Abstract
Mål
For å vurdere endringer av nukleær faktor-kappa B (NF-kB) under radiojod 131 (
131I) terapi og om NF-kB hemming kan forbedre
131I-indusert apoptose i differensiert skjoldbruskkreft (DTC) celler i en synergistisk måte.
Metoder
Tre menneske DTC cellelinjer ble brukt. NF-kB-inhibering ble oppnådd ved anvendelse av en NF-kB-inhibitor (Bay 11-7082) eller ved p65 siRNA transfeksjon. Metyl-tiazolyl-tetrazolium assay ble utført i cellelevedyktighet vurdering. DNA-bindingsanalysen, luciferase reporter analysen, og Western blot ble vedtatt å bestemme funksjon og uttrykk endringer av NF-kB. Deretter NF-kB regulerte anti-apoptotiske faktorer XIAP, cIAP1, og BCL-xL ble målt. Apoptose ble analysert med Western blot for caspase 3 og PARP, og ved flowcytometri også. En jodid opptaksanalyse ble utført for å bestemme om NF-kB hemming kan påvirke radioaktivt jod opptak.
Resultater
metyl-tiazolyl-tetrazolium-analysen viste signifikant reduksjon av levedyktige celler ved kombinasjonsbehandling enn ved monoterapi. DNA-bindingsanalysen og luciferase reporter-analyse viste forbedrede NF-kB funksjon og reportergen aktiviteter på grunn av
131I, men signifikant suppresjon ble oppnådd ved NF-kB-inhibering. Western blot viste
131I kunne øke kjernefysiske NF-kB konsentrasjon, mens NF-kB hemming redusert NF-kB konsentrasjon. Western blot også vist signifikant oppregulering av XIAP, cIAP1, og BCL-xL etter
131I terapi. Og inhibisjon av NF-kB kunne gi en betydelig ned-regulere disse faktorene. Endelig synergisme indusert av kombinasjonsbehandling ble vist av betydelige forbedringer av kløyvde caspase 3 og PARP fra Western blot, og av Annexin V positivt flekker fra flowcytometri. Opptaket jod analysen viste ikke signifikante endringer når NF-kB ble hemmet.
Konklusjon
Vi viste at
131I kan indusere NF-kB aktivering, noe som ville svekke
131I effekt i DTC celler. NF-kB hemming av Bay 11-7082 eller p65 siRNA transfeksjon var effektiv i å undertrykke NF-kB regulert anti-apoptotiske endringer og i kombinerte diett apoptose ble oppnådd synergi
Citation. Meng Z, Lou S, Tan J, Xu K, Jia Q, Zheng W (2012) Nuclear Factor-Kappa B Hemming kan forbedre apoptose av differensiert tyreoideakreft celler indusert av
131I. PLoS ONE 7 (3): e33597. doi: 10,1371 /journal.pone.0033597
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 07.10.2011; Godkjent: 12 februar 2012; Publisert: 16 mars 2012
Copyright: © 2012 Meng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne undersøkelsen ble støttet av China National Natural Science Foundation bevilgning 30900376, Key prosjekt Tianjin Science and Technology Committee Foundation gi 10JCZDJC19000, Tianjin Medical University Scientific Research gi 2008KY20, og Tianjin Medical University New Century Utmerket talent Program (tildelt ZM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
thyroid nodule er en svært vanlig klinisk problem og skjoldbruskkjertelkreft er mer utbredt i dag [1]. Differensiert skjoldbruskkjertelkreft (DTC), inkludert papillær og follikulær skjoldbrusk kreft omfatter flertallet av alle skjoldbrusk kreft. Selv om den generelle prognosen for DTC er bra hvis total tyreoidektomi og radiojod 131 (
131I) terapi brukes [2], pasienter med
131I-ildfaste metastaser bare kunne oppnå 10% 10-års overlevelse [3] , [4]. Og for noen tilfeller, selv
131I-ivrige lesjonene ble ikke vellykket kontrollert av
131I terapi alene [5]. Derfor er utvikling av nye anti-kreft metoder sterkt behov for kreft i skjoldbruskkjertelen.
I de senere årene har en rekke skyldige molekylære mål er blitt identifisert i DTC karsinogenese [6], [7], [8]. Blant disse, viser en voksende mengde bevis som nukleær faktor-kappa B (NF-kB) spiller en avgjørende rolle i skjoldbruskkjertelen, inkludert kreft utvikling og progresjon [6], [7], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Det er også vist at NF-kB-induksjon med kjemoterapi eller radioterapi kan svekke terapeutiske effektiviteter. Og NF-kB-inhibering kan fremme tyreoideacancer celle apoptose, og for å oppnå synergistiske effekter [8], [9], [10], [11], [12]. Men til vår kunnskap, har det ikke vært studie som undersøkte forholdet mellom NF-kB og
131I terapi i DTC, til tross for viktigheten av
131I behandling i DTC ledelse.
Derfor hensikten av den foreliggende forskning var å evaluere forandringer av NF-kB i løpet
131I terapi. Og vi også sikte på å fastslå om kombinasjon med en NF-kB hemmer eller liten forstyrrelse RNA (siRNA) transfeksjon kan forbedre
131I-indusert apoptose i DTC i en synergistisk måte.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige papillær skjoldbruskkreft cellelinjer KTC-1, TPC-en og follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma cellelinje WRO var vennlig levert av Dr. Shunichi Yamashita og Dr. Norisato Mitsutake (Institutt for molekylær medisin , Atomic Bomb Disease Institute, Nagasaki Universitetet Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki, Japan). DTC-celler ble dyrket i Dulbeccos minimal essensielt medium (GIBCO BRL, New York, USA) supplert med 5% føtalt bovint serum (GIBCO BRL, New York, USA), 1% (vekt /volum) penicillin /streptomycin (Sigma-Aldrich, MO, USA) og en mU /ml thyrotropin (Sigma-Aldrich, MO, USA) i en 5% CO
2 fuktig atmosfære ved 37 ° C.
Transfeksjon med siRNA
SMARTpool NF -κB P65 sirnas ble kommersielt designet av Dharmacon (Dallas, TX, USA). Bassenget av siRNAs inneholdt P65-spesifikke sekvenser. Egge oligonukleotider (sekvens AATTCTCCGAACGTGTCACGT) ble kjemisk syntetisert av SBS Genetech (Beijing, Kina) og det ble analysert i en BLAST søk for å utelukke homologi til p65 eller andre gener [15]. Når DTC-celler var på 50% -60% konfluens, transfeksjon av p65 SMARTpool sirnas (100 nmol /L), egge oligonukleotider (100 nmol /L) eller ingen oligonukleotid (kontroll) ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 6 timer ved 37 ° C i seks-brønns plater. Etter transfeksjon ble cellene dyrket i nye medier og behandles eller oppsamlet som indikert.
metyl-tiazolyl-tetrazolium (MTT) assay
DTC-celler (100 ul, 6000 celler per brønn) ble sådd til 96-brønners plater og inkubert i 48 timer før noen behandling. Da nye medier ble endret, og
131I (Beijing Atom Hightech, Beijing, Kina) eller Bay 11-7082 (Sigma-Aldrich, MO, USA) ble tilsatt for å oppnå endelig
131I aktivitetskonsentrasjoner av 5, 10, 20, 50, 100 og 200 MBq /ml eller slutt Bay 11-7082 konsentrasjoner på 1, 2, 5, 10 og 20 pmol /l i hver brønn. Celler ble utsatt for behandling i 48 timer, og 6 replikater ble anvendt for hver konsentrasjon av hvert legemiddel. I kontrollbrønnene DMSO ble tilsatt, og sluttkonsentrasjonen av DMSO overskred ikke 0,2% i hvilken som helst brønn. Etter inkubering ble cellene behandlet med MTT (50 ug /brønn, Sigma-Aldrich, MO, USA) i 1 time ved 37 ° C. Den genererte formazan ble oppløst med 150 ul /brønn av DMSO, og de optiske densiteter av brønnene ble målt ved 450 nm med en Multiskan MS Plate Reader (Labsystems, Helsinki, Finland).
spredning av DTC cellelinjer etter siRNA transfeksjon ble også målt ved MTT-analyse. Etter transfeksjon med p65 siRNA, egge oligonukleotider eller ingen oligonukleotid kontroll, ble cellene overført som replikerer 6 til 96-brønners plater ved en konsentrasjon på 6000 celler per brønn. Etter 48 timers inkubering ble cellene behandlet med eller uten 20 MBq /ml
131I i 48 timer. Deretter MTT ble utført som ovenfor.
Utarbeidelse av celleekstrakter
Etter ulike behandlinger, cellene ble lysert i buffer med høyt saltinnhold [9]. For total celleprotein, ble høstede cellene suspendert i 100 ul lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X, 50 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfat, 1 mM natrium orthovanadate og 2 mM phenylmethyisulfonylfluoride) i 20 minutter på isen. Deretter lysat ble sentrifugert i 15 minutter ved 14.000 rpm, og supernatanten ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. For kjerneprotein, ble høstede cellene suspendert i 400 ul lyseringsbuffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 0,5 mM ditiotreitol, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid og 0,1% Nonidet P-40) i 20 minutter på isen. Deretter lysat ble sentrifugert i 5 minutter ved 14.000 rpm. Pelletene ble resuspendert i 40 pl av kjerneekstrakt-buffer (20 mM HEPES pH 7,9, 420 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM ditiotreitol, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid og 20% glycerol) i 20 minutter på is. Etter sentrifuger i 15 minutter ved 14.000 rpm, supernatanten ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med en bicinchoninic syre assayreagens kit (Sigma-Aldrich, MO, USA).
DNA-bindingsanalysen
Den multi-brønn kolo analyse for aktiv NF-kB ble utført [9]. Kort beskrevet ble like deler nukleære ekstrakter inkubert i 96-brønners plater belagt med immobilisert oligonukleotid inneholdende et NF-kB konsensus-bindingssetet. NF-kB-binding til mål-oligonukleotid ble påvist med primært antistoff spesifikt for p65 subenhet og HRP-konjugert sekundært antistoff. For kvantifisering av aktivitet, ble optiske densiteter målt ved 450 nm med en Multiskan MS Plate Reader.
Luciferase-analyse
DTC-celler ble sådd ut i 24-brønners plater med 1 x 10
5 celler per brønn. Cellene ble co-transfektert med 400 ng av PNF-kB-luc (Clontech, Mountain View, CA, USA) og 4 ng av PRL-SV40 (Promega, Madison, WI, USA) ved hjelp Lipofectamine 2000. PRL-SV40 plasmid med en cDNA som koder for
Renilla
luciferase ble anvendt som en intern kontroll i hvert forsøk [16]. Celler ble hvilte i 12 timer etter transfeksjon, og deretter inkubert med eller uten
131I, eller med en kombinert behandling av
131I pluss Bay 11-7082 i 6 timer. Aktiviteter i Firefly og
Renilla
luciferases ble bestemt sekvensielt fra en enkelt prøve med Dual-luciferase reporter analysen system (Promega, Madison, WI, USA) med en Lumat LB 9507 luminometer (Bethold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland ).
DTC celler ble ko-transfektert med PNF-kB-luc og PRL-SV40 24 timer etter p65 siRNA eller rykke transfeksjon [15]. Etter 12 timer ble cellene behandlet med eller uten 20 MBq /ml
131I i 6 timer. Deretter reportergenet aktiviteter ble analysert som beskrevet ovenfor.
Western blot
Like mengder protein, ble underkastet elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE på 10% eller 15% polyakrylamidgeler. Proteiner ble overført på nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, NJ, USA) ved semidry blotting. Membranene ble blokkert med Tris-bufret saltvann /0,1% Tween 20 (TBST) inneholdende 5% melk i 60 minutter ved romtemperatur, og deretter immun-blottet med passende fortynnet primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Etter vasking tre ganger med TBST, ble blottene inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff i 60 minutter ved romtemperatur. Da kompleksene ble visualisert i iChemi XR bildesystem (Syngene, MD, USA) ved å bruke Chemiluminescence reagenser (Millipore, MA, USA). Semi-kvantifisering ble utført av Antall En programvareversjon 4.6.2 (Bio-Rad, CA, USA). Antistoffer for NF-kB p65, X-bundet hemmer av apoptose (XIAP), B-celle lymfom ekstra stor (Bcl-xL), spaltet caspase 3, poly-ADP-ribose polymerase (PARP) og β-aktin var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antistoff for cellulær inhibitor av apoptose 1 (cIAP1) var fra R 0,01). Og LSD viste signifikant reduksjon av levedyktige celler ved kombinasjonsterapi enn enten ved monoterapi (
P
0,01).
Etter eksponering for angitte konsentrasjoner av Bay 11-7082 (A), aktivitet konsentrasjoner av
131I (B) eller kombinerte terapier (C) i 48 timer, celle viabilities ble bestemt ved MTT-analyse. Etter DTC-celler ble behandlet med ingen oligonukleotid kontroll, egge oligonukleotider eller p65 siRNA transfeksjon, ble cellene overført til 96-brønners plater. Deretter ble cellene behandlet med eller uten
131I (20 MBq /ml) i 48 timer, og MTT ble utført (D). Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter
Figur 1D viste at egge oligonukleotider transfeksjon ikke hemme DTC celleproliferasjon, mens siRNA transfeksjon kan oppnå åpen hemmende effekt (
P
0,05). Videre kan kombinasjonsbehandling betydelig indusere sterkere celledød enn enten
131I terapi eller siRNA transfeksjon (
P
0,01).
Effekter av ulike behandlingsformer på NF-kB
for å undersøke effekten av
131I på NF-kB, utførte vi DNA-bindingsanalysen ved hjelp av kjernefysiske utdrag fra
131I-behandlede DTC celler for 6, 24 og 48 timer med ubehandlede celler som kontroll. NF-kB funksjon økte i løpet av tiden løpet av
131I monoterapi, nå topper på 24-timers tidspunkt for KTC-en og WRO celler. Men sammen med Bay 11-7082 kunne gi en betydelig redusert NF-kB funksjon (figur 2A). I de ovennevnte tre tidspunkter, ble betydelig NF-kB hemming vist av
T
-Test i den kombinerte behandlingsformer enn
131I monoterapi i alle tre cellelinjer (
P
0,01) .
(A) DTC celler ble behandlet enten med
131I (20 MBq /ml) eller i kombinasjon med Bay 11-7082 (5 mikromol /L) for 6, 24 og 48 timer. Nukleære ekstrakter ble fremstilt, og DNA-bindingsanalysen ble utført. (B) DTC-celler ble behandlet med ingen oligonukleotid kontroll, egge oligonukleotider eller p65 siRNA transfeksjon. Da celler ble eksponert for
131I i 24 timer, og DNA-bindingsanalysen ble utført. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
NF-kB responsiv promoter aktivitet ble utført i tillegg (figur 3). Vi fant ut at
131I betydelig forbedret de NF-kB reporter gen aktiviteter, til ca 2,5, 1,7 og 3,0 folder i KTC-en, TPC-en og WRO cellelinjer (
P
0,05). Likevel, sammen med Bay 11-7082 kunne hemme NF-kB funksjoner til ca 0,16, 0,14 og 0,24 folder av de induserte nivåer i KTC-en, TPC-en og WRO cellelinjer (
P
0,01) . Og p65 siRNA transfeksjon kan redusere NF-kB funksjoner til nesten 0,14, 0,14 og 0,26 folder av de induserte nivåene henholdsvis (
P
0,01).
(A) DTC celler ble transfektert med PNF-kB-Luc, og PRL-SV40 fungert som en intern kontroll. Etter 12 timer ble cellene forblir ubehandlet eller inkuberes med
131I (20 MBq /ml), eller i kombinasjon med Bay 11-7082 (5 mikromol /L) i 6 timer. NF-kB-aktivering ble påvist ved luciferase reporter-analyse. (B) Ved 24 timer etter transfeksjon med egge oligonukleotider eller p65 siRNA, celler ble ko-transfektert med PNF-kB-luc og PRL-SV40. Etter 12 timer ble cellene forblir ubehandlet eller behandlet med
131I (20 MBq /ml) i 6 timer. Deretter luciferase reporter-analysen ble utført. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Neste vi undersøkte kjernefysiske NF-kB protein nivåer 6 timer etter forskjellige behandlinger av Western blot (figur 4). Mengdene av p65 øket i
131I grupper i alle cellelinjer, men undertrykkes åpenbart når Bay 11-7082 ble tilsatt i kombinasjonsterapien. De tilsvarende resultater ble oppnådd ved p65 siRNA transfeksjon, mens egge oligonukleotider transfeksjon ikke kunne oppnå slike effekter.
DTC-celler ble etterlatt ubehandlet som kontroll (A), eller behandlet med 20 MBq /ml
131I (B ) eller i kombinasjon med 5 umol /L Bay 11-7082 (C) i 6 timer. Da kjerneproteinekstrakter ble kontrollert for NF-kB p65 ved Western blot. I det andre sett av eksperimenter, ble kontrollceller ubehandlet (D). Etter ingen oligonukleotid (E), egge oligonukleotider (F) eller p65 siRNA (G) transfeksjon ble cellene behandlet med DTC
131I (20 MBq /ml) i 6 timer. Da atom protein nivåer av NF-kB p65 ble analysert. PCNA ble anvendt som en kontroll for lasting kjerneproteiner. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Effekter av ulike behandlingsformer på NF-kB regulert anti-apoptotiske faktorer
Som å være potente apoptose hemmere, XIAP, cIAP1 og BCL-XL er målgener positivt regulert av NF-kB [7], [18]. Vi testet hvilken påvirkning forskjellig behandlinger kunne påføre dem ved Western blot ved å bruke KTC-en som en representativ cellelinje (figur 5). Til tross for visse basale nivåer av XIAP, cIAP1 og BCL-XL,
131I økt XIAP til 5,5-5,7 folder, cIAP1 til 4.8-6.7 folder og BCL-XL til 3.6-5.1 folder, henholdsvis. Men etter kombinasjon med Bay 11-7082, XIAP, cIAP1 og BCL-XL proteinuttrykk ble markert redusert til 0,09, 0,10 og 0,17 folder av de forbedrede nivåer hhv. Etter p65 siRNA transfeksjon, ble disse protein uttrykkene inhiberte signifikant til 0,07, 0,06 og 0,10 henholdsvis folder. ANOVA og LSD viste signifikante økninger av disse faktorene i
131I grupper enn i kontrollgruppene (
P
0,01), og betydelig nedgang av dem i kombinasjon grupper enn i
131I grupper (
P
. 0,01)
KTC-1 celler ble ubehandlet som kontroller (A), eller behandlet med 20 MBq /ml
131I (B) eller i kombinasjon med 5 mikromol /L Bay 11-7082 (C) i 24 timer. Deretter helcellelysater ble undersøkt med Western blot for XIAP, cIAP1 og BCL-XL. I det andre sett av eksperimenter, ble kontrollceller ubehandlet (D). Etter ingen oligonukleotid (E), egge oligonukleotider (F) eller p65 siRNA (G) transfeksjon ble KTC-1-celler behandlet med
131I (20 MBq /ml) i 24 timer. Da proteinnivåer XIAP, cIAP1 og BCL-xL ble studert. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
synergieffekter oppdages i kombinasjonsterapier
Først Western blot ble brukt til å oppdage endringer av caspase 3 (en nøkkel apoptose bøddelens) og PARP (hovedmål av caspase 3). Vi viste at selv om noen intervensjon kan indusere splittelser av caspase 3 (subenheter p19 og p17) og PARP (p89), økte nivåer betydelig lenger ved kombinerte behandlinger (figur 6). I tabell 1, ANOVA og LSD viste betydelige forbedringer i kombinerte behandlinger enn i monoterapi (
P
0,05). Deretter, for ytterligere å bekrefte effektene på apoptose, var dobbelt farging flowcytometri utført. Resultatene viste at selv om en hvilken som helst terapi kunne indusere apoptose, kombinerte behandlinger økt apoptose synergistisk på grunn av betydelige forbedringer av Annexin V positivt fargede celler (figur 7 og tabell 1).
KTC-1-celler ble etterlatt ubehandlet som kontroll (A ), eller behandlet med 20 MBq /ml
131I (B), 5 umol /L Bay 11-7082 (C) eller kombinasjon (D) i 24 timer. Deretter helcellelysater ble undersøkt ved Western blot for caspase 3 og PARP. I det andre sett av eksperimenter ble KTC-1-celler behandlet med ingen oligonukleotid kontroll (E), egge oligonukleotider (F) eller p65 siRNA transfeksjon (G) først. Da disse tre grupper av celler ble utsatt for
131I (20 MBq /ml) i 24 timer (H-J). Caspase 3 og PARP proteinnivåer ble undersøkt med Western blot. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter
Det første settet med eksperimenter inkluderte fire grupper:. KTC-1 celler fikk ingen behandling (A), 20 MBq /ml
131I (B), 5 umol /L Bay 11-7082 (C) eller kombinasjon (D) i 24 timer. Deretter ble cellene høstet ved trypsinering, dobbel farget med FITC-konjugert annexin V og propidiumjodid, og deretter underkastes for strømningscytometri. I det andre sett av eksperimenter ble KTC-1-celler først behandlet med ingen oligonukleotid kontroll (E), egge oligonukleotider (F) eller p65 siRNA transfeksjon (G). Da disse tre grupper av celler ble utsatt for
131I (20 MBq /ml) i 24 timer (H-J). Og flowcytometri ble gjennomført. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Iodide opptak i DTC cellene under NF-kB blokkere
For å finne ut om NF-kB veien hemming påvirkninger jod opptak, vi testet radioaktivt jod opptak endringer med eller uten NF-kB inhibering av Bay 11-7082 eller p65 siRNA transfeksjon. Figur 8 viser at det var bare små endringer etter terapeutiske intervensjoner, ble ingen signifikante forskjeller observert (
P
0,05)., Som indikerte at NF-kB ikke kontroll jod opptak i KTC-1 celler
(A) KTC-1-celler ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med Bay 11-7082 (5 umol /l) i 24 timer. Da celler ble dyrket i nærvær av Na
125I (37 KBq /ml) i 1 time. Deretter ble cellene vasket og celleantallet ble tellet. Deretter radioaktivitet ble målt. (B) KTC-1-celler ble behandlet med ingen oligonukleotid kontroll, egge oligonukleotider eller p65 siRNA transfeksjon først. Da celler ble eksponert for Na
125I, og radioaktiviteten ble målt. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Den mest effektive etter kirurgisk behandling av DTC lesjoner er
131I terapi, på grunn av den iboende evne til skjoldbruskkjertelen celler til å konsentrere jod.
131I avgir kort veilengde (0,5-2,2 mm) β-stråling som er cytotoksisk for cellene, noe som er iboende meget lik ekstern strålebehandling. Imidlertid er denne metoden ineffektiv hos pasienter med tumorer ikke lenger konsentrere
131I effektivt [4], [19], [20]. Vi testet vår hypotese i denne studien, at NF-kB kan være en viktig faktor for regulering av anti-apoptotiske prosess i løpet av
131I terapi. NF-kB er blitt vist å spille en viktig rolle i mange typer kreft [14] inkludert skjoldbruskkjertelen [7], [8], [13], [21], [22], som innledet søk etter medikamenter som kan undertrykke NF-kB aktivitet [7], [18]. Til nå har en rekke av NF-kB-hemmere er vist å indusere skjoldbruskkjertelkreft celle apoptose, for eksempel SN50, DHMEQ, bortezomib og Bay 11-7082. Og når de ble anvendt i kombinasjon med kjemoterapi eller radioterapi, kan synergisme oppnås [9], [10], [11], [12]. En annen tilnærming av p65 siRNA transfeksjon er blitt forsøkt i mange typer av kreft [15], [23], [24], [25], og forbedret kjemosensitivitet ble demonstrert så vel [15], [23]. Likevel, kombinert behandling inklusive p65 siRNA transfeksjon er ikke testet i skjoldbruskkjertelen så langt.
I denne studien, effekten av
131I på NF-kB funksjon og uttrykk i DTC celler ble analysert først. DNA-bindingsanalysen viste at NF-kB aktivering ble dramatisk økt på 6-timers tidspunkt, nådde topper på 24-timers tidspunkt for KTC-en og WRO celler. Økt NF-kB-aktivering reporter ble også vist av luciferase-assay. Imidlertid kan disse aktive være betydelig undertrykt av en NF-kB-inhibitor eller av p65 siRNA transfeksjon. Vi deretter brukt Western blot data å vise at
131I kunne øke kjernefysiske protein nivåer av NF-kB, mens Bay 11-7082 eller p65 siRNA transfeksjon kan dramatisk hemme NF-kB protein nivåer.
NF-kB mediert anti-apoptose i det vesentlige er avhengig av dets evne til å forbedre transkripsjoner av celledød undertrykkende gener [7], [18], [26]. De mest representative NF-kB kontrollerte anti-apoptotiske faktorer er XIAP, cIAP1 og Bcl-xL, noe som kan forhindre tumorcelledrepende effekt [7], [18]. XIAP kan hemme kaspase 3 og 7, og det er også involvert i undertrykkelse av de pro-apoptotiske JNK-aktivitet. cIAP1 er en potent inhibitor av apoptose, som kan binde og hemme caspase 3 og 8. Og Bcl-xL er kjent for å inhibere cytokrom C frigivelse fra mitokondrier. I denne undersøkelsen fant vi at XIAP, cIAP1 og BCL-xL var signifikant oppregulert etter eksponering for
131I. Inhibering av NF-kB av Bay 11-7082 eller ved p65 siRNA transfeksjon i løpet av
131I påvirkning kan endre balansen mot betydelig nedregulering av disse faktorene.
Deretter, for å bekrefte muligheten for synergis effekter indusert av kombinerte terapier, utførte vi Western blot på viktige apoptotiske proteiner og utført flowcytometri for å vurdere apoptose. Våre resultater viste betydelig synergi hvis NF-kB ble hemmet under
131I terapi. Vår studie viste også at NF-kB sti hemming ikke kontroll jod opptak, noe som indikerer dens pro-apoptotiske effekter er den viktigste mekanismen for synergi resultater.
Apoptose er en viktig prosess med å fjerne bestemt celler under utvikling eller etter skade fra kjemoterapi eller strålebehandling. Det er kjent at
131I-indusert celledød kan være både apoptose og nekrose, hvis natur er doseavhengig [27]. Marx et al. [27] har vist at, på B-celler (CPAP en annen DTC cellelinje), apoptose var påvisbar etter inkubasjon med 1 MBq /ml
131I i 2 dager. På medium
131I aktivitetskonsentrasjon (1-10 MBq /ml) apoptose var dominerende, mens ved mye høyere
131I aktivitetskonsentrasjon (særlig høyere enn 100 MBq /ml) nekrose ble dominerende. I vår undersøkelse har vi brukt
131I aktivitetskonsentrasjon på 20 MBq /ml, som kunne produsere nok apoptose for ulike eksperimenter. Den liten dose forskjellen kan være fra forskjellige cellelinjer og ulike laboratorieforhold.
Ødeleggelse av pro-apoptotisk eller anti-apoptotiske balanse er bevist å forårsake kreftutvikling. I innstillings behandling kreft, kan avvik apoptotisk signale indusere resistens mot cellegift eller strålebehandling. Derfor restaurering av funksjonell apoptose i kreftceller kan være en nyttig tilnærming for å forbedre terapeutiske efficacies. NF-kB pathway hypotese er blitt testet i sann tyreoideacancer allerede [9], [10]. Økt NF-kB aktivitet forsterker den iboende terapiresistens fenotype av thyroid kreft celler, og dens inhibering er blitt vist lovende resultater i kombinasjon med kjemoterapi eller radioterapi [9], [10]. Den nåværende data legger til hypotesen, som
131I kan indusere NF-kB aktivering som demper
131I effekt i skjoldbruskkjertelen kreftceller. NF-kB-inhibering er effektiv i å undertrykke
131I relatert NF-kB induksjon og anti-apoptotiske endringer. I kombinert diett apoptose kan oppnås synergi.
