, HCT-116) ble hentet fra Academy of Life Science, Shanghai, Kina og ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen, San Diego, CA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone , Logan, USA) og antibiotika (100 mg /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin) ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2. Menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVEC) ble hentet fra Fmgbio, Shanghai, Kina og ble opprettholdt i DMEM /F12 (Gibco). GM6001, LY294002 ble kjøpt fra Chemicon (Temecula, CA, USA). Rapamycin ble oppnådd fra Sigma. Rekombinant human april (rhAPRIL) ble innkjøpt fra Peprotech Inc. (USA).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for påvisning av utskilte APRIL
CRC-cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2 i DMEM med 0.5% FBS i 72 timer. Cellekultursupernatanter ble oppsamlet, og konsentrasjonen av april ble målt ved anvendelse av et humant april ELISA-sett (R MMP-2, GATGCCGCCTTTAACTGG og TCAGCAGCCTAGCCAGTCG; MMP-9, GCACCACCACAACATCACCTAT og CACAACTCGTCATCGTCGAAA; TIMP-1, CAGAAGTCAACCAGACCACCT og ATTCCTCACAGCCAACAGTG; GAPDH, ACGCATTTGGTCGTATTGGG og TGATTTTGGAGGGATCTCGC. GAPDH ble screenet som kontroll husholdningsgenet. PCR-produktene ble kjørt på en 1,5% agarosegel farget med etidiumbromid og synliggjort ved UV-belysning. Bånd ble kvantifisert ved densitometri hjelp ImageJ programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/).
Celleproliferering analysen
celleproliferasjon analyser in vitro ble utført ved hjelp av en mobiltelefon telle Kit-8 (CCK-8; Donjindo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. shAPRIL SW480 celler, shNTC SW480 celler og nontransfected SW480 celler ble sådd i 96-brønners plater i DMEM med 0.5% FBS ved en tetthet på 4 x 10
3 celler /brønn. April-stimulerte HCT-116 celler ble sådd i 96-brønners plater i DMEM som inneholdt 0,5% FBS i nærvær av 100 ng /ml rhAPRIL, 400 ng /ml rhAPRIL, 800 ng /ml rhAPRIL eller PBS (kontrollgruppe). Cellene i hver gruppe ble belagt i tre eksemplarer. Ved 24, 48, 72 og 96 timer, den optiske tettheten ved 450 nm bølgelengde som korrelerer med antallet levedyktige celler ble målt, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt av A450 ± SEM.
cellesyklusanalyse
for cellesyklusanalyse, april-stimulerte celler ble dyrket med rhAPRIL i 24 timer, og shAPRIL cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon. Cellene ble deretter vasket med PBS, fiksert i 70% etanol i en time ved 4 ° C og deretter inkubert med 1 mg /ml RNase A i 30 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene farget med propidiumjodid (PI, 50 ug /ml) (Becton Dickinson, San Jose, CA) i PBS, 0,5% Tween-20, og analysert ved bruk av et Becton Dickinson flowcytometer BD FACScan (San Jose, CA) og Cell quest oppkjøp og analyseprogrammer.
Western blot analyse
Protein lysates ble separert med 10% SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med TBS inneholdende 0,1% Triton X-100 og 5% fettfri melk inkubert med primære antistoffer. De primære antistoffer var anti-human april (BD, NJ, USA), anti-Pakt, anti-Akt, anti-mTOR, anti-p-mTOR (Cell Signaling), anti-c-myc, anti-cyclin D1, anti -CDK4, anti-p-Rb anti-β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). HRP-konjugert mus-immunoglobulin ble anvendt som det sekundære antistoff. Signal-påvisning ble utført med et ECL system (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Bånd ble kvantifisert ved densitometri hjelp ImageJ programvare. Integrerte tetthetsverdiene for fosforylerte proteiner ble normalisert til total-protein for hver prøve. Ikke-stimulerte eller ikke-transfekterte celler ble gitt en verdi på 1,0, og graden av fosforylering i alle andre prøver ble normalisert til denne verdien.
bølgen og migrasjons assays
tumorcelle-invasjon ble målt ved å undersøke celle invasjon gjennom Matrigel (BD, USA) -belagte polykarbonat filtre (8-mikrometer porestørrelse) ved hjelp av Transwell invasjons kamre (Costar, VWR Albertslaund, Danmark). I korthet, etter 48 timer med transfeksjon, SW480 celler, inkludert shAPRIL transfekterte celler og shNTC transfekterte celler ble trypsinert, og 10
5-celler suspendert i 100 ul DMEM med 0,5% FBS ble sådd ut i det øvre kammer. For april-stimulerte HCT-116 celle invasjon analysen ble parallellforsøk utført i nærvær av rhAPRIL ved en konsentrasjon på 100 ng /ml i 0,5% FBS mediet i det øvre kammeret. Det nedre kammer inneholdt 600 ul DMEM medium med 10% FBS. Etter inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator i 72 timer ble celler på den øvre overflaten av filteret fjernet ved å gni med en bomullspinne. Migrerings analyser med 10
6-celler per brønn ble inkubert i 48 timer ble utført ved bruk av samme fremgangsmåte, men med ubelagte polykarbonatfiltere. Hvor angitt, ble cellene sådd ut innsatsene med GM6001, eller det samme volum av DMSO (Sigma). GM6001 ved en konsentrasjon på 10 uM i 0,5% FBS media oppløst i DMSO ble tilsatt til mediet for å hemme MMP i celle invasjon analyser. Celler som er festet til den nedre overflate av membranen ble farget med 0,1% krystallfiolett og deretter tellet ved mikroskop. Celler ble undersøkt, tellet og fotografert ved 100 x forstørrelse i henhold til et invertert mikroskop. Fem forskjellige områder ble tellet pr filter i hver gruppe, og hvert eksperiment ble gjentatt i triplikat. Det betyr av fem enkelte felt på tilfeldig valgte ble oppnådd for hver brønn.
Måling av MMP-2 og MMP-9 produksjon
MMP-2 og MMP-9 aktiviteter ble bestemt ved å bruke en kvantitativ sandwich-enzym immunoassay teknikk. CRC-celler ble sådd på 96-brønners plater ved en konsentrasjon på 4 x 10
3 celler pr brønn i DMEM med 0.5% FBS i tre dager. Nivåene av utskilt MMP-2 og MMP-9 i kultursupernatantene ble bestemt ved hjelp av ELISA. Analysen ble utført ved hjelp av Quantikine MMP-2 og MMP-9-sett (R 0,05
Resultater
Uttrykk for april er oppregulert i CRC vev og cellelinjer
Vi undersøkte enten april uttrykk ble oppregulert i vev ved å undersøke prøver fra åtte CRC kreftpasienter som bruker western blot analyse. April ekspresjon på proteinnivået var sterkt forhøyet i alle CRC vev som ble testet sammenlignet med tilstøtende normale vev (Fig. 1A). Dette tyder på en mulig rolle for april i kreftutvikling eller progresjon i tykktarmen. April mRNA ble detektert ved relativt høyere nivåer i en rekke humane cellelinjer CRC sammenlignet med humane umbilikalvene endotelceller, selv om nivåene av april forskjellig. April ble oppdaget ved relativt høyere nivåer i SW480 og HT-29 celler og ble intermediært uttrykt i Colo-205 celler. April ekspresjon ble påvist i svakt HCT-116-celler (Fig. 1B). De menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HCT-116 og SW480 ble valgt som modellsystem for vår forskning. For å redusere april uttrykk, utviklet vi to korte hårnål RNA (shRNA) betegnes sh637 og sh1750 [17] som var rettet mot den menneskelige april genet (shAPRIL) og forårsaket betydelig reduksjon av april uttrykk sammenlignet med nontargeting kontroll transfektert (shNTC) og nontransfected celler . Etter shRNA transfeksjon, ble betydelig knockdown av APRIL transkriptet observert i SW480-celler ved (1D Fig.) Nivåer både mRNA (fig. 1C) og protein. April ekspresjon målt ved hjelp av ELISA i CRC cellekultursupernatanter vist at cellelinjene utskilt forskjellige nivåer av oppløselig april, noe som bekreftet at april er et utskilt protein (fig. 1 E).
(A) Western blot-analyse av april i åtte par kolorektal tumorer (T) og tilstøtende normalt vev (N). # 1-8 viser pasientenes tall. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (B) semikvantitativ RT-PCR analyse av april uttrykk i fire menneske CRC cellelinjer (SW480, HT-29, Colo-205 og HCT-116). HUVECs ble anvendt som en negativ kontroll og GAPDH var en intern kontroll. (C) SW480-celler ble transfektert med shRNA rettet mot nontargeting kontroll (shNTC) eller humant april genet (sh637, sh1750), og etter 48 timer ble april mRNA nivå bestemt av semikvantitativ RT-PCR. GAPDH var en intern kontroll. (D) SW480-celler ble transfektert med shNTC eller shAPRIL, og etter 48 timer ble APRIL protein nivåer bestemt ved Western blot. β-aktin var en intern kontroll. (E) CRC cellelinjer og shAPRIL-transfekterte SW480 celler ble dyrket i 72 timer, og supernatantene ble samlet og vurdert for utskilt april med ELISA.
Den biologiske effekten av april på kolorektal kreftceller
for å analysere virksomheten til april på CRC, undersøkte vi effekten av april knockdown og aPRIL stimulering på celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i den menneskelige CRC cellelinjer HCT-116 og SW480. CCK-8 assay cellevekst levedyktigheten ble bestemt 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon og april stimulering. Vi har observert en signifikant reduksjon i cellevekst levedyktighet i sh637 transfekterte SW480-celler (
P
0,05, Fig. 2A), og en betydelig øket cellevekst levedyktighet i rhAPRIL (400 ng /ml, 800 ng /ml ) stimulert HCT-116 celler (
P
0,05, fig. 2B) sammenlignet med respektive kontroller. For å undersøke hvilken rolle april i CRC celle invasjon og metastasering, utførte vi celle migrasjon og invasjon analyser, som ble ansett som viktig
in vitro
egenskaper knyttet til malignitet av cellene. CRC-celler transfektert med sh637 eller stimulert med rhAPRIL (100 ng /ml) påvirkes i betydelig grad antallet trekkende og invaderende celler festet til den nedre overflaten av membranen, sammenlignet med kontrollceller (
P
0,05; fig . 2D og E). Knockdown av april resulterte i signifikant suppresjon av cellemigrering og celle invasjon av et rekonstituert basalmembran (Matrigel), mens rhAPRIL (100 ng /ml) behandling dramatisk økt CRC cellemigrering og invasjon. Våre MTT-analyser viste at behandling med 100 ng /ml rhAPRIL ikke merkbart øke spredning av HCT-116 celler (fig. 2C), som tyder på at april indusert cellemigrering ikke var assosiert med økt celleproliferasjon. Spredning og invasjons analyser ble også utført i sh1750 transfektert SW480-celler, og resultatene var i samsvar med sh637 transfekterte celler (data ikke vist). Tatt sammen, disse resultatene sterkt at april spiller en viktig rolle i tumorigenese og metastasering av CRC-celler.
(A) shAPRIL transfeksjon signifikant redusert cellenes levedyktighet ble analysert ved CCK-8 i SW480 celler sammenlignet med den nontransfected og shNTC transfektert kontroller. Dataene representerer gjennomsnitt ± SEM; *
P
0,05 sammenlignet med shNTC. (B) rhAPRIL (400 ng /ml eller 800 ng /ml) stimulering betydelig forbedret cellelevedyktighet i HCT-116-celler sammenlignet med nonstimulated celler; *
P
0,05. (C) Behandling med 100 ng /ml rhAPRIL ikke i betydelig grad øke spredning av HCT-116-celler. (D og E) cellemotilitet gjennom ubestrøket filtre (migrasjon) og gjennom Matrigel-belagte filtre (invasjon) i shAPRIL-transfekterte SW480 celler, rhAPRIL-stimulert HCT-116 celler og deres respektive kontroller. Celler ble farget med krystallfiolett, visualisert med mikroskopi, og telles. (D) Antall celler som hadde invadert ble regnet i fem representant lavt strømforbruk (× 100) felt (LPFs) per Transwell inn. Alle bestemmelser ble utført in triplo i minst tre uavhengige eksperimenter. Tallene representerer gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05 versus kontroller. (E) Representant eksempel på D. Scale bar, 40 mikrometer.
APRIL-knockdown hemmer tumorvekst og metastasering av SW480 celler in vivo
Som APRIL påvirket tumorcellevekst og invasjon
in vitro
, vi neste undersøkt om april påvirket atferden til svulster
in vivo
i hårløse mus BALB /c, som er immunodeficient og utsatt for tumordannelse og metastasering. Mus ble injisert subkutant i høyre flanke med ikke transfektert SW480, shAPRIL (sh637) transfektert SW480 eller shNTC transfektert SW480 celler. Tumorveksten ble betydelig redusert hos mus injisert med april-knockdown (shAPRIL) SW480-celler (
P
0,05) sammenlignet med mus injisert med siRNA kontroll (shNTC) og ikke-transfekterte celler (kontroll) (fig. 3A, B og C). Totalt antall av metastatiske noduler lever ( 0,5 mm) i individuelle mus ble tellet under et kirurgisk teleskop. Totalt antall metastatiske knuter er vist i tabell 1. metastatisk lever knuter ble bekreftet histologisk og representant hematoxylin og eosin farget bilder er vist i fig. 3D. Det er ingen lungemetastaser ble funnet i noen av de tre gruppene. Sammenlignet med nontransfected og shNTC transfektert SW480-celler, april-knockdown SW480-celler viste redusert metastaser til leveren i nakne mus (tabell 1, fig. 3D). Levermetastatiske knuter ble observert i nontransfected SW480 (n = 89) og shNTC SW480 gruppe (n = 78), mens tre knuter ble funnet i april-knockdown SW480 gruppe (
P
0,05) ( tabell 1). Selv om shNTC gruppe dannet færre metastatiske knuter enn nontransfected gruppe, dette var ikke statistisk signifikant (
P
0,05). Disse resultatene tyder på at april spiller en nøkkelrolle i den kreftfremkallende og metastatisk prosess med SW480 celler
in vivo
.
(A) Nude mus ble injisert subkutant i høyre flanke med kontrollceller, shNTC transfekterte celler og shAPRIL (sh637) transfekterte celler. (B) En prøve svulst fra hver gruppe er vist. (C) Tendens av tumorvekst etter injeksjon i nakne mus i forskjellige grupper. Tumor volum ble målt ved verniercaliper i cm
3. (D) Totalt antall metastatiske noduler lever ( 0,5 mm) i individuelle mus ble tellet under et kirurgisk teleskop. Representant hematoxylin og eosin farging av 4-mikrometer deler av lever fra shAPRIL og shNTC grupper vises. Pil viser tumornoduler. Scale bar, 100 mikrometer. (E) Western blot og immunhistokjemi av april i svulster i nakne mus fra hver gruppe. (F) Immunhistokjemisk analyse av p-Akt, p-mTOR, Ki-67, cyclin D1, CDK4, p-Rb, MMP-2 og MMP-9 i tumorer fra nakne mus injisert med shNTC eller shAPRIL SW480 celler. Scale bar, 40 mikrometer.
april stimulerer PI3K /Akt sti i CRC celler
PI3K /Akt veien har blitt rapportert til å spille en avgjørende rolle i celleproliferasjon , migrering og invasjon av forskjellige krefttyper. Videre TNF-superfamilien medlemmer APRIL og B-celle-aktiverende faktor (BAFF), ved inngrep med deres reseptorer har nylig blitt vist å aktivere PI3K /Akt banen i maligne B-celler [18], [19]. Dermed fant vi ut om PI3K /Akt veien var involvert i april-mediert cellulær respons i solide tumorceller. Akt er et substrat for PI3K, og mammalian target of rapamycin (mTOR) er en stor nedstrøms effektor av Akt. Vi evaluerte effekten av april-knockdown på PI3K /Akt sti i SW480 celler ved å måle fosforylering profil Akt og mTOR. APRIL-knockdown redusert fosforylering av Akt og mTOR i SW480 celler ved hjelp av Western blot (Fig. 4A). Vi undersøkte også om april påvirket Akt og mTOR fosforylering
in vivo
. I mus tumorvev med april slå ned, redusert p-Akt og p-mTOR proteininnhold ble observert ved immunhistokjemi (Fig. 3F, øvre panel). Vi neste undersøkte effekten av april stimulering på PI3K /Akt sti i HCT-116 celler. Økende konsentrasjoner av rhAPRIL i HCT-116-celler stimulert fosforylering av Akt og mTOR, detektert 3 t etter april stimulering på en doseavhengig måte (fig. 4B). Deretter forbehandling med LY294002, en syntetisk hemmer av P110 katalytiske subenhet av PI3K, ble brukt til å undersøke mulige involvering av PI3K i april-mediert Akt og mTOR fosforylering i CRC celler. Forbehandling av HCT-116 celler med LY294002 betydelig hemmet APRIL-indusert Akt og mTOR aktivitet, noe som tyder på at Akt og mTOR fosforylering i respons til april var PI3K avhengig (fig. 4C).
(A) SW480 celler ble transfektert med shAPRIL (sh637) og shNTC for 48 timer og analysert for Akt og m-TOR fosforylering av western blot. (B) HCT-116-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av rhAPRIL i tre timer og ble analysert for ekspresjon av fosforylering av Akt og mTOR. (C) HCT-116-celler ble behandlet med de angitte doser av LY294002 i 24 timer og deretter stimulert med rhAPRIL (400 ng /ml) i tre timer, og analysert for Akt og mTOR fosforylering. Fosforylering av Akt og mTOR ble bestemt ved hjelp av SDS-PAGE og Western blotting. Densitometriske verdiene er oppført under hver blot.
april mediert celle spredning av CRC celler ved å fremkalle Akt og mTOR aktivisering gjennom PI3K /Akt sti
På grunn spredning av kreftceller er regulert av cellesyklus, ved fast vi hvilken fasen av cellesyklusen ble endret i april-knockdown-celler ved flow cytometri med PI farging. Som vist på fig. 5A, april-knockdown SW480-celler ble arrestert i G1 fase 48 timer etter transfeksjon, og prosentandelen av G0 /Gl faseceller betydelig økt, noe som tyder på at april-knockdown forhindret inntrengning av celler fra G1 til S-fasen av cellesyklusen. For å forstå hvordan ytterligere april-knockdown forhindret S-fase oppføring av celler, undersøkte vi effekten av shAPRIL transfeksjon på ekspresjon av c-myc, cyclin D1 CDK4 (viktige regulatorer av G1 /S overgang) og p-Rb. Vi observerte en reduksjon av c-myc, cyclin D1, CDK4 og p-Rb etter knockdown av april (Fig. 5C), som antydet at disse faktorene kan være involvert i april regulering av celleproliferasjon. I mus tumorer med knock down av april, observerte vi redusert april proteininnhold ved immunohistokjemi og Western blot (Fig. 3E), og nedsatt celleformering (cyklin D1, CDK4, p-Rb og Ki-67) (fig. 3F, nedre panel), noe som tyder på at redusert tumorvekst observert ved april knockdown kan være et resultat av april regulering av celleproliferasjon. Fordi PI3K /akt-aktivering i G1 fase er nødvendig for c-myc stabilisering og S-fase oppføring av celler [20] har vi fastslått hvorvidt april-medierte regulering av cellesyklusregulerende proteiner var PI3K og Akt-avhengig. Vi har bekreftet rhAPRIL kunne indusere cellesyklusutvikling ved signifikant å øke andelen av celler i S, G2M fase og ekspresjon av c-myc, cyklin D1, CDK4, p-RB-proteiner sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 5B og D) . Samtidig, undersøkte vi effekten av PI3K /Akt inhibering på april-induserte cellesyklusutvikling av SW480-celler, som ble forbehandlet med PI3K-inhibitor, LY294002, før april stimulering. Vi fant at aktivering av p-Akt og p-mTOR av april ble fullstendig blokkert av PI3K inhibitor LY294002, akkompagnert med betydelig hemming av c-myc, cyclin D1, CDK4 og p-Rb uttrykk (Fig. 5E). Dette tyder på at april-indusert Akt og mTOR aktivitet er direkte regulert gjennom PI3K /Akt veien. Fig. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
