Abstract
Phenethyl isothiocyanate (PEITC) er en lovende kreft chemopreventive del av spiselige cruciferous grønnsaker med
in vivo
effekt mot prostatakreft i eksperimentelle gnagere. Kreft chemopreventive respons på PEITC er preget av sin evne til å hemme flere onkogene signalveier, inkludert kjernefysiske faktor-kB, Akt, og androgen reseptor. Den foreliggende undersøkelse viser, for første gang, at PEITC behandling aktiverer hakk signalering i ondartet, så vel som normale humane prostataceller. Eksponering av humane prostatakreftceller (LNCaP, PC-3, og DU145) og en normal human prostata epitelcellelinje (Prec) til PEITC resulterte i spaltning (aktiv form) av Notch1 og Notch2, og øket transkripsjonen aktivitet av Notch. I PC-3 og LNCaP-celler, PEITC behandling som skyldes induksjon av Notch ligander Jagged1 og Jagged2 (PC-3), overekspresjon av y-sekretase komplekse komponenter Presenilin1 og Nicastrin (PC-3), kjerne anrikning av spaltet Notch2, og /eller opp -regulation av
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, og /eller
Jagged2
mRNA. PEITC-indusert apoptose i LNCaP og PC-3-celler ble betydelig svekket av RNA-interferens fra Notch2, men ikke ved farmakologisk inhibering av Notch1. Inhibering av PC-3 og LNCaP cellemigrering som følge av PEITC eksponering ble betydelig utvidet ved knockdown av Notch2 protein, så vel som farmakologisk inhibering av Notch1 aktivering. Nuclear uttrykk for spaltet Notch2 protein var vesentlig høyere i PC-3 xenografter fra PEITC-behandlede mus og dorsolateral prostata fra PEITC matet tramp mus sammenlignet med tilsvarende kontroll. Fordi Notch signale er innblandet i epitel-mesenchymale overgang og metastasering, antyder studien at anti-metastatisk effekt av PEITC kan forsterkes av et kombinasjonsregime involverer et hakk hemmer
Citation. Kim SH, Sehrawat A, Sakao K, Hahm ER, Singh SV (2011) Notch Aktivering av Phenethyl Isothiocyanate Demper Dens hemmende effekt på prostata kreft celle migrasjon. PLoS ONE 6 (10): e26615. doi: 10,1371 /journal.pone.0026615
Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 15 juli 2011; Godkjent: 29 september 2011; Publisert: 24 oktober 2011
Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne undersøkelsen ble støttet av National Cancer Institute stipend RO1 CA101753-08. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Praktiske og trygge regler for chemoprevention av prostatakreft er klinisk attraktivt på grunn av høy dødelighet assosiert med denne kreftformen hos amerikanske menn [1]. Planteprodukter, inkludert bestanddeler av frukt og grønnsaker, fortsette å tiltrekke seg oppmerksomhet for oppdagelsen av nye kreft chemopreventive midler [2]. Phenethyl isothiocyanate (PEITC) er et slikt lovende kreft chemopreventive middel rik på spiselige cruciferous grønnsaker som brønnkarse [3]. Bevis for beskyttende effekt av cruciferous grønnsaker og deres komponenter, inkludert PEITC, mot prostatakreft stammer fra populasjonsbaserte observasjonsstudier samt laboratorieundersøkelser [3] – [9]. For eksempel, en populasjonsbasert case-control studie antydet en invers sammenheng mellom inntak av cruciferous grønnsaker og risiko for prostatakreft [4].
In vivo
chemopreventive effekten av PEITC mot prostatakreft er nå etablert i en transgen musemodell (Transgene Adenokarsinom av Mouse Prostate modellen, heretter forkortet til TRAMP) [5], [6]. Fôring av tre mikromol PEITC /g diett betydelig redusert forekomst samt belastning (berørte området) av dårlig differensiert kreft i dorsolateral prostata av Tramp mus [6]. Kreft chemopreventive respons på PEITC er ikke begrenset til prostata kreft hemming av kjemisk kreftutvikling eller undertrykkelse av spontan kreftutvikling av andre nettsteder (
f.eks
, lunge, tykktarm, og spiserør) ved denne kosten komponent har også blitt dokumentert [7] – [9]. Videre veksten av subkutane prostatakreft transplantater i atymiske mus ble betydelig forsinket ved administrasjon av PEITC eller dets
N
acetylcysteine konjugatet [10] – [12]. Spesielt, oral PEITC administrasjon utvidet proapoptotiske svar på docetaxel
in vivo
i prostatakreft xenografter [13].
Sikkerhet, biotilgjengelighet, selektivitet mot kreftceller, og evne til å målrette flere onkogene trasé er ønskelig attributter av en klinisk nyttig kreft chemopreventive agent. Forskning så langt tyder på at PEITC oppfyller alle disse kriteriene. For det første, PEITC er godt tolerert av eksperimentelle gnagere [6] – [9]. For det andre farmakokinetiske bestemmelser indikerer utmerket biotilgjengelighet av PEITC [14], [15]. For det tredje viser PEITC også selektivitet mot kreftceller i å forårsake apoptose og autofagi [11], [16], [17]. Endelig er PEITC stand til å undertrykke flere onkogene signalveier som er hyperaktive i menneskelig prostata kreft [18], inkludert kjernefysiske faktor-kB (NF-kB) [19], Akt [20], signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3 .) [21], og androgen receptor [22]
den foreliggende studien utvider disse observasjonene [19] – [22] og undersøker effekten av PEITC behandling på aktivering av Notch1 og Notch2, som hører til en familie av trans reseptorer involvert i prostata kreftutvikling og metastasering [23], ved hjelp av dyrkede humane prostata kreft celler (LNCaP, PC-3, LNCaP-c4-2, og DU145), en normal menneskelig prostata epitel cellelinje (PREC), PC- 3 xenografter fra kontroll og PEITC-behandlede mus [13], [16], og dorsolateral prostata fra kontroll og PEITC matet tramp mus [6].
Resultater
PEITC behandling øker nivåene av spaltede Notch1 og Notch2 i prostata kreft celler
ligand-avhengig aktivering av Notch er kompleks krever spalting av γ-sekretase kompleks [23], [24]. Notch reseptorer aktiveres ved binding av sine tilstøtende ligander (
f.eks
, Jagged1 og Jagged2), som er tenkt å indusere en konformasjonsendring i Notch reseptoren fører til eksponering av en S2 kuttesete for tumornekrosefaktor-α omdannende enzym [23], [24]. Deretter Notch-reseptorer gjennomgå en ny spalting formidles av den γ-sekretase-komplekset på et sted som ligger innenfor den Notch transmembrandomenet [24]. Netto resultatet av denne spalting er frigivelsen av den Notch intracellulære domenet inn i cytoplasma, noe som deretter translocates til kjernen for å regulere target genekspresjon [23], [24]. Nivå av spaltet protein Notch1 ble øket ved behandling med PEITC i både LNCaP (Fig. 1A) og PC-3-celler (fig. 1B) enn med ulike kinetikk og intensitet. Det motsatte, forårsaket PEITC behandling en robust og varig økning i nivået av spaltet Notch2 protein i både LNCaP (Fig. 1A) og PC-3 cellelinjer (Fig. 1B), spesielt ved 5 uM dose. Basert på Notch2 RNA-interferensdata som vises senere, den nedre bånd i den Notch2 western blot er vist i fig. 1B er ikke-spesifikk. Effekt av PEITC behandling på Jagged1 og Jagged2 protein uttrykk var forskjellig mellom LNCaP og PC-3 celler. PEITC-behandlede LNCaP-cellelinjen generelt oppviste en reduksjon i nivåene av Jagged1 og Jagged2 proteiner (Fig. 1A). I skarp kontrast til LNCaP, forbigående (Jagged1) eller vedvarende (Jagged2) induksjon av Jagged protein uttrykk var godt synlig i PEITC behandlet PC-3 celler (Fig. 1B). Differensial svarene var også merkbar om effekten av PEITC behandling på Presenilin1 og Nicastrin proteiner mellom LNCaP og PC-3 celler spesielt på 8-timers tidspunkt.
Immunoblotting for kløyvde Notch1, kløyvde Notch2, Jagged1, Jagged2, Presenilin1 og Nicastrin hjelp lysatene fra (A) LNCaP, (B) PC-3, og (C) LNCaP-c4-2 celler etter 8-, 16- eller 24-timers behandling med dimetylsulfoksid (DMSO) eller PEITC (2,5 eller 5 mm). Pil i panel B identifiserer spaltes Notch2, er det nedre bånd ikke-spesifikk basert på siRNA resultater som er vist i fig. 4A. Blottene ble strippet og re-probet med anti-actin-antistoff. Immunoblotting for hvert protein ble utført minst to ganger ved hjelp av uavhengig av hverandre fremstilles lysater. Tall over bandet representerer endringer i proteinnivåer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontroll.
PC-tre cellelinje, som er androgen-uavhengig, er relativt mer aggressiv mot androgen-responsive LNCaP celler med respekt til spredning,
in vivo
vekst i xenograft modell, og cellemigrasjon. Vi spurte om differensial respons av LNCaP
versus
PC-3 celler til PEITC-mediert endringer i Notch signale komponenter var relatert til androgen-uavhengig fenotype. Vi behandlet dette spørsmålet ved hjelp av en androgen-uavhengig variant av LNCaP celler (LNCaP-c4-2). Response av LNCaP-c4-2 celler til PEITC-mediert endringer i Notch signalproteiner var generelt lik den som ble observert i foreldre LNCaP celler (Fig. 1C). Sammen utgjør disse observasjonene viste at mens PC-3 og LNCaP celler forskjellig svart på PEITC-mediert endringer i Notch ligander og γ-sekretase kompleks, spalting av Notch1 og Notch2 proteiner ved PEITC eksponering var konsekvent i hver cellelinje testet. Også gjør overgangen fra LNCaP celler til androgen-uavhengighet (LNCaP-c4-2) ikke har noen meningsfull innvirkning på PEITC-mediert endringer i nivåene av Notch signale komponenter.
PEITC behandling øker transkripsjonen aktivitet av Notch
Vi spurte om PEITC-mediert spalting av Notch1 og Notch2 oversatt til økt transkripsjonen aktivitet av Notch. Som vist på fig. 2A, behandling av LNCaP og, PC-3-celler med 5 uM PEITC førte til en statistisk signifikant økning i luciferase-rapportøraktivitet av RBP-Jk (et nedstrøms modulator av Notch-signalering) sammenlignet med dimetylsulfoksyd (DMSO) -behandlet kontroller. Vi brukte en annen godt karakterisert kastrering-resistente humane prostatacancercellelinje (DU145) for å bestemme effekten av behandling på PEITC transkripsjonen aktivitet av Notch. Som det kan ses i fig. 2A, PEITC behandlingen økte RBP-Jk luciferase reporter-aktivitet i DU145-celler i tillegg. I tillegg PEITC-behandlede DU145 cellene utstilt lignende kinetikk Notch1 og Notch2 cleavage (Fig. 2B) som observert i PC-3 cellelinje (Fig. 1B).
(A) Effekt av PEITC behandling på RBP-Jk luciferase reporter-aktivitet (et mål på transkripsjonen aktivitet av Notch) i LNCaP, PC-3, DU145, og prec celler etter 8- eller 16-timers behandling med dimetylsulfoksyd (DMSO) eller 5 uM PEITC. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± SD (n = 3). * Signifikant forskjellig (
P
0,05) sammenlignet med DMSO-behandlet kontroll med en enveis ANOVA fulgt av Dunnetfs test (LNCaP og PC-3), eller t-test (DU145 og prec). (B) Immunoblotting for spaltet Notch1 og spaltet Notch2 hjelp lysatene fra DU145 og PREC celler behandlet med DMSO (kontroll) eller PEITC (2,5 eller 5 mm) for de angitte tidsperioder. Blottene ble strippet og re-probet med anti-actin-antistoff. Pil i panel B (DU145-celler) identifiserer spaltet Notch2, er det nedre bånd ikke-spesifikk basert på siRNA resultater som er vist i fig. 4A. Immunoblotting for hvert protein ble utført minst to ganger ved hjelp av uavhengig av hverandre fremstilles lysater. Tall over bandene representerer endringer i proteinnivåer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontroll. Hvert eksperiment ble gjentatt minst to ganger.
Deretter vi brukte en normal human prostata epitelcellelinje (Prec) for å bestemme om PEITC-mediert aktivering av Notch1 og Notch2 var unik for kreftprostataceller. Dette var en verdig forskning objektiv vurderer slående forskjeller har vært registrert med hensyn til effekten av PEITC mellom kreft og normal prostata celler. For eksempel har vi vist tidligere at Prec cellelinjen er vesentlig motstandsdyktig mot PEITC-mediert inhibering av oksidativ fosforylering, reaktive oksygenarter generasjon, og induksjon av apoptose i forhold til PC-3 og LNCaP-celler [11], [17]. Videre PC-3 og PREC celler reagerer forskjellig på PEITC-mediert endringer i uttrykket av antioksidantforsvar gener [25]. I likhet med prostata kreft celler (Fig. 1), PEITC behandling resulterte i økte nivåer av spaltet Notch1 og Notch2 i PREC celler spesielt på 16-timers tidspunkt på både 2,5 og 5 mikrometer konsentrasjoner (Fig. 2B). I samsvar med resultatene, ble PEITC-mediert økning i RBP-Jk luciferaserapportørplasmid aktivitet også observert i PREC celler etter 16 timers behandling med 5 mikrometer PEITC (Fig. 2A). Basert på disse resultatene, konkluderer vi med at PREC og kreftprostataceller (PC-3, LNCaP, LNCaP-c4-2, og DU145) oppfører seg på samme måte med hensyn til PEITC-mediert aktivering av Notch.
Effekt av PEITC behandling på atomnivå kløyvet Notch2
Fordi effekten av PEITC behandling var relativt mer uttalt og vedvarende på Notch2 cleavage sammenlignet med kløyvde Notch1, vi gikk videre for å finne ut spaltes Notch2 nivåer i DMSO-behandlet kontroll og PEITC behandlet LNCaP og PC-3 celler. PEITC-behandlede LNCaP og PC-3-celler viste en markert økning i nivåene av nukleære spaltes Notch2 i forhold til DMSO-behandlet kontroll (Fig. 3A). Disse resultatene indikerte at PEITC behandlingen resulterte i atom anriking av spaltet Notch2 i prostatakreftceller, noe som er konsistent med den observerte økningen i transkripsjonen aktivitet av Notch ved PEITC behandling (Fig. 2A).
(A) Immunofluorescence mikroskopisk bilder som viser kjernefysiske nivåer av kløyvde Notch2 protein i LNCaP og PC-3 celler etter 8-timers behandling med dimetylsulfoksid (DMSO) eller fem mikrometer PEITC på 100 × objektivforstørrelsen. Kvantifisering av
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, og
Jagged2
mRNA nivåer ved real-time RT-PCR i (B) LNCaP og ( C) PC-3 celler etter 8-timers behandling med DMSO (kontroll) eller PEITC (2,5 eller 5 mm). Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± SD (n = 3). * Signifikant forskjellig (
P
0,05) sammenlignet med DMSO-behandlet kontroll med en enveis ANOVA med Dunnetts justering. Hvert eksperiment ble gjentatt minst to ganger.
Effekt av PEITC behandling på
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, og
Jagged2
mRNA nivåer
data for effekten av PEITC behandling på mRNA nivåer av
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, og
Jagged2
er vist i fig. 3B (LNCaP) og fig. 3C (PC-3). Uttrykk for
Notch1 plakater (2,5 og 5 mikrometer PEITC) og
Jagged1 plakater (5 mikrometer PEITC) mRNA ble økt betydelig på 8-timers behandling av LNCaP celler med PEITC (Fig. 3B). En lignende PEITC behandling resulterte i undertrykkelse av
Notch2 plakater (5 mikrometer PEITC) og
Jagged2
(5 mikrometer PEITC) mRNA nivåer i LNCaP celler (fig. 3B). På den annen side, PC-3 celler behandlet i 8 timer med fem mikrometer PEITC utstilt signifikant induksjon av
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, og
Jagged2
mRNA-ekspresjon sammenlignet med DMSO-behandlet kontroll (fig. 3C). Betydelig induksjon av
Notch1
,
Jagged1
, og
Jagged2
mRNA med 2,5 mikrometer PEITC behandling ble også observert i PC-3 celler (fig. 3C). Igjen, disse resultatene pekte mot cellelinje spesifikke forskjeller i PEITC-mediert endringer i uttrykket av
Notch1
,
Notch2
,
Jagged1
, og
Jagged2
mRNA.
RNA interferens fra Notch2 tildeler beskyttelse mot PEITC-indusert apoptose
O’Neill et al [26] har vist tidligere at Notch2 regulerer apoptose i MDA-MB-231 celler. Fordi PEITC behandling konsekvent økte nivåer av kløyvde Notch2 protein i hver cellelinje testet, var det bare logisk å avgjøre om Notch2 bidratt til PEITC-indusert apoptose. Som vist på fig. 4A, proteinnivået av spaltet Notch2 var redusert med omtrent 40-60% ved transient transfeksjon av LNCaP og PC-3-celler med en Notch2 målrettet små-interfererende RNA (siRNA) sammenlignet med celler transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA. PEITC-mediert økning i nivåene av kløyvde Notch2 protein var godt synlig i kontroll siRNA-transfekterte LNCaP og PC-3 celler, som ble nesten fullstendig avskaffet av RNA interferens fra Notch2 (fig. 4A). Knockdown av Notch2 protein alene ikke har noen meningsfull innvirkning på histon-assosierte DNA-fragment slipper inn i cytosol, noe som er et godt akseptert metode for kvantifisering av apoptose, enten i cellelinje (Fig. 4B). På den annen side, PEITC-indusert apoptose var forholdsvis mer uttalt i LNCaP og PC-3-celler transfektert med kontroll siRNA sammenlignet med de som er transfektert med Notch2 rettede siRNA (Fig. 4B). Disse resultatene indikerte at Notch2 knockdown dratt beskyttelse mot PEITC-indusert apoptose.
(A) Immunoblotting for spaltet Notch2 protein ved hjelp av lysater fra LNCaP og PC-3-celler forbigående transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA eller en Notch2 målrettede siRNA og behandlet i 24 timer med dimetylsulfoksyd (DMSO) eller 5 uM PEITC. Tall over bandene representerer endringer i proteinnivåer i forhold til å kontrollere siRNA-transfektert celler behandlet med DMSO. Pilen (PC-3) identifiserer spaltet Notch2, er det nedre bånd ikke-spesifikk. (B) Histone-assosiert DNA-fragment slipper inn i cytosol (et mål for apoptose) i LNCaP og PC-3-celler transient transfektert med en styre siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med DMSO (kontroll) eller 5 pM PEITC. Resultatene uttrykkes som apoptose anrikning i forhold til kontroll siRNA-transfekterte celler behandlet med DMSO. (C) Immunoblotting for spaltet Notch1 og spaltet Notch2 proteiner ved anvendelse av lysater fra LNCaP og PC-3-celler behandlet i 8 timer eller 24 timer med DMSO (kontroll) eller 5 uM PEITC i fravær eller nærvær av 50 pM DAPT. Tall over bandene representerer endringer i proteinnivåer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontroll. (D) Histone-assosiert apoptotiske DNA-fragment som slipper inn i cytosol i LNCaP og PC-3-celler behandlet i 24 timer med DMSO (kontroll) eller 5 uM PEITC i fravær eller nærvær av 50 pM DAPT. Resultatene uttrykkes som apoptose anrikning i forhold til DMSO-behandlet kontrollgruppe. Resultatene (panelene B og D) er gjennomsnitt ± SD (n = 3). * Signifikant forskjellig (
P
0,05) mellom de angitte grupper ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger, og representative data fra et slikt eksperiment er vist.
Vi konstruerte eksperimenter ved anvendelse av en farmakologisk inhibitor av γ-sekretase {N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L -alanyl)] – S-fenylglycin-t-butyl ester; heretter forkortet til DAPT} å ytterligere teste rolle Notch i PEITC-indusert apoptose. PEITC-mediert økning i nivåene av spaltet Notch1 protein, men ikke spaltet Notch2, ble markert undertrykket ved samtidig behandling med 50 uM DAPT (fig. 4C). Som forventet, DAPT behandling alene reduserte nivåer av kløyvde Notch1 og Notch2 både LNCaP og PC-3 celler, om enn i varierende grad (fig. 4C). PEITC-indusert apoptose var enten ikke endret på alle (PC-3 celler) eller litt høyere (LNCaP celler) ved samtidig behandling med DAPT (fig. 4D). Basert på disse resultatene, konkluderer vi med at aktivering av Notch2, men ikke Notch1, bidrar til PEITC-indusert apoptose i hvert fall i PC-3 celler.
RNA interferens fra Notch2 forsterker PEITC hemming av cellemigrasjon
Fordi Notch signale inngår i celleinvasjon og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [27], [28], har vi designet funksjonelle eksperimenter for å finne ut hvilke konsekvenser Notch aktivisering på PEITC evne til å hemme LNCaP og PC-tre celle migrasjon. Forbigående transfeksjon med Notch2 rettede siRNA alene resulterte i undertrykkelse av LNCaP (Fig. 5A) og PC-3 (fig. 5C) cellemigrering, sammenlignet med tilsvarende kontroll-siRNA-transfekterte celler som bestemt ved Boyden kammer analysen. Migrering av kontroll siRNA-transfekterte LNCaP (fig. 5B) og PC-3-celler (fig. 5D) ble også redusert signifikant ved behandling med 5 uM PEITC. Videre PEITC hemming av LNCaP (Fig. 5B) og PC-3 (Fig. 5D) cellemigrasjon ble betydelig utvidet med knockdown av Notch2 protein.
Representative bilder (Boyden kammeret analysen) skildrer migrasjon av (A) LNCaP og (C) PC-3-celler transfektert med en kontroll (ikke-spesifikk) siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med dimetylsulfoksyd (DMSO) eller 5 uM PEITC ved 200 x forstørrelse. Kvantifisering av migrerte (B) LNCaP-celler og (d) PC-3-celler fra forsøkene er vist i panel A og C. Tre til fire felt på hvert filter ble skåret for migrerte celler i henhold til et invertert mikroskop ved 200 x forstørrelse. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± SD (n = 3). * Signifikant forskjellig (
P
0,05) mellom de angitte grupper ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger, og representative data fra et slikt eksperiment er vist.
Farmakologisk undertrykkelse av Notch1 aktivering forsterker PEITC hemming av cellemigrasjon
DAPT alene forårsaket en beskjeden nedgang i LNCaP (fig. 6A) og PC-3 (fig. 6C) cellemigrering, sammenlignet med respektive DMSO-behandlet kontrollgruppe. I likhet med data ved hjelp Notch2 siRNA, co-behandling med DAPT augmented PEITC hemming av LNCaP (Fig. 6B) og PC-3 (Fig. 6D) celle migrasjon. Resultatene indikerte at Notch1 og Notch2 aktivering av PEITC negativt påvirker dets evne til å hemme prostata kreft celle migrasjon.
representative bilder (Boyden kammeret analysen) skildrer migrasjon av (A) LNCaP og (C) PC-3 celler etter 24-timers behandling med dimetylsulfoksyd (DMSO) eller 5 uM PEITC i fravær eller nærvær av 50 pM DAPT ved 200 x forstørrelse. Kvantifisering av migrerte (B) LNCaP-celler og (d) PC-3-celler etter 24 timers behandling med DMSO eller 5 uM PEITC og /eller 50 uM DAPT. Tre til fire felt på hvert filter ble scoret for migrerte celler under en invertert mikroskop. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± SD (n = 3). * Signifikant forskjellig (
P
0,05) mellom de angitte grupper ved enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multiple sammenligningstest. Hvert eksperiment ble gjentatt to ganger, og representative data fra et slikt eksperiment er vist.
Immunhistokjemisk analyse for effekten av PEITC på spaltet Notch2 protein
in vivo
Vi brukte arkiverte vev fra våre tidligere utførte studier [6], [13], [16] for å bestemme
in vivo
relevansen av de cellulære funnene (fig. 1). Fordi effekten av PEITC behandling var mest konsekvente og opprettholdes på spaltede Notch2 ble immunhistokjemisk analyse begrenset til dette proteinet. Representative immunhistokjemiske bilder for kløyvde Notch2 uttrykk i PC-3 svulst xenograft seksjoner fra kontroll og PEITC-behandlede mus er vist i fig. 7A. Etter avtale med resultatene vist i dyrkede PC-3 celler (fig. 3A) atom uttrykk for spaltet Notch2 var signifikant høyere i PC-3 xenografter fra PEITC-behandlede mus sammenlignet med kontroll (Fig. 7A). Tilsvarende atomnivå spaltet Notch2 protein i dorsolateral prostata signifikant høyere i PEITC matet tramp-mus sammenlignet med kontroll (figur 7B).
(A) Representative H . E farging og immunhistokjemisk farging for ekspresjon av spaltet Notch2 protein i PC-3 transplantater fra tre mus av de angitte grupper (skala bar, 50 mikrometer, forstørrelse, 400 ×). Forsterkning av valgte området vises i innfelt. Kvantifisering av kjernefysisk ekspresjon av Notch2 protein i PC-3 xenotransplantater fra kontroll og fenetyl-isotiocyanat (PEITC) -behandlet mus er vist i søylediagrammet (gjennomsnitt ± SD; n = 3). (B) Immunohistochemistry som viser kløyvde Notch2 protein uttrykk i dorsolateral prostata fra fire trampe mus av de angitte grupper (skala bar, 50 mikrometer, forstørrelse, 400 ×). Forsterkning av valgte området vises i innfelt. Kvantifisering av kjernefysisk uttrykk for spaltet Notch2 protein i dorsolateral prostates av kontroll og PEITC matet tramp mus er vist i søylediagram (gjennomsnitt ± SD, n = 4). Statistisk signifikans ble bestemt av t-test.
Diskusjoner
Nøyaktig rollen Notch signalering i prostata cancer utvikling er fortsatt uklart, men studier har forsøkt å løse dette problemet med bruk av prostata kreft cellelinjer og menneskelige prostata kreft biopsier. Nedregulering av Jagged1 har vist seg å hemme proliferasjon av prostata kreftceller [29]. Den samme forskergruppen rapporterte senere at RNA interferens fra Notch1 konferert beskyttelse mot prostatakreft cellemigrasjon og invasjonen [30]. På samme tid har overekspresjon av konstitutivt aktiv Notch1 også blitt vist å hemme proliferasjonen av LNCaP-celler [31]. Fordi Notch signalering er ganske komplisert involverer samspill mellom fire reseptorer (Notch1-Notch4) og fem ligander [Jagged1, Jagged2, Delta-lignende ligander (Dll1, Dll3, og Dll4)] [23], [24] og hver komponent av Notch signale er ikke ofte studert [29] – [31], er det sannsynlig at avviket stammer fra kompenserende endringer i andre komponenter som utløses av knockdown av Notch1 eller Jagged1. Likevel er Jagged1 uttrykk i prostata kreft biopsier forbundet med økt metastaser og tilbakefall [32]. Denne studien viser at PEITC aktiverer Notch1 og Notch2 i kreft og normal prostata celler. Videre fører PEITC administrasjon betydelig økning i kjernefysiske nivåer av kløyvde Notch2
in vivo
i prostatakreft fra to forskjellige gnagermodeller. Vi viser også at aktivering av Notch1 og Notch2 reduserer PEITC evne til å hemme prostatacancer cellemigrering. Basert på disse observasjonene, er vi fristet til å spekulere i at anti-metastatisk effekt av PEITC kan forsterkes av et kombinasjonsregime involverer en Notch-hemmer.
LNCaP og PC-3 celler vise slående forskjeller med hensyn til PEITC-mediert endringer i Notch aliserte komponenter, spesielt Notch ligander og y-sekretase komponenter. To åpenbare muligheter fortjener oppmerksomhet for å forklare disse forskjeller i PEITC reaksjon mellom androgen-responsive LNCaP-celler (vill-type p53)
versus
kastreringsbestandig og p53-null PC-3-celler. En slik mulighet er relatert til forskjell i status av p53 mellom LNCaP og PC-3-celler som Notch1 har vist seg å være et direkte mål av p53 [33]. Restaurering av p53-ekspresjon i humane kreftcellelinjer har vist seg å oppregulerer ekspresjonen av Notch1 [33]. Ettersom PC-3 og DU145-celler, som begge mangler funksjonell p53, oppfører seg på samme måte med hensyn til PEITC-mediert aktivering av Notch1 og Notch2, muligheten for at differensial reaksjon mellom LNCaP og kastrerings-resistente celler (PC-3 og DU145) manifesteres delvis om ikke fullstendig, ved at p53 kan ikke bli forkastet i dag. Samtidig er vi klar over at regulering av uttrykk, samt aktivering av Notch1 er ganske komplisert mediert av andre faktorer enn p53, inkludert Nrf2, ETS transkripsjonsfaktor familiemedlem PEA3, epidermal vekstfaktor reseptor signalisering, og Akt å nevne noen [34] – [37]. Mens videre studier er nødvendig for å løse dette spørsmålet rundt p53, er det rimelig å konkludere med at differensial respons mellom LNCaP og PC-3 celler ikke er relatert til androgen-respons fordi LNCaP celler og dens androgen-uavhengig variant LNCaP-c4-2 utstillings generelt sammenlignbar respons på PEITC-mediert endringer i Notch signale komponenter. I denne sammenheng er det viktig å nevne at
Notch
målrette HEY (Hairy /Enhancer av split-relatert med YRPW motiv) er et androgen reseptor selektive co-repressor [38].
Aktivering av Notch2 ved overekspresjon av sin intracellulære domenet fremmer apoptose i MDA-MB-231 celler [26]. Det var av interesse å finne ut konsekvensene av Notch aktivisering på proapoptotiske svar på PEITC i vår modell. I motsetning Notch1 [30], en 40-60% knockdown av Notch2 protein har ingen meningsfull innvirkning på apoptose i LNCaP eller PC-3 celler. Imidlertid er apoptose som følge av eksponering PEITC betydelig dempet ved Notch2 knockdown i det minste i PC-3-celler. På den annen side, undertrykkelse av Notch1 aktivering med DAPT har ingen effekt på proapoptotiske respons på PEITC. Basert på disse resultatene konkluderer vi med at Notch1 er unnværlig for celledød som følge av PEITC eksponering i PC-3 og LNCaP celler. Mekanismen som Notch2 knockdown tildeler beskyttelse mot PEITC-indusert apoptose er ennå ikke klart. Inhibering av flere anti-apoptotiske reaksjonsveier, slik som NF-kB og STAT3, kombinert med endringer i ekspresjon av Bcl-2-familieproteiner har vært implisert i apoptose-induksjon ved PEITC [10], [11], [17], [19] , [39]. Det er mulig at Notch2 knockdown endrer effekten av PEITC på noen av disse banene til å gi beskyttelse mot apoptose.
metastaser er den primære årsaken til dødelighet av prostatakreft. Spesielt, Notch har vært innblandet i EMT [27], som fremmer metastase [40]. Videre behandling av LNCaP og PC-3-celler med γ-sekretase inhibitor DAPT er blitt vist å hemme celle motilitet [41]. Den foreliggende undersøkelse viser at motilitet av både LNCaP og PC-3-celler blir betydelig redusert ved knockdown av Notch2 protein ved hjelp av siRNA (redusert, men ikke signifikant i LNCaP) samt DAPT-mediert inhibering av Notch1 aktivering (redusert, men ikke signifikant i PC- 3). Videre PEITC-mediert hemming av LNCaP og PC-tre cellemigrasjon er utvidet med knockdown av Notch2 protein samt farmakologisk hemming av Notch1 cleavage (PC-3 bare). Mekanismen som Notch2 knockdown hemmer cellemigrasjon fortsatt ukjent, men dette problemet har vært studert i Notch1 [28]. Målrettet uttømming av Notch1 hemmer PC-3 og 22Rυ1 cellemigrering ved å nedregulere ekspresjonen av matriks metalloproteinase-9 og urokinase-plasminogen-aktivator [28]. Det er mulig at Notch2 knockdown utløser tilsvarende reaksjon på matriksmetalloproteinase-9 og urokinase plasminogen aktivator.
I konklusjonen, denne studien viser at PEITC behandling fremmer spalting av Notch1 og Notch2 fører til deres transcriptional aktivering i både kreft ( LNCaP, PC-3, og DU145) og normal (PREC) prostata celler. PEITC-indusert apoptose i prostatakreftceller blir beskjedent dempet ved knockdown av Notch2, men ikke ved farmakologisk inhibering av Notch1 aktivering.
