Abstract
Kreftceller hovedsakelig utnytte glykolyse for ATP produksjon selv i nærvær av rikelig oksygen, et miljø som normalt ville føre til energiproduksjon gjennom oksidativ fosforylering . Selv om den molekylære mekanisme for denne metabolske bryteren til aerob glykolyse ikke er blitt fullstendig klarlagt, er det sannsynlig at mitokondriell skade til elektrontransportkjeden og den resulterende økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser er betydelige drivkrefter. I denne studien, har vi undersøkt rollen til transkripsjonsfaktor Ets-1 i reguleringen av mitokondriell funksjon og metabolisme. Ets-1 ble overuttrykt ved hjelp av et stabilt innarbeidet-tetracyklin-induserbare ekspresjonsvektoren i ovarian cancer-cellelinjen 2008, som uttrykker ikke detekterbare basalnivåer av ets-1-proteinet. Microarray analyse av virkningene av Ets-en over-ekspresjon i disse eggstokkreft celler viser at Ets-en opp-regulerer nøkkelenzymer som er involvert i glykolysen og tilhørende mateveier, fettsyremetabolisme, og antioksidantforsvar. I motsetning til dette, Ets-en ned-regulerer gener som er involvert i sitronsyresyklusen, elektrontransportkjeden, og mitokondrielle proteiner. På det funksjonelle nivå, er det funnet at Ets-1-ekspresjonen er direkte korrelert med cellulær oksygenforbruk hvorved øket ekspresjon fører til redusert oksygenforbruk. Ets-1 overekspresjon også forårsaket økt følsomhet for glykolytiske inhibitorer, så vel som veksthemming i en glukose-utarmet kultur miljø. Kollektivt våre funn viser at Ets-en er involvert i reguleringen av cellenes stoffskifte og respons på oksidativt stress i eggstokkreft celler
Citation. Verschoor ML, Wilson LA, Verschoor CP, Singh G (2010) Ets- 1 Regulerer energiomsetningen i kreftceller. PLoS ONE 5 (10): e13565. doi: 10,1371 /journal.pone.0013565
Redaktør: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, USA
mottatt: 04.06.2010; Godkjent: 24 september 2010; Publisert: 22 oktober 2010
Copyright: © 2010 Verschoor et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd midler fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
over 50 år siden, Otto Warburg først foreslått at mitokondrieskade som fører til deprimert elektrontransportkjeden funksjon og luftveisskader er et viktig skritt i utviklingen og progresjon av kreftutvikling [1], [2]. I løpet av de siste to tiårene, har mange studier vist at svulster fortrinnsvis bruke glykolyse for energi produksjon over oksidativ fosforylering, en egenskap som har blitt et kjennetegn på svulst patofysiologien [3] – [5]. Kjent som Warburg virkning, kreftceller hovedsakelig utnytte glykolyse for ATP produksjon, selv i nærvær av rikt oksygen, et miljø som normalt ville resultere i energiproduksjon gjennom oksidativ fosforylering [2], [6]. Endringer i mitokondrie DNA samsvarer med økt produksjon av ROS og svekket oksidativ fosforylering, noe som resulterer i redusert ATP produksjon og øket glykolytisk avhengighet [5], [7]. Den økte produksjon av reaktive oksygenforbindelser, spesielt H
2o
2, av kreftceller er sannsynligvis et resultat av mitokondriell dysfunksjon, som mitokondrier er ansett for å være den dominerende celle kilde av reaktive oksygenarter [8]. Fire til fem prosent av den O
2 som forbrukes av oksidativ fosforylering i mitokondriene er normalt omdannes til reaktive oksygenforbindelser; Derfor mangler til elektrontransportkjeden system i kreftceller vil resultere i overdreven reaktive oksygenarter formasjon [8] – [10]. Overdrevet produsert, H
2o
2 kan fungere som et signalmolekyl ved oksidering av cystein-molekyler på proteiner, aktivering av flere signalveier inkludert MAPK, samt flere transkripsjonsfaktorer, inkludert AP-1, p53, NF-kB, og Ets-1 [11] – [15]
ETS-1, et medlem av Ets protein familie av transkripsjonsfaktorer regulerer uttrykket av et mangfoldig sett av proteiner gjennom sin interaksjon med spesifikke konsensussekvenser oppstrøms av. målgener [16]. Den over-ekspresjon av Ets-1 har vært forbundet med en rekke forskjellige krefttyper, spesielt med hensyn til tumorprogresjon og invasjon [16] – [19]. I tillegg, over-ekspresjon av Ets-1 har også vært assosiert med dårlig prognose i bryst [20], eggstokk [21], og cervikale karsinomer [22]. Tradisjonelt er Ets-1 antas å fungere som en transkripsjonen aktivator og dens høy ekspresjon i endotelceller og stromale celler korrelerer med tumorcelle invasivitet og ugunstig utfall av ovarie- og brystcancer [23] – [25]. Vårt laboratorium og andres har understreket betydningen av Ets-en i reguleringen av ulike aspekter ved kreft celle atferd, inkludert ekstracellulære matrise ombygging, invasjon, angiogenese [26], og stoffet motstand [27]. Koblingen mellom Ets-en og kreft invasivitet kan potensielt forklares med en liste over kjente målgener regulert av denne transkripsjonsfaktor. Flere MMP’er og integrin-genene, så vel som urokinase-plasminogen-aktivator (uPA), som alle er kjente mediatorer av ekstracellulær matriks nedbrytning og cellevandring, er kjent mål for Ets-1 [28] – [31]. Mange gener er viktige for angiogenese og ekstracellulære matrise ombygging, slik som matrix metalloproteinaser (MMP-1, MMP-3, MMP-9), uPA og Integrinβ3, er under direkte regulering av Ets-1 [26]. Denne transkripsjonsfaktor er således ansett for å være en viktig formidler av kreftcelleutvikling og tumorprogresjon.
I dette studiet har vi vist at Ets-1 spiller en rolle i reguleringen av energimetabolismen i eggstokkreft celler. Ved hjelp av høy gjennomstrømming genomisk analyse har vi funnet ut at Ets-1 regulerer, enten direkte eller indirekte, flere viktige gener som er involvert i mitokondrie metabolske og antioksidantforsvar trasé i vår Ets-en over-uttrykk eggstokkreft celle modell. Funksjonelt, har vi vist at glykolysen, oksidativ fosforylering, og cellulære respiratoriske systemer endres som reaksjon på endringer i Ets-1-ekspresjon. Til sammen våre funn tyder på at Ets-en er en nøkkeltranskripsjonsfaktor som er involvert i å regulere metabolske og oksidativt stress i kreftceller.
Resultater
Kreft celle modell av Ets-en genekspresjon
Ets-en var over-uttrykt i 2008 eggstokkreft celler ved hjelp av en tetracyklin-induserbar system, genererer 2008-ETS1 celler. Ets-1 protein uttrykk i tetracyklin behandlet 2008 og 2008-ETS1 ble undersøkt via Western blotting (figur 1). Ets-1 protein uttrykk var ikke påvises i 2008 helcellelysater, men lett ble oppdaget i den induserte 2008-ETS1 lysat. Økt Ets-1 uttrykk ble funnet å være en bestemt effekt som protein nivåer av to lignende Ets familiemedlemmer, Ets-2 og PEA3 ble ikke endret i denne modellen av Ets-en over-uttrykk (figur 2).
2008 eggstokkreft celler ble stabilt transfektert å over-uttrykke Ets-en i en tetracyklin induserbar system. Protein uttrykk for 2008 og 2008-ETS1 celler ble målt via Western blot etter induksjon med tetracyklin (n = 3).
Protein uttrykk for ETS familie transkripsjonsfaktorer (A) Ets-2 og (B ) PEA3 ble sammenlignet i 2008 og 2008-ETS1 eggstokkreft celler for å bestemme spesifisiteten av våre Ets-1 uttrykk modell. Western blot analyse viste at ingen av disse transkripsjonsfaktorene var påvirket av Ets-1 uttrykk i 2008 celler.
ETS-1 regulerer metabolske genekspresjon
Microarray analyse av 2008 og 2008- ETS1 celler viste at 3,131 gener av 28,869 gener fra autosøk ble oppregulert eller nedregulert som svar på Ets-en over-uttrykk med minst 1,45 ganger (p≤0.001) (GEO database tiltredelse # GSE21129). For denne studien har vi valgt å rapportere og undersøke endringer i utvalgte mRNA hvis funksjoner er relevante for mitokondrie aktivitet, cellenes stoffskifte, og oksidativt stress. Sanntid QRT-PCR validering ble utført med 10 mål gener som representerer ulike fold endre verdier, og resultatene ble normalisert til 4 separate housekeeping gener. Selv om både PPARG og SDHB genuttrykk i 2008-ETS1 celler var ikke signifikant forskjellig fra 2008 celler ble fold endringer bestemmes fra sanntid QRT-PCR assosiert med microarray fold endringer ved en korrelasjonskoeffisient på 0,99 (tabell 1). Derfor fold endringer større enn 1,45 ble ansett for å være gyldige resultater og ble inkludert i denne studien.
uttrykk for G6PD, PDHA, HK, og CYC ble undersøkt ved Western blotting for å avgjøre om genet expression forskjellene som ble observert var også til stede på proteinnivå. Vi fant ingen signifikante forskjeller i proteinuttrykk mellom 2008 og 2008-ETS1 celler for noen av de enzymer undersøkt (data ikke vist).
Den glycolytic evnen til kreftceller er regulert av Ets-en
Microarray analyse av 2008-ETS1 ovarian kreft celler viste at Ets-en er involvert i reguleringen av mitokondriell stress og dysfunksjon som metabolske gener, inkludert de som er involvert i glykolysen, glykolytiske mater veier, TCA syklus, og lipid metabolisme (tabell 2), og gener som er involvert i antioksidantforsvar (tabell 3) ble endret på Ets-en over-uttrykkende celler. For å evaluere hvorvidt celler med stabil over-ekspresjon av Ets-en fordel glykolyse i løpet av oksidativ fosforylering for energi, som forutsagt ved vår microarray-analyse ble celler dyrket i glukose-fritt media supplementert med den glykolytiske inhibitor 2-DG, en analog av glukose. Celler ble dyrket i nærvær av varierende mengder av 2-DG, og representative vekstkurver ble generert for hver cellelinje. Veksten av celler i media inneholdende 2-DG ble inhibert i større grad i celler med en høyere Ets-1-ekspresjon enn i parentale celler (figur 3A). Det 2-DG IC
50 doser eller doser hvor 50% av cellene hadde sluttet prolifererende, ble beregnet ut fra 4 uavhengige eksperimenter. Våre resultater viste at 2008-ETS1 celler indusert med tetracyklin var den mest følsomme for 2-DG, med en IC
50 0,75 mM, som var betydelig lavere enn foreldre 2008 cellene, IC
50 til 4,29 mM ( p≤0.01). C13 * celler, en cisplatin-resistente variant av 2008-celler, hadde en IC
50 til 2,04 mm, noe som også var betydelig lavere enn for foreldre 2008-celler (p≤0.05). Å avvise behandlingseffekt, ble foreldre 2008-celler ble behandlet med tetracyklin, og viste ingen signifikant vekstinhibering av 2-DG med en IC
50 til 3,67 mM (data ikke vist). Vekst av celler i normal eller glukose-fri medium (supplert med natriumpyruvat) ble sammenlignet mer enn 96 timer, hvoretter det ble observert at proliferasjonen av celler med øket ekspresjon av Ets-1 er særlig langsommere sammenlignet med foreldre 2008-celler (Figur 3B ). Behandling med glukosefritt medium resulterte i en nedsatt formeringshastigheten for alle celler som ble testet i sammenligning med normalt supplert media (data ikke vist).
(A) 2008, C13 *, og 2008-ETS1 celler ble behandlet med den glycolytic inhibitor 2-DG, og cellevekst ble målt etter 96 timers inkubering. 2008-ETS1 og C13 * celler som uttrykker Ets-en viste signifikant redusert vekst etter glycolytic hemming i 2008-ETS1 forhold til foreldre 2008 celler (n = 4). (B) 2008 og 2008-ETS1-celler ble dyrket i fravær av glukose, og proliferasjonsanalyser ble utført ved 24 timers intervaller. 2008-ETS1 eggstokkreft kreftceller uttrykker høye nivåer av Ets-en viste en redusert evne til vekst i glukose fritt kulturmedium, noe som tyder på en økt avhengighet av glykolyse for energi (n = 3).
Ets-1 regulerer cellulær oksygenforbruk i kreftceller
Vårt mikromatriseanalyse antyder at Ets-1 overekspresjon resulterte i en total nedregulering av gener som koder for elektrontransportkjeden komponenter, noe som tyder på at disse cellelinjer vil sannsynligvis displayet reduseres O
2 forbruk (tabell 4). Denne antakelsen ble evaluert ved hjelp av høy-oppløsning respirometri, hvor basaloksygenforbruk ble målt etter tilsetning av celler til en oxygraph. Basal oksygenforbruk var betydelig lavere i induserte 2008-ETS1 celler (26.23 pmol O
2/1 × 10
6 celler /sek, p≤0.05) sammenlignet med 2008 celler (40,60 pmol O
2/1 × 10
6 celler /sek, p≤0.05) (figur 4). Ingen signifikant tetracyklin behandling effekt på basal oksygenforbruk ble funnet etter induksjon av 2008 celler, noe som bekrefter at tetracyklin ikke påvirker oksygenforbruk i vår modell (data ikke vist).
Basal oksygenforbruk ble bestemt til 2008 og 2008- ETS1 eggstokkreft celler. Ets-1 uttrykk var assosiert med en betydelig reduksjon i basal oksygenforbruk tyder på en redusert avhengighet av oksidativ fosforylering i 2008-ETS1 celler.
Bilder
Diskusjon
MITOKONDRIELLE reaktive oksygenforbindelser aktivere flere sentrale signalveier involvert i tumorgenesen og opp-regulerer uttrykket av viktige onkogene transkripsjonsfaktorer inkludert Ets-1 [32]. Vi har tidligere vist at øket produksjon av intracellulære reaktive oksygenforbindelser i C13 * celler, en cisplatin-resistente variant av 2008 ovarian carcinoma-celler, korrelert med en økning i Ets-1 mRNA og protein ekspresjon [15], [33]. Etterfølgende behandling av disse cellene med H
2o
2 økt Ets-1-ekspresjon på en doseavhengig måte, noe som tyder på at denne transkripsjonsfaktor er følsomme for tumor-avledede signaler.
Vårt tidligere analyse av Ets-en promoter førte til identifisering av en antioksidant respons element (eR) som viste seg å være sentral i å regulere uttrykket av Ets-en under både basal og H
2o
2-indusert tilstander [15] . Tradisjonelt har funksjonelle betydningen av Ets-en over-ekspresjon i kreft har vært knyttet til regulering av matriks-nedbrytende proteaser og angiogene faktorer [26], [34]. Men våre siste funn som mitokondrie reaktive oksygenforbindelser potent påvirker Ets-1 uttrykk på transkripsjonsnivået [15] tyder på at betydningen av denne transkripsjonsfaktor i kreft initiering og progresjon strekker seg utover angiogenese og metastase alene.
hypotese at Ets-1 kan være involvert i reguleringen av mitokondriell metabolisme i kreftceller fordi mitokondrisk stress fra både økt produksjon og elektrontransportkjeden feil resultat reaktive oksygenarter i økt Ets-1 mRNA og protein [15]. For å bestemme den funksjonelle betydningen av Ets-1-ekspresjon i cancercellemetabolismen, genererte vi den tetracyklin-induserbare Ets-1 overuttrykkende kreft i eggstokkene cellelinje 2008-ETS1. Foreldre 2008 celler uttrykker ikke detekterbare nivåer av Ets-1 protein endogent. For å analysere genomiske konsekvensene av Ets-en over-uttrykk i disse eggstokkreft celler, gjennomførte vi en menneskelig gen microarray. Våre funn tyder på at Ets-en er enten direkte eller indirekte involvert i regulering av uttrykk for mer enn 3000 av de over 28 000 menneskelige gener undersøkt. Interessant, våre funn tyder på at Ets-en kan fungere som en transcriptional repressor av mer enn halvparten (1665) av disse genene i ovarialcancer celler.
Selv om Ets-en har blitt studert mye i både fysiologiske og patologiske prosesser [17], er det sjelden referert til som en transkripsjonen repressor. I sammenheng med mitokondriell dysfunksjon og metabolisme, ble Ets-1 funnet å i det minste delvis ned-regulere flere komponenter i elektrontransportkjeden. Kompleks, hvor den mest fremtredende området for elektron lekkasje som fører til overdreven reaktive oksygenarter produksjon i elektrontransportkjeden, er sammensatt av 39 atom kodede subenhetgenene, hvorav Ets-en ned-regulerer 11. Et annet viktig område for elektron lekkasje og reaktiv oksygen arter produksjon er Complex III, som er sammensatt av 10 underenheter, hvorav Ets-en ned-regulerer 3. Ets-1 undertrykker også komponenter av komplekset IV, V Komplekse ATP synthases, samt noen elektrontransport forbundet faktorer. Samlet utgjør disse undertrykkende funksjoner foreslår at Ets-en fremtredende involvert i redusert avhengighet av oksidativ fosforylering ofte forbundet med kreftceller. Følgelig, gener som koder for proteiner involvert i mitokondrielle oksidativ fosforylering ville bli nedregulert, og cellene ville kreve alternative metoder for ATP produksjon, inkludert glykolyse og fettsyreoksidasjon. Gitt at komponentene i nesten alle kompleks av elektrontransportkjeden, flere viktige enzymer i TCA syklus, og til slutt de reduserende ekvivalenter som er nødvendig for elektrontransport var tilsvarende nedregulert, Ets-en over-uttrykkende celler ser ut til å ha en redusert evne til å generere ATP via oksidativ fosforylering på genuttrykk nivå.
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP vanligvis har en redusert avhengighet av oksidativ fosforylering for energiproduksjon, og de likeledes har en økt avhengighet av glykolyse og fett metabolisme for cellulær energi [35]. I ytterligere støtte som Ets-1 er involvert i reguleringen av endret kreft metabolisme, er Ets-1 forbundet med den økte ekspresjon av mange gener som er involvert i glykolysen, glykolytiske mater trasé, og pentosen fosfat pathway. I tillegg er ekspresjonen av Ets-1 også korrelert med en økning i ekspresjonen av mange gener som er involvert med lipidmetabolisme og biosyntese. Samlet utgjør disse trendene tyder på at Ets-en er en viktig transkripsjonen regulator ikke bare i katabolsk, men også anabole metabolske overganger av kreftceller som til slutt fremmer tumorgenesen [35].
Det var nesten et halvt århundre siden når oppreguleringen av fettsyre syntase (FASN) ble først beskrevet i kreft [36], som nå er kjent for å være overuttrykt i de fleste kreftformer. Interessant, Ets-1 ble også funnet å være involvert i reguleringen av øket FASN genekspresjon i vårt eggstokkreft modell. Dermed våre genuttrykk funn tyder på at Ets-en er en nøkkeltranskripsjonsfaktor som er involvert i metabolismen av kreftceller, og spesielt viktig i den metabolske dreining mot glykolyse og anabole hjelp av energiproduksjon. Selv om det er viktig å merke seg at Ets-1-medierte metabolske regulering er sannsynligvis oppnås ved en stor konsortium av forskjellige transkripsjonsfaktorer, en mer kompleks regulatoriske nettverk av transkripsjonsfaktorer som påvirkes av mitokondriell dysfunksjon er ennå ikke klarlagt. Vi har vist at overekspresjon av Ets-1 i vårt eggstokkreft modell ikke påvirke proteinnivåer av to nært beslektede ETS familiemedlemmer; Det er imidlertid mulig at andre ETS transkripsjonsfaktorer fra denne meget stor familie påvirker også kreft metabolisme. Tatt i betraktning at disse transkripsjonsfaktorene gjenkjenne nesten identiske konsensussekvenser, repetisjon av forsøkene i denne studien etter over-ekspresjon av andre familiemedlemmer ETS kan gi lignende resultater. I tillegg vil slike eksperimenter videre karakter potensielt stort transcriptional nettverk involvert i den spesialiserte metabolismen av kreftceller.
For å bestemme den funksjonelle relevansen av våre genomiske resultater, har vi undersøkt glycolytic evnen til vår Ets-1 over ekspresjon modell. Vi har indirekte evaluert oksidativ fosforylering kapasiteten til disse cellene ved behandling med den glykolytiske inhibitor 2-DG. Ovarian C13 * og induserte 2008-ETS1 celler, som både uttrykker Ets-en, viste fremtredende veksthemming som svar på to-DG, noe som tyder på at disse cellene er mer avhengige av glykolyse for ATP produksjon. I tillegg er Ets-1 over uttrykker eggstokkreft celler viste signifikant redusert vekst etter glukosemangel, noe som ytterligere understreker deres glycolytic avhengighet. Veksten av alle celletyper i glukose-frie medier ble redusert i forhold til normalt supplert media, spesielt etter 48 timer når en tydelig forskjell i cellevekst ble konsekvent observert, sannsynligvis på grunn av nedsatt glukosetilgjengelighet. Over-uttrykk for Ets-en potent forverret denne divergens som veksten av induserte 2008-ETS1 celler drastisk redusert etter 48 timer. Men på proteinnivå, fant vi ikke noen signifikante forskjeller i uttrykket av glukose-6-fosfat-dehydrogenase, pyruvat dehydrogenase, cytokrom
c
eller heksokinase, som alle er enzymer involvert i glykolysen eller oksidativ fosforylering. Viktigere, vi fikk se repeterbare og signifikante forskjeller i glycolytic avhengighet forbundet med Ets-1 uttrykk, og mangelen på endringer i protein uttrykk kan derfor være grunn til posttranslasjonelle modifikasjoner formidlet av Ets-en. For eksempel vil forskjeller i den katalytiske regionen til et enzym som fører til funksjonelle forskjeller, men vil ikke nødvendigvis være detekterbar via Western blot, da denne teknikken er avhengig av den spesifikke epitop målrettet av antistoffet som brukes. Derfor planlegger vi å undersøke enzymaktiviteten av disse metabolske enzymer i fremtidige studier for å fastslå om noen forskjeller mellom 2008 og 2008-ETS1 celler som kan redegjøre for funksjonelle forskjeller vi har vist i denne studien.
evaluering av O
2 forbruk av en populasjon av celler er en funksjonell vurdering av oksidativ kapasitet, da det representerer et godt estimat av den hastighet med hvilken elektronene passerer langs elektrontransportkjeden og blir redusert til H
2O
2. Den polarografisk system som brukes i denne studien er å måle O
2 forbruk omfatter sensorer som gir en strøm proporsjonal med partialtrykk på O
2 i celleinneholdende medium ved å forbruke O
2 i en katodiske halvreaksjon, og dermed signalet reagerer eksponentielt til endringer i O
2 trykk i prøven. I fravær av spesifikke komplekse substrater og ADP, og dermed simulere åndedrett, basaldosen av O
2 forbruk kan måles. Vi har observert en betydelig nedgang i O
2 forbruket i celler med økt Ets-1 uttrykk. Våre resultater tyder på at Ets-en er direkte involvert i reguleringen av cellulær oksidativ kapasitet, hvor Ets-1 overekspresjon førte til signifikant reduserte O
2 forbruk, og Ets-1 nedregulert celler viste en meget fremtredende økning O
2 forbruk. Disse resultatene tyder på at oppregulert Ets-1 uttrykk fremmer en redusert avhengighet av oksidativ fosforylering for energi, og gir ytterligere bevis mot den funksjonelle betydningen av Ets-en i kreft celle metabolisme.
Høye nivåer av oksidativt stress er vanligvis observert i tumormikromiljøet som følge av ubalanse i antioksidantforsvar faktorer, og svekkede DNA-reparasjonsmekanismene [37] – [39]. I brystkreftcellelinjer, økes ondartet sykdom assosiert med høye nivåer av reaktive oksygenarter produserende superoksyddismutase aktivitet, i kombinasjon med reduserte nivåer av reaktive oksygenarter-avgifte glutation peroksidase og H
2o
2-avgifte enzym katalase [40]. Liknende antioksidantenzym ubalansene er blitt funnet i melanoma [41], så vel som lunge [42], prostata [43], og skjoldbruskkjertel-kreft [44]. Vår microarray analyse fastslått at Ets-en er en regulator av antioksidant genuttrykk i eggstokkreft celler, spesielt glutation peroksidase, som fortrinnsvis er rettet mot H
2o
2 og lipid hydroperoksider for avrusning. Denne økt uttrykk av antioksidanter er svar på mitokondrie oksidativt stress i form av overdreven reaktive oksygen arter produksjon, og vi har tidligere vist at Ets-en genuttrykk økninger i respons til H
2o
2 [15]. Det er imidlertid viktig å merke seg at Ets-1 også ned-regulerte gener som koder for visse H
2o
2-avgiftende enzymer, noe som tyder på at disse kreftceller trolig kreve og opprettholde et visst nivå av H
2O
2 for å oppmuntre de høye vekstrater som ligger til tumorprogresjon.
en roman funksjon for Ets-en ble belyst i denne studien følgende genomisk og funksjonell analyse av eggstokkreft Ets-1 uttrykk modell. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser en rolle for denne transkripsjonsfaktor i stoffskiftet. Tallrike nedregulert gener ble identifisert i Ets-en over-uttrykkende celler, inkludert de som koder for flere mitokondrielle proteiner involvert i oksidativ fosforylering, så vel som viktige metabolske enzymer som er ansvarlig for generering av nødvendige substrater av elektrontransportkjeden. Funksjonelle analyser bekreftet at Ets-en over-uttrykkende kreftceller viste reduserte oksidativ fosforylering kapasitet, så vel som økt avhengighet av glykolyse for cellulær energi. I tillegg Ets-en viste seg å være viktig i reguleringen av celle O
2 forbruket ytterligere tyder på en redusert bruk av oksidativ fosforylering i kreftceller som uttrykker Ets-en.
Derfor skader på mitokondriene resultater i økt produksjon av H
2o
2 og påfølgende oppregulering av Ets-en, som deretter deltar i et aktivt regulatoriske nettverk som oppfordrer avhengighet av glykolyse og lipidmetabolisme for mobilnettet energikrav. Dermed kan Ets-en grupperes med andre transkripsjonsfaktorer som er observert i opp-regulerer uttrykket av mitokondrielle proteiner (NRFs) eller gener som er involvert i glykolysen (HIF-1) som svar på konkrete spenninger [45], [46] . Oppsummert våre funn viser en ny rolle for Ets-en i reguleringen av cellenes stoffskifte som svar på mitokondrie stress.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige ovarialcancer cellelinjer 2008 og C13 *, ble vennlig levert av Dr. Paul Andrews (Georgetown University, Rockville MD) [33]. 2008 og C13 * celler ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 2% penicillin /streptomycin. Den stabile cellelinje 2008-ETS1 [27] ble holdt i vekstmedium som beskrevet ved tilsetning av 200 ng /ml av den selektive antibiotikum Zeocin. Alle cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Media og kosttilskudd ble kjøpt fra Invitrogen Life Technologies (Burlington, ON, Canada) og FBS fra Fisher Scientific (Ottawa, ON, Canada). Alle reagenser ble kjøpt fra Sigma (Oakville, ON, Canada).
Protein isolasjon og Western blot analyse
Hele cellelysater ble samlet, 30 mikrogram av protein ble separert med 10% SDS-PAGE elektroforese, overført til nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, Baie D’Urfe, QC, Canada), og blokkerte for en time i 5% skummet melk TBS-T. Membraner ble inkubert over natten med primært antistoff i 0,5% skummet melk TBS-T. Etter primært antistoff inkubasjon ble membranene vasket og inkubert i 1 time med pepperrot peroksidase-koblet IgG sekundært antistoff (1:10,000) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Proteiner ble påvist ved anvendelse av ECL-kjemiluminescens-reagens (Amersham) og eksponert for film. Antistoffer mot Ets-en (1:100), G6PD (1:1000), og PDHA (1:500) var fra Abcam; antistoffer mot Ets-2 (1:500), PEA3 (1:100), og HK (1:250) var fra Santa Cruz Biotechnology; og antistoff mot CYC (1:250) var fra BD Biosciences.
RNA isolering og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens som angitt av produsenten (Invitrogen) . RNA prøver ble DNase behandlet ved hjelp av Turbo DNA-free ™ som per produsentens anvisninger (Ambion), og 3 ug totalt cellulært RNA ble revers-transkribert ved hjelp av poly-T primere og Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av en DNA Engine® termosykler (Bio-Rad) og Platinum SYBR Grønn qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) med primer sekvenser som er oppført i tabell 5. Target genekspresjon ble normalisert til de samlede genuttrykk verdier av β aktin (ACTB), B-2 makroglobulin (B2M), glyseraldehyd-3-phosphdate dehydrogenere (GAPDH), og RNA polymerase II (RPII) som renholdskontroller. Data ble normalisert til husholderske genekspresjon og effektivitet korrigeres med ΔΔCt metode for relativ kvantifisering, hvor statistisk signifikans og standard feil ble bestemt fra ΔCt-verdier.
Microarray analyse
Total RNA var isolert fra tetracyklin-indusert 2008 og 2008-ETS1 celler som beskrevet, renset ved hjelp av RNeasy rensing kit (Qiagen), og hybridisert til GeneChip® menneskelige genet 1,0 ST Array (28,869 menneskelige gener). RNA kvalitet analyse via Bioanalyzer, microarray forberedelse, hybridisering og deteksjon ble utført ved Senter for Anvendt Genomics, The Hospital for Sick Children, Toronto, Canada. All lavt nivå analyser, beregning av differensial uttrykk, og statistiske justeringer ble beregnet ved hjelp av R versjon 2.9.2 [47]. Vurdering av RNA kvalitet post-hybridisering, og lav-nivå analyse ble utført ved hjelp av pakken «AFFY» [48]. RNA nedbrytnings tomter avslørte lite 5 «til 3» skjevhet og alle matriser var innenfor 1,35 standardavvik over gjennomsnittet skråningen. Bakgrunnskorreksjon og normalisering ble utført ved hjelp av robust multi-matrise gjennomsnitt (RMA) algoritme. For å redusere antall differensial uttrykk tester nedstrøms, og dermed øke det totale strøm, 50% av de laveste normalis Logg
2 probe-set intensiteter ble fjernet i henhold til anbefalinger fra Hackstadt og Hess (2009) [49]. Differensial uttrykk estimatene ble beregnet ved hjelp av justerte Lokal Pooled Feil test i pakken «LPEadj «[50]. Den Benjamini-Hochberg prosedyre for å kontrollere falske funnrate (FDR) ble brukt til sammenligning messig p-verdier ved hjelp av pakken «multtest «. Rapporterte q-verdiene representerer den minimale FDR ved hvilken en spesiell test kan bli betraktet som signifikant. Brett endre uttrykk verdier av 10 tilfeldige målgener av varierende ganger endring magnitude ble validert ved hjelp av sanntids PCR. Tilsvarende forhold fold endringer ble bestemt ved bruk av ΔΔCT metode for relativ kvantifisering, og korrelasjonskoeffisienter ble beregnet til å bestemme forholdet mellom real time PCR og microarray funn.
glycolytic avhengighets analyser
Cellular vekst og
