Abstract
Primær bukspyttkjertelkreft har en ugunstig prognose og standard behandlingsstrategier for det meste mislykkes i avanserte tilfeller. Virotherapy kan overvinne denne motstanden mot dagens behandlingsmetoder. Imidlertid har data fra kliniske studier med onkolytiske virus, inkludert replikere adenovirus (AD) vektorer, vises bare begrenset virkning mot kreft i bukspyttkjertelen og andre karsinomer. Siden bukspyttkjertelen karsinom har en kompleks svulst arkitektur og ofte en sterk stromal avdeling bestående av ikke-neoplastiske celletyper (hovedsakelig bukspyttkjertelen stel celler = hPSCs) og ekstracellulære matrise, er det ikke overraskende at Ad vektorer replikere i neoplastiske celler vil trolig ikke klarer å utrydde denne aggressiv krefttype. På grunn av at TGFp-reseptoren (TGFBR) uttrykkes på både neoplastiske celler og hPSCs vi satt inn den TGFBR rettet mot peptidet CKS17 inn i den hypervariable region 5 (HVR5) av kapsidprotein hekson med sikte på å generere en replikerende Ad vektor med forbedret aktivitet i komplekse tumorer . Vi viste økt transduksjon av både kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer og hPSCs og forbedret cytotoksisitet i co-kulturer av begge celletyper. Surface plasmonresonans analyse viste redusert binding av koagulasjonsfaktor X til CKS17-modifisert Ad partikler og
in vivo
biofordelingsstudier utført på mus indikerte redusert transduksjon av hepatocytter. Derfor, for å øke aktiviteten av replikerende Ad vektorer foreslår å slappe av tumorcelle selektivitet ved genetisk hekson-mediert målretting til TGFBR (eller andre reseptorer tilstede på både neoplastiske og ikke-neoplastiske celler i tumor) for å muliggjøre replikasjon også i stromal cellen rommet av svulster, mens avskaffe hepatocytter transduksjon, og dermed øke sikkerheten
Citation. Lucas T, Benihoud K, Vigant F, Schmidt CQA, Bachem MG, Simmet T, et al. (2015) hekson Modifikasjon å forbedre aktiviteten av Onkolytiske adenovirus vektorer mot neoplastiske og stromale celler i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 10 (2): e0117254. doi: 10,1371 /journal.pone.0117254
Academic Redaktør: Eric J. Kremer, Fransk Nasjonalt senter for vitenskapelig forskning, FRANCE
mottatt: 14 november 2013; Godkjent: 22 desember 2014; Publisert: 18 februar 2015
Copyright: © 2015 Lucas et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Dette arbeidet støttes av tilskuddet 109545 (til SK og AW) fra Deutsche Krebshilfe. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel carcinoma hører til de mest fatale menneskelige maligniteter i de vestlige landene som har lavest overlevelse av noen kreft [1,2]. Årsakene er rask tumorvekst, tidlig veksten av metastaser, og diagnose på et avansert stadium. Til dags dato, er svaret på dagens standardbehandling (kirurgi, radio- og kjemoterapi) begrenset. Dermed er andre strategier presserende behov og genterapi tilnærminger med virale vektorer kan representere en ny vei for kreft i bukspyttkjertelen pasienter. Adenovirus (AD) vektorer har vært mye brukt i kliniske kreftterapi studier. Til tross for lovende prekliniske data Ad vektorer som brukes i behandling av bukspyttkjertelkreft har avdekket bare dårlig klinisk effekt [3,4]. Barrierer som forklarer disse skuffende resultater omfatter i) sterk lever tropisme av human adenovirus type 5 (HAdV-5; kort: Ad5), ii) den komplekse morfologi bukspyttkjertel kreft og den lave ekspresjon av det primære Ad reseptoren på tumorceller, og iii ) utilstrekkelig intratumoral spredning av ikke-reproduserende eller betinget reproduserende vektorer.
på grunn av den raske utviklingen og tidlig debut av metastaser av pankreas duktale adenokarsinomer (PDACs) intravenøs administrering av Ad vektorer ville være nødvendig for å nå spres metastaser. Under vaskulær transport, men samvirker Ad5 med en rekke sirkulerende oppløselige faktorer, slik som koagulering blodfaktorer [5-7], naturlige antistoffer, komplement og [8] som resulterer i en sterk opptak av forskjellige levercelletyper, f.eks hepatocytter, levermakrofager (Kupffer celler) [9,10] og leversinusformet endotelceller (LSECs) [11,12]. Selv om den serielle binding av Ad5 til sin primære reseptor CAR [13] og αvβ3 og αvβ5 griner [14] er kritisk for celleinntrengning
in vitro
, disse interaksjonene ser ikke ut til å være nødvendig for hepatocytter transduksjon, i det minste hos mus [15]. I stedet har flere grupper identifisert en annen annonse opptak mekanisme som er avhengig av blod koagulasjonsfaktorer [5,6,16], spesielt faktor X (FX), i formidling hepatocytter transduksjon [5,7]. FX bindes via sin Gla domene til forskjellige hypervariable regioner (HVR) av de hekson capsomers [7,16] og virker sammen med membran lokalisert heparansulfat proteoglykan (HSPGs) [6], for derved å «bygge bro» viruset til hepatocytter overflaten. Nylig har en annen funksjon av FX-binding til Ad partikler blitt beskrevet, viser at FX beskytter Ad partiklene mot angrep fra den klassiske komplementreaksjonsveien, slik at leveren transduksjon [17]. I tillegg til FX, har en annen opptaksmekanismen er identifisert. Flere grupper har vist opptak og rydding av Ad partikler fra blod av Kupffer celler (og LSEC) av skatte reseptorer, naturlige antistoffer og utfylle [8,18,12].
Bukspyttkjertelen karsinom-lignende andre karsinomer-en kompleks vev sammensetning. I tillegg til neoplastiske celler, stromale komponenter innenfor den tumor som omfatter ikke-neoplastiske celletyper, inkludert stromale celler, endoteliale celler og makrofager, og ekstracellulære matriks (ECM) komponenter (f.eks kollagener, fibronectins). I mange tilfeller, kreftceller står for et mindre bidrag til cellemassen inne i svulsten. Ofte, de stromale celler og ECM helt vedlegge tumorcelle reir. Denne tette fysisk barriere dannet av stroma kan hindre nåværende Ad vektorer (rettet mot kreftceller bare) å omsette tilstøtende tumorcelleområder og spredt over hele svulsten. Stromale celler i bukspyttkjertelen karsinom-utpekt som aktiverte bukspyttkjertelstel celler (PSC avtaler) – spille en sentral rolle i tumorvekst og desmoplasia. Hos mus har coinjection av kreft i bukspyttkjertelen celler og menneskelige PSC avtaler (hPSCs) vist seg å resultere i en akselerert tumorvekst fremhever betydningen av hPSCs i bukspyttkjertelkreft [19,20].
En kompleks gjensidig samspill mellom kreft celler og ikke-neoplastiske PSC avtaler er orkestrert gjennom utskillelsen av ulike vekstfaktorer inkludert transformerende vekstfaktor beta (TGFB). Følgelig er de fleste bukspyttkjertelcancercellelinjer som uttrykker normale eller høye nivåer av type II TGFp-reseptor (TGFBRII) [21-23], og analyse av PDACs avslørte øket TGFBRII ekspresjon sammenlignet med normal pankreas vev [24,25]. På grunn av den lave CAR uttrykk (Ad5 reseptor) på bukspyttkjertelen karsinom eller andre kreftformer [26-28], kan TGFBRII være en kandidat reseptor mål å overvinne begrenset tumor transduksjon av Ad vektorer.
For fullstendig svulst ødeleggelse effektiv spredning av Ad5 svektorer i tumorvevet er nødvendig. I prinsippet kan intratumoral spredning oppnås ved hjelp av replikerende (onkolytiske) Ad vektorer. Sammenlignet med replikering-mangelfull, E1-slettet (ΔE1) Ad vektorer, kan onkolytiske vektorer replikere og ødelegge kreftceller ved å slippe avkom viruspartikler som er i stand til å infisere nabocellene til-ideell-hele svulsten er ødelagt. På grunn av sikkerhetsmessige hensyn, replikering av onkolytiske Ad vektorer, generelt, er vanligvis begrenset til kreftceller, enten ved hjelp av vevs- /tumor-spesifikke arrangører til å kontrollere E1A uttrykk, eller ved å innføre mutasjoner i E1A og /eller E1B, sistnevnte i prinsippet deaktivering av virusreplikasjon i ikke-neoplastiske celletyper. Tatt i betraktning den komplekse sammensetning av pankreatiske tumorer (som beskrevet ovenfor), slik vektor konstruksjon, vil imidlertid usannsynlig resultat i utrydding av karsinomer.
Mot vårt mål å frembringe et onkolytisk Ad5 vektor er målrettet på nytt fra hepatocyttene til spres tumorvev , erstattet vi den hypervariable region 5 (HVR5) av hekson (involvert i FX bindende og hepatocytter transduksjon) av syntetiske målretting peptid CKS17, som er homolog til en konservert domene funnet i retrovirale kappeproteiner [29-31]. Av interesse for målretting mot begge pancreatic carcinoma celler og pscs, inneholder heptadekapeptid CKS17 en antatt TGFp aktiv stedet motiv [32] som formidler binding til TGFBRII som er oppregulert i de fleste pankreatiske karsinomer. Faktisk fant vi at CKS17 modifisert Ad vektorer kunne ansette en TGFBRII avhengig celleinnskrift mekanisme for å omsette CAR-negative bukspyttkjertelen kreftceller og primær hPSCs, noe som resulterer i en økt cytolytisk effekt
in vitro
. Videre utskifting av hekson HVR5 av CKS17 redusert binding til FX og førte til redusert vektor opptak i hepatocytter
in vivo
hos mus.
Til sammen indikerte disse resultatene at AD5 vektorer med redusert hepatocytter tropisme og økt målretting til forskjellige celletyper i den tumor-spesielt kreft og stromaceller-kan overvinne noen av de viktigste barrierene (signifikant hepatocytter transduksjon, ineffektiv transduksjon av målceller og begrenset intratumoral sprer seg på grunn av den komplekse tumor struktur) for effektiv tumor målretting og ødeleggelse av bukspyttkjertel kreft.
Materiale og metode
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
N52.E6 cellene er basert på menneskelige amniocytes stabilt forvandlet av E1A og E1B av Ad5) [33] og ble dyrket i α-MEM-medium (Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 2 mM glutamin (Glutamax; Gibco). Den A549-cellelinjen er en human lunge adenokarsinom epitelial cellelinje som ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC nr CCL-243). A549-celler ble opprettholdt i MEM-medium (Gibco) supplementert med 10% FCS og 2 mM glutamin. Etablerte humane pankreatiske tumorcellelinjer Panc1 (ATCC-betegnelse CRL-1469), og MiaPaCa (ATCC nr 1420), og den tidlige humane pankreatiske tumorcellelinje UlaPaCa [34] ble dyrket i DMEM /F12 media (Ham’s PAA, GE Healthcare, Coelbe, Tyskland) supplert med 10% FCS og 2 mM glutamin. Primære humane pankreatiske stel celler (hPSC), isolert som tidligere beskrevet [19,35], ble holdt i DMEM /F12 Ham’s media supplert med 20% FCS og 2 mM glutamin. Den kinesiske hamsterovarie K1 (CHOK1, ATCC nr CCL-61) cellelinje som mangler den coxsackie og adenovirus-reseptor (CAR) ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% FCS og 2 mM glutamin. Den murine makrofag-cellelinjen Raw 264,7 (ATCC-betegnelse CRL-2278) ble dyrket i RMPI-1640 medium (Gibco) supplementert med 10% FCS og 2 mM glutamin. Cellelinjer ble dyrket under standard betingelser ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO
2.
virus og adenovirusvektorer
Alle vektorer var avledet fra HAdV-5 (short : Ad5). Ad1stGFP er en ΔE1 Ad5 vektor beskrevet tidligere [36]. AdGFPhCKS17 og AdGFPhWt er ΔE1 /E3 Ad vektorer. Alle tre vektorer som uttrykker GFP under kontroll av hCMV en umiddelbar tidlig promoter i stedet for E1-regionen. I tillegg har AdGFPhCKS17 vært hekson modifisert ved å erstatte 13 aminosyrer av den hypervariable region 5 (HVR5) svarende til Ad5 sekvenser nukleotid (nt.) 19 645 til 19 684 (nummereringen er i henhold til den HAdV-5-sekvensen fra GenBank tilgangsnummer AC_000008) med det syntetiske peptid retrovirale CKS17 [37] flankert av ytterligere aminosyrer som tjener som avstandsstykke for bedre visning peptidet [38]. Den kodende sekvensen til CKS17 peptidet som brukes i dette arbeidet er flankert av korte sekvenser som koder for avstandsområdet (små bokstaver) og tilstøtende Ad5-sekvenser (understreket): CAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCGgggTTACAGAATCGTAGAGGCCTAGATCTACTATTCCTAAAAGAGGGAGGTTTGctgggcgggCCTAAGGTGGTATTGTACAGT. For vektor produksjon alle ΔE1 og ΔE1 /E3 annonse vektorer ble produsert i N52.E6 celler.
replikering-kompetent vektor AdhCKS17 (som hvete for Ad5 E1) bærer samme hekson-modifikasjon som sin ikke-reproduserende motstykke AdGFPhCKS17. AdhCKS17 og hekson-umodifisert kontroll vektor (AdhWt) ble generert ved å sette Ad5 E1 regionen og for AdhCKS17 den CKS17 peptid koding nukleotidsekvens inn i bacmid pBelo-pGS66 basert på pGS66 [33] ved homolog rekombinasjon (Gene Bridges, Heidelberg, Tyskland ), etterfulgt av vektoren regenerering fra bacmid. Menneskelig Ad5 villtype virus (Ad5Wt, vennlig levert av Albert Heim, Hannover Medical School, Hannover, Tyskland), AdhWt og AdhCKS17 ble dyrket i A549 celler
Alle vektorer ble renset som tidligere beskrevet [39] av. en CsCl densitet trinnvis gradient etterfulgt av en kontinuerlig densitetsgradient CsCl. Vektorene ble avsaltet med en PD-10 størrelseseksklusjonskolonne (GE Healthcare, Dassel, Tyskland) og ble lagret ved -80 ° C i PBS supplert med 10% (v /v) glyserol. Etter rensing vektor vektor-DNA ble isolert fra vektor-partiklene ved den QiaAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) som beskrevet av produsenten `protokollen og verifisert ved restriksjonsanalyse og partiell sekvensering. Smittsomme og partikkelvektor titere ble bestemt av DNA-spor blot-analyse [40] med en Ad5 fiber-spesifikk probe omfatter nt. 31042 til 32390 av Ad5 sekvens. Den inverse bioaktivitet ble beregnet ved å dividere antall fysiske med antall smittsomme partikler.
Annonse vektor mediert transduksjon
in vitro
2×10
4 hPSCs eller 2×10
5 tumorceller ble utsådd i 24 brønners plater. 16 timer senere ble cellene transduced med ΔE1 GFP-uttrykke AD5 vektorer (Ad1stGFP, AdGFPhCKS17 eller AdGFPhWt) på angitte mangfold av infeksjon (MOI) av fysiske partikler (PMOI) eller smittsomme partikler (iMOI) per celle.
for evaluering av vektor-formidlet GFP uttrykk celler ble løsnet fra dyrkningsskåler 24 timer etter transduksjon ved anvendelse av en forvarmet trypsinoppløsning (Gibco). Etter tilsetning av PBS inneholdende 20 mM EDTA og 10% (v /v) FCS (for å inaktivere trypsin) og sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter, ble cellene resuspendert i FACS-buffer inneholdende 2% (v /v) FCS, 20 mM EDTA i PBS. Celler ble vurdert av flowcytometrisk analyse med Becton Dickinson FACSCalibur uten gating (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Relative overføringsenheter refererer til prosentandelen av GFP-positive celler eller den midlere fluorescens av alle celler. For å bestemme den relative Ad genomet innhold i cellene, ble cellene vasket to ganger med forvarmet PBS i 5 minutter 2 timer etter transduksjon og ble deretter frittliggende med 200 ul av 50 mM EDTA i PBS. Etter tilsetning av 200 ul 0,8 N NaOH for cellelysering, ble cellelysater underkastet DNA-spor blot-analyse [40]. Relative Ad vektorgenom innholdet uttrykt som relative transduksjon enheter ble beregnet og satt til 100% for A549 celler transduced med en hekson-umodifisert Ad vektor.
AdWt replikering
in vitro
1×10
6 tumorceller per seks cm tallerken seeded dagen før var infisert med Ad5Wt på et spor blot justert MOI av 1. To og 48 timer etter infeksjon ble cellene vasket med forvarmet PBS og frittliggende med trypsination. Etter inaktivering av trypsin ved FCS-celler ble pelletert (300 x g, 5 min, 4 ° C) og vasket med 1 ml PBS. Etter en annen sentrifugeringstrinn (300 x g, 5 min, 4 ° C) hver celle pelleten ble resuspendert i 200 ul PBS og totalt DNA ble isolert med den QiaAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. To mikrogram DNA ble underkastet slot blot-analyse ved bruk av et Ad5 fiber-spesifikk probe. Ad replikering ble beregnet ut fra forholdet mellom Ad genom innholdet innhentet på 48 og 2 timer etter infeksjon og satt til 100% for Ad5Wt-infiserte A549 celler.
Produksjon av smittsomme Ad partikler
in vitro
1×10
6 tumorceller per seks cm tallerken seeded dagen før var infisert med Ad5Wt på et spor blot justert MOI på 1. Førti-åtte timer etter infeksjon ble cellene vasket med forvarmet PBS og frittliggende med trypsination . Etter inaktivering av trypsin ved FCS-celler ble pelletert (300 x g, 5 min, 4 ° C) og vasket med 1 ml PBS. Etter en annen sentrifugeringstrinn (300 x g, 5 min, 4 ° C) hver celle pelleten ble igjen resuspendert i 1 ml PBS. Cellene ble så ødelagt ved gjentatt frysing og tining, og lysater ble fjernet ved sentrifugering (1800 x g, 5 min, 4 ° C). For å fjerne utpakket adenovirale genomer, cellulært DNA og RNA, ble lysater behandlet med 5 enheter endonuklease Benzonase (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. To og 10 pl av lysatet ble brukt for å reinfect 2×10
5 A549-celler sådd dagen før. To timer etter infisering, ble A549-cellene vasket to ganger med forvarmet PBS. Deretter ble cellene ble løsnet med 50 mM EDTA i PBS og lysert med 0.4 N NaOH. Antallet av infeksiøse partikler ble bestemt ved hjelp av DNA-spor-blot-analyse [40] med et Ad5 fiber-spesifikk probe og antallet infeksiøse partikler pr tumor celle ble kalkulert.
CAR ekspresjon på bukspyttkjertelen celler
5×10
4 hPSCs og 5×10
5 tumorceller sådd dagen før ble vasket med PBS og frittliggende med trypsin. Etter trypsin inaktivering med FCS, ble cellene pelletert (300 x g, 5 min, 4 ° C) og vasket med 1 ml vaskebuffer (is-kald PBS inneholdende 5% (v /v) FCS). Etter sentrifugering ble supernatanten aspirert, anti-CAR primære antistoff (1 ug per prøve, RmcB klon; Millipore, Schwalbach, Tyskland) ble tilsatt og inkubert i 30 minutter på is. Cellene ble vasket igjen og inkubert med det sekundære antistoff, Alexa 488, F (ab»)
2-fragment (1 pg per prøve; Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i 30 minutter på is. Som en kontroll servert celler som ble farget med det sekundære antistoff bare. Etter ytterligere vasketrinn cellene ble resuspendert i vaskebuffer og utsatt for flowcytometrisk analyse for å fastslå CAR uttrykk beregnes fra gjennomsnittet fluorescens intensitet av alle celler.
Steady-state nivåer av TGFBRII på bukspyttkjertelen celler
Pankreatisk hPSCs og tumorceller ble lysert i NP40 lyseringsbuffer (50 mM Tris /HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,15% (w /v) Nonidet P-40) i nærvær av fullstendig protease inhibitor cocktail (Roche, Penzberg, Tyskland) og 1 mM PMSF i 1 time på is. Etter gjentatt frysing og tining celleavfall ble pelletert (21 000 x g, 15 min, 4 ° C). Proteinkonsentrasjonen av løsningen supernatanten ble bestemt (Bio-Rad proteinanalysen, Biorad, Munchen, Tyskland). Femti ug av lysatene ble analysert med 8% SDS-PAGE og immunoblotting. TGFBRII ble påvist ved en anti-TGFBRII-spesifikt polyklonalt antistoff fra kanin (sc-1700, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland). Musen monoklonalt antistoff DM1A fra Sigma-Adrich (Taufkirchen, Tyskland) ble brukt for påvisning av α-Tubulin tjener som en lasting kontroll.
Konkurranse virus transduksjon analysene
For å demonstrere en endret celle oppføring banen til et CKS17 hekson-modifisert Ad vektor, ble monolag av A549 celler forbehandlet med løselig fiber knott (vennlig levert av Pierre Boulanger, Université Lyon, Lyon, Frankrike) ved 1000 ganger molart overskudd over fiber protein eller med en polyklonale anti-TGFBRII -antistoff fra kanin (sc-1700, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland) ved 1000 gangers molart overskudd i forhold hekson-proteinet i 30 minutter ved romtemperatur. Som en isotype kontroll for anti-antistoff TGFBRII det samme volum av kaninserum ble anvendt. AdGFPhCKS17 og kontroll vektoren ble tilsatt i en PMOI av 100 uten å fjerne competitiors. Etter inkubasjon i 1,5 timer inkubasjon ved romtemperatur ble cellene vasket to ganger med kulturmedium for å fjerne gjenværende virus og konkurrenter. Deretter ble cellene dyrket ved 37 ° C i ytterligere 2 timer for å bestemme Ad genomnivå fra isolerte samlede DNA av qPCR eller i 24 timer for å vurdere GFP uttrykk (uttrykt som den midlere fluorescens av det hele tatt) ved strømningscytometri.
Offentliggjøring av avkom viruspartikler
1×10
6 hPSCs eller 2.5×10
6 A549, Panc1 eller UlaPaCa celler sådd dagen før ble vasket en gang med PBS. Etter tilsetningen av medium og replikerende vektorer (Ad AdhWt eller AdhCKS17) ved en infeksjons MOI på 20, ble celler inkubert i 6 timer ved 37 ° C. Deretter ble mediet som inneholdt Ad vektorer fjernet og cellene ble vasket to ganger før friskt medium ble tilsatt til cellene. Prøver av mediet ble tatt ved 48 og 72 timer etter infeksjon, sentrifugert for å fjerne celler, blandet med glycerol (for å oppnå en 10% sluttkonsentrasjon av glyserol), og lagret ved -80 ° C. Ved 72 timer etter infeksjon, ble cellene skrapet av i det gjenværende medium og også lagret ved -80 ° C.
For påfølgende kvantitativ PCR-analyse av frigjorte Ad partikler i mediet DNA ble isolert fra de mellomprøvene tatt 48 og 72 timer etter infeksjon ved bruk GenElute ™ pattedyr Genomisk DNA Miniprep kit (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). Kvantitativ PCR-analyse ble utført ved forsterkning av Ad5 E4 genet ved hjelp av Stratagene 2 × Brilliant II SYBR Grønn QRT-PCR Master Mix Kit, en-Step i en Stratagene 3005P qPCR maskin. For å generere en standardkurve, ble medium tilsatt 1×10
8 partikler av AdhWt og fortynnet i serie. Oligonukleotider: E4-sense (5’tagacgatccctactgtacg -3 «), E4-antisense (5’ggaaatatgactacgtccgg -3»). Førti sykluser med følgende termiske protokoll ble utført: smelting (95 ° C, 30 sekunder), annealing (60 ° C, 30 sekunder), og forlengelsen (72 ° C, 30 sekunder). For analyse ble det antall kopier E4 E4 bestemt ved Ct (dR) verdier og standardkurven og henvist til celle tall seeded.
Antall infeksiøse partikler frigis inn i mediet ved 48 og 72 timer post infeksjon og inne i cellene og mediet samlet opp ved 72 timer ble bestemt ved plakk-analyse. Celler som er samlet sammen med medium ble ødelagt ved gjentatt frysing og opptining som beskrevet ovenfor. For å fjerne cellerester, ble prøvene sentrifugert ved 400 x g i 10 minutter, og supernatantene ble overført til nye rør. Mediet tatt på de angitte tidspunkter ble direkte benyttet i denne analysen. Serielle fortynninger av supernatantene og mediet ble brukt til å infisere A549-celler som ble sådd ut ved en rekke 7.5×10
5-celler dagen før. En 5% (vekt /volum) PeqGold lavtsmeltende agarose-oppløsning (oppløst i PBS og autoklavert) var 1: 4 fortynnet med medium inneholdende 2% serum og holdt ved 37 ° C. Etter 2 timer ble virusinneholdende medium ble forsiktig aspirert, og cellene ble belagt med forvarmet (37 ° C) 1,25% (w /v) agarose løsning. Etter 15 minutter ved romtemperatur for å tillate agarose for å størkne, ble cellene inkubert ved 37 ° C. Antall plakk ble regnet 10 dager etter smitte.
Celleviabilitet analysen
cytolytisk aktivitet av hekson-modifiserte vektor ble analysert i både single og co-kulturer av kreftceller og hPSCs. Således, 2 x10
3-celler i en enkelt cellekulturer i 96-brønners plater per brønn, og hver 1 x10
3 av tumorceller og hPSCs i ko-kulturer sådd dagen før ble transdusert med AdhCKS17 og AdhWt kontroll, henholdsvis, ved forskjellige partikkel mois i området fra 1 til 1000. Syv dager etter smitte, ble celleviabilitet fastsatt i henhold til produsentens protokollen med Cell-TiterGlo system (Promega, Mannheim, Tyskland).
SPR analyse
For å analysere samspillet av hekson-modifisert (AdGFPhCKS17) og hekson-umodifisert kontroll (AdGFPhWt) vektorer med faktor X (FX) overflaten plasmon resonans (SPR) forsøkene ble utført ved hjelp av en Reichert SR7500DC SPR instrument (Reichert Technologies, Buffalo, New York, USA Amerika). Menneskelig koagulasjon FX (Hematologisk Technologies, Essex Junction, Vermont, USA) ble kovalent immobilisert på en flyt celle av en (karboksymetyldekstranen hydrogel biosensor chip (CMD500m chip kjøpt fra XanTec bioanalytics GmbH, Düsseldorf, Tyskland)) ved amin kobling i henhold til produsentens instruksjoner. Standard aminkobling i fravær av ethvert protein (dummy-kobling) ble utført på en andre strømningscelle, hvilket ga en referansestrømningscelle. Signaler som oppnås for FX-overflate ble trukket av signaler som oppnås for referansestrømningscellen i henhold til standard prosedyre. Bare referanse trekkes sensorgrams vises. Fjerning av glycerol fra virusstamløsninger og utveksling av buffer til 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl
2, og 0,005% Tween 20 ble oppnådd ved gelfiltrering ved å anvende PD MiniTrap G-25 kolonner (GE Healthcare , Dassel, Tyskland). Vektorer serielt fortynnet med den samme buffer for å oppnå konsentrasjoner fra 1.25×10
8 til 1×10
ble ført 9 fysiske partikler per milliliter i løpet av brikken i 3 minutter ved en strømningshastighet på 25 ul /min. Dissosiasjonen fase besto av buffer strømning ved 25 mL /min i 5 minutter og ble fulgt av en regenerering trinn med regenerering buffer (10 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, og 0.005% Tween 20), hvilken ble injisert i 50 s ved en strømningshastighet på 25 mL /min.
FX-avhengige transduksjon
for å undersøke påvirkning av hekson modifikasjon på samhandling med FX FX-avhengige overføringsrater CKS17 hekson-modifisert Ad vektor ble analysert. Derfor 2×10
4 A549-celler ble intensivt vasket to ganger med PBS en dag etter såing. Deretter fikk cellene enten serumfritt medium (kontroll), eller serumfritt medium inneholdende 8 ug /ml FX (fysiologisk konsentrasjon). Ad vektorer med en partikkel MOI (PMOI) på 1000 ble tilsatt til cellene. Cellene ble deretter inkubert i 3 timer ved 37 ° C og vasket tre ganger med PBS. Etter tilsetning av serum-inneholdende cellekulturmedium, ble cellene inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellene høstet som beskrevet ovenfor, og GFP uttrykk ble analysert ved flowcytometri analyse.
In vivo
biodistribusjon
For å undersøke påvirkning av redusert FX binding av hekson -modifisert Ad vektor AdGFPhCKS17
in vivo
, en biodistribusjon studie i mus ble utført. BALB /c mus (6 til 8 uker gamle) ble kjøpt fra Charles River, Sulzfeld, Tyskland. Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Care kommisjonen av regjeringen i Baden-Württemberg (Permit Number: 975), og var i henhold til institusjonelle retningslinjer. Klodronat var en gave fra Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Tyskland). Det ble innkapslet i lipsosomes som tidligere beskrevet [41]. For Kupffer-celleutarming, ble 200 ul av klodronatpreparater liposomer injisert i halevenen. Etter 24 timer, Ad vektorpartikler (3 x 10
10) ble injisert intravenøst i halevenen til mus i et totalt volum på 200 ul (i HEPES-bufret saltløsning). Førtifem minutter eller 72 timer etter injeksjonen ble musene bedøvet av isofluran (Forene, Abbott, Ludwigshafen, Tyskland) innånding, ble lever dynket med PBS, og organer ble samlet. Deretter ble musene avlivet ved bilateral torakotomi. Deretter organene ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C for påfølgende DNA-isolering (qPCR-analyse) eller homogenisering (fluorimetrisk analyse).
Kvantitativ PCR-analyser
Kvantitativ PCR analysen ble utført ved forsterkning av Ad5 fiber genet ved hjelp av Stratagene 2 × Brilliant II SYBR Grønn QRT-PCR Master Mix Kit, en-Step i en Stratagene 3005P qPCR maskin. For å normalisere for det cellulære DNA-innhold murin eller human β-aktin ble benyttet. For å generere standardkurver, lever DNA fra naive mus (biodistribusjon studien) eller genomisk DNA isolert fra humane A549 celler (konkurranse eksperiment) ble tilsatt pGS66 inneholder Ad5 fiber genet. Oligonukleotider: murin β-actin-sense (5′-GCTGTGTTCTTGCACTCCTTG-3 «), murine β-actin-antisense (5′-CGCACGATTTCCCTCTCAGC-3′), human β-actin-sense (5»-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 «), human β-aktin-antisense (5»-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 «), fiber-sense (5′-GCTACAGTTTCAGTTTTGGCTG-3′), fiber-antisense (5»-GTTGTGGCCAGACCAGTCCC-3 «). Førti sykluser med følgende termiske protokoll ble utført: smelting (95 ° C, 30 sekunder), annealing (60 ° C, 30 sekunder), og forlengelsen (72 ° C, 30 sekunder). For analyse ble de fiber Ct (DR) verdiene normalisert til p-aktin-Ct (DR) verdiene av den samme prøven.
fluorimetrisk analyse av muselever-homogenater
Fem hundre mikrogram perfusert og snap-frossen lever ble homogenisert i 1 ml homogeniseringsbuffer (50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (volum /volum) NP-40, 0,25% (vekt /volum) natrium-desoksykolat) med en konisk vevsmaler (Wheaton, Millville, NJ, USA), overført til et 1,5 ml reaksjons rør og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble sentrifugert i 10 minutter, 20000 x g, 4 ° C. Supernatanten klare fraksjon ble overført til en ny reaksjon rør, sentrifugert i 10 minutter, 20,000g, 4 ° C, og fortynnet 1: 500 til 1: 20.000 i homogeniseringsbuffer. GFP fluorescens ble analysert i en fluorescens spektrometer LS50B (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) ved 488 nm eksitasjon bølgelengde og 512 nm emisjon bølgelengde. Relative enheter ble beregnet og vilkårlige enheter for umodifiserte vektoren ble satt til 1.
Nøytralisering av Ad vektorer av naturlig IgM
Påvirkningen av hekson modifikasjon på anerkjennelse av naturlige IgM-antistoffer ble undersøkt i en nøytralisering assay. 2×10
4 A549 sådd dagen før ble vasket en gang med PBS, og serumfritt medium ble tilsatt. 1×10
7 Ad-partikler som var blitt inkubert i 20 minutter ved 37 ° C med 30 pl av hirudinized (Refludan®, Celgene, Munchen, Tyskland) plasma fra mus eller NMR1 med serumfritt medium (kontroll) i et totalvolum av 32 ul, ble tilsatt til cellene. Etter 3 timers inkubasjon ved 37 ° C ble cellene vasket en gang med PBS, og etter tilsetning av serumholdig medium ble cellene inkubert ved 37 ° C i 24 timer, etterfulgt av strømningscytometri for å bestemme GFP-ekspresjon.
Opptak av Ad vektorer av murine makrofager
1×10
5 Rå 264.7-celler sådd dagen før ble vasket en gang med PBS, og serumfritt medium ble tilsatt.
2×10
8 Ad vektor partikkel som hadde blitt inkubert med 30 pl av hirudinized plasma fra mus eller NMR1 med serumfritt medium (kontroll) (i et totalvolum på 35 ul) i 20 minutter ved 37 ° C ble tilsatt til cellene. Etter 45 minutters inkubering ved 37 ° C ble cellene vasket to ganger med PBS, og totalt DNA ble isolert i henhold til produsentens protokoll.
