Abstract
Bakgrunn
Down regulering av gener som koder for nukleosid transportører og legemiddelmetabolisme ansvarlig for opptak og metabolsk aktivering av nukleosid gemcitabin er i slekt med ervervet tumor motstand mot dette agent. Hydralazin har vist seg å reversere doksorubicin motstand i en modell av brystkreft. Her ønsket vi å undersøke om epigenetiske mekanismer er ansvarlig for å skaffe motstand mot gemcitabin og hvis hydralazin kan gjenopprette gemcitabin følsomhet i livmorhalskreftceller.
Metodikk /hovedfunnene
livmorhalskreft cellelinje Calo celle linjen ble dyrket i nærvær av økende konsentrasjoner av gemcitabin. Nedregulering av
hENT1
DCK
gener ble observert i de resistente celler (CaLoGR) som ikke var forbundet med arrangøren metylering. Behandling med hydralazin snudd gemcitabin motstand og førte til
hENT1 Hotell og
dCK
genet reaktive i en DNA promoter metylering uavhengig. Ingen endringer ble observert i HDAC total aktivitet eller i H3 og H4 acetylering ved disse arrangører. ChIP analyse viste H3K9m2 på
hENT1 Hotell og
DCK
genet arrangører som korrelerte med hyper-uttrykk for G9A histone metyltransferase på RNA og protein nivå i resistente celler. Hydralazine hemmet G9A metyltransferase aktivitet in vitro og nedbryting av G9A genet ved IRNA restaurert gemcitabin følsomhet.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater viser at ervervet gemcitabin motstand er assosiert med DNA promoter metylering uavhengig
hENT1 Hotell og
dCK
genet nedregulering og hyper-uttrykk for G9A metyltransferase. Hydralazine går tilbake gemcitabin motstand i livmorhalskreftceller via hemming av G9A histone metyltransferase
Citation. Candelaria M, de la Cruz-Hernandez E, Taja-Chayeb L, Perez-Cardenas E, Trejo-Becerril C, Gonzalez- Fierro A, et al. (2012) DNA Metylering-Uavhengig Hjemfall av gemcitabin Motstand ved Hydralazine i livmorhalskreft celler. PLoS ONE 7 (3): e29181. doi: 10,1371 /journal.pone.0029181
Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA
mottatt: 16 februar 2011; Godkjent: 22 november 2011; Publisert: 12 mars 2012
Copyright: © 2012 Myrna et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av Psicofarma SA de CV Finansiører hadde en rolle i datainnsamlingen, men ikke i studie design, data analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. ADG har fått betalt konsulent fra Psicofarma S.A. de C.V. til andre formål enn de som er knyttet til denne forskningen saker. Forfatterens Institusjon (National Autonomous University of Mexico) har patentsøknader vedrørende hydralazin. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
gemcitabin (2 «, 2»-fluor 2’deoxycytidine, dFdC) er en analog av cytosinarabinosid som besitter særegne farmakologiske egenskaper og bred antitumor-spektrum aktivitet. Gemcitabin har en betydelig klinisk aktivitet mot en rekke maligniteter, inkludert pankreatisk, lunge, blære, bryst, eggstokk og hode og hals [1], [2]. I livmorhalskreft gemcitabin pluss cisplatin og stråling forbedrer overlevelses utfall sammenlignet med cisplatin stråling i avansert sykdom og når det brukes sammen med cisplatin er like effektivt som andre cisplatin dubletter mot metastatisk kreft i livmorhalsen [3].
gemcitabin farmakologiske egenskapene er unike i at to hovedklasser av gener er viktige for sine antitumor virkninger og motstand: membran transportører proteinkodende gener, hvis produkter er ansvarlig for narkotika intracellulære opptaket og narkotika metabolisme-gener, som katalyserer sin aktivering og inaktivering [4]. Således er ekspresjonen av disse genene nøkkel for tumorrespons og motstand mot gemcitabin. De fleste intracellulære opptaket av gemcitabin er mediert av hENT1 (human nukleosidlikevektstransportør 1). Følsomhet for nukleosid-analoger, inkludert gemcitabin
in vitro
og i et klinisk miljø er blitt vist å korrelere med ekspresjon av denne transportør, mens hENT1-manglende celler som er svært motstandsdyktig mot dette nukleosidet [5] – [8]. Pasienter med bukspyttkjertelen og lungekreft uttrykker hENT1 har høyere responsrate og lengre median overlevelse etter gemcitabin enn personer med lav eller fraværende hENT1 [9], [10]. Angå gemcitabin metabolisme gener,
dCK
uttrykk har vært forbundet med gemcitabin følsomhet. Cellelinjer valgt for resistens mot nukleosidanaloger har vist mutasjonsinaktivering av
dCK Hotell og
dCK
transfeksjonsteknologier resultater i resensibilisering av celler til Ara-C og gemcitabin [11] – [12]. Hos kreftpasienter en lavere ekspresjon av dCK er forbundet med kortere total overlevelse [13], [14]. På den annen side, er diphosphorylated gemcitabin en inhibitor av ribonukleotid-reduktase, et enzym heterotetrameric sammensatt av to homodimerer (RRM1 og RMM2) som er nøkkelen i syntesen av intracellulær deoksynukleotidtrifosfat [15]. Over ekspresjon av RRM1 og RRM2 har vært forbundet med gemcitabin motstand i kreftcellelinjer og NSCLC [16], [17]. Cytidindeaminase (CDA) katalyserer deaminering av cytidin, dexoycytidine, og analoger som gemcitabin imidlertid sin rolle formidling gemcitabin motstand er kontroversiell [18]. Disse data antyder klart at en redusert eller mangel på ekspresjon av dCK og hENT1 er avgjørende for gemcitabin motstand, men de mekanismer som fører til deres transkripsjonelle lyddemping er ennå ikke definert. Tidligere studier har vist at metylering på
dCK
genet er ansvarlig for sin taushet [19] men; Dette gjenstår å bli demonstrert for
hENT1
Hydralazine er et lite molekyl DNA demethylating middel [20] kjent for å demethylate genet arrangører og å indusere genet reaktive in vitro [21] -. [ ,,,0],24] og in vivo [25]. Brukt i kombinasjon med histone deacetylase inhibitor valproinsyre reaktiverer ekspresjonen av gener hos kreftpasienter [26] – [28]. I tillegg har hydralazin vist seg å reversere doksorubicin motstand i en modell av brystkreft [29]. Som de fleste av arbeidet med gemcitabin motstand har blitt gjort i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og har dette stoffet blitt grundig evaluert i livmorhalskreft [30] Vi ønsket å undersøke om epigenetiske mekanismer er ansvarlig for å anskaffe motstand mot denne agenten og hvis hydralazine kunne gjenopprette gemcitabin følsomhet i livmorhalskreftceller. Våre resultater viser at i denne modellen, reverserer hydralazine gemcitabin motstand i en DNA-metylering uavhengig.
Resultater
livmorhalskreft cellelinjer ble undersøkt for basal uttrykk for
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
gener og deretter deres følsomhet for gemcitabin ble evaluert. IC
50 i Siha cellelinjen var 1000 uM, og det ble vilkårlig vurdert som en primær motstandsdyktig. IC
50 for de andre cellelinjer var: 3,3 mikrometer, 0,3 mikrometer og 0,1 mikrometer for Calo, HeLa og C33A celler, henholdsvis (figur 1A). Som vist i figur 1B, som basal ekspresjon av gener som koder for gemcitabin transport og metabolisme ble justert til aktin og under henvisning til normal cervix, varierte mellom cellelinjer og et forhold mellom nivåer av disse genene med den iboende følsomhet /motstand status til gemcitabin i disse cellelinjene ble ikke funnet.
A. IC
50 av gemcitabin for HeLa, Calo, Siha og C33A celler var 3,3 mikrometer, 0,3 mikrometer, henholdsvis 1000 m og 0,1 mikrometer som vurderes med krystallfiolett analysen. B. Basal uttrykk for
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
gener som vurderes av RT- PCR. Det var ingen korrelasjon mellom IC
50 og den iboende følsomhet /motstand status. Expression ble justert til uttrykk i normal cervix.
For å undersøke om induksjon av gemcitabin motstand er knyttet til endringer i uttrykket av
hENT1
,
dCK
RRM1
,
RRM2
,
CDA
gener, Calo cellene ble utsatt for økende konsentrasjoner av gemcitabin og når cellene ble motstandsdyktig de ble behandlet med hydralazin til forskjellige tider og konsentrasjoner . Figur 2A viser at etter fem uker, Calo celler ervervet resistens mot dette antimetabolitt og var i stand til å vokse med 927 mikrometer av gemcitabin (280 ganger konsentrasjon). Motstanden tilstand ble ledsaget av nedregulering av halvparten av
hENT1 Hotell og
dCK
.
RRM1 Hotell og
RRM2
gener hadde mindre endringer, mens
CDA
ble også redusert (figur 2B). I tillegg finne 2C viser at nedregulering av
hENT1 Hotell og
DCK
gener oppsto etter hvert som motstanden utviklet. Behandling av celler med CaLoGR hydralazin ved 2 uM i 10 dager, 10 uM og 30 uM i 5 dager, var i stand til å vende tilbake gemcitabin motstand som vist i figur 2D. Den tilsvarende IC
50s for disse behandlingene var 1,7 mikrometer, 2,7 mikrometer og 6,6 mikrometer henholdsvis.
A. Etter å skaffe gemcitabin motstand, IC
50 i CaLoGR celler var 927 mikrometer (280 ganger konsentrasjon). B. Uttrykk for
hENT1
,
dCK Hotell og
CDA
ble redusert nesten til det halve, RRM1 og RRM2 hadde mindre endringer. C. Reduksjonen av
hENT1 Hotell og
DCK
gener oppsto etter hvert som motstanden utviklet. D. Behandling av celler med CaLoGR hydralazin ved 2 uM i 10 dager, 10 uM og 30 uM i 5 dager tilbakestilt gemcitabin motstand. De tilsvarende IC
50s for disse behandlingene var 1,7 mikrometer, 2,7 mikrometer og 6,6 mikrometer henholdsvis.
For å finne ut om hjemfall av motstanden ved hydralazine som er en svak DNA demethylating middel er ledsaget av endringer i uttrykket av
hENT1 Hotell og
dCK
gener, ble en RT-PCR av disse to genene utført. Resultatene i figur 3A viser at som ventet hydralazin førte til re-ekspresjon av disse gener i de tre behandlingsbetingelsene evaluert. DNA-promoteren hypermethylation har vist seg å slå av gener i kjemoterapi motstandsmodeller derfor metylering status på følgende promotorer ble evaluert ved MSP. Interessant,
hENT1 Hotell og
dCK
arrangører ble delvis metylert selv i basal staten og viste ingen hypermethylation i motstandsdyktig CaLoGR cellelinje. Hydralazin 2 pM, 10 pM eller 30 pM unnlatt å demethylate disse promotorer slik som vist med MSP i figur 3B. For å bekrefte dette, seks uavhengige kloner (basal, bestandig og motstandsdyktig behandlet med hydralazin) ble bisulfitt sekvensert, men ingen demetylering ble observert i CpG undersøkt (Fig. 3C). Genet reaktive var derfor uavhengig av sin demethylating effekt, noe som tyder på at andre epigenetiske mekanismer kunne konto for å nedregulere og aktivere disse genene i denne modellen. For å bekrefte at mangelen på demethylating effekten av hydralazin på
dCK Hotell og
hENT1
var ikke på grunn av sin svake demethylating evne, viser tall 3D som i samme cellelinje og betingelser genet
DAPK
ble demetylert med hydralazin på 2 mikrometer 10 mikrometer og 30 mikrometer.
A. Hydralazin på de tre testede betingelser (2 uM i 10 dager, 10 uM og 30 uM i 5 dager) gjenopprettet ekspresjonen av disse genene. B.
hENT1
,
DCK
gener ble delvis metylert basalt og formidler metylering ikke endre på resistente celler verken etter hydralazine behandling som vurderes av MSP. C. Kart av arrangørene på disse genene viser CpG øyer tetthet og distribusjon samt posisjonene primere for MSP, Chip og sekvensering. Det er også vist ved sekvense at CpG metylering ikke endret i
dCK Hotell og
hENT1
gener verken i resistente celler verken ved behandling med hydralazin. Tomme og fylte sirklene representerer demetylert og denaturert CPGs i fem uavhengige sequencences. D. Hydralazine var i stand til å demethylate
DAPK
promoter i Calo cellelinje.
En økning av histondeacetylase aktivitet har vist seg å indusere genet Slå på enkelte modeller. For å avgjøre om dette fenomenet deltar i gemcitabin motstand i livmorhalskreft, ble deacetylase-aktiviteten målt i Calo celler ved hjelp av et kit som inneholder prototypen HDAC-inhibitor trichostatin A som en positiv kontroll. Figur 4A viser at ble det ikke observert endringer i HDAC aktivitet; faktisk en liten nedgang i deacetylase-aktivitet ble observert i de resistente celler. Evalueringen av den totale acetylering på H3 og H4 i
hENT1 Hotell og
DCK
genet arrangører av Chip analyser mens viste en nedgang i H3 og H4 acetylering på
hENT1
promoter , ble det observert en mild økning av acetylering av H3 i
dCK
promoter og ingen endring for H4 acetylering (figur 4B). Disse tilsynelatende motsatte resultater argumentere mot en stor rolle for H3 og H4 acetylering å forklare stanse av disse genene av denne histone modifikasjon. Videre, valproinsyre behandling på 1 mM i 5 dager unnlatt å aktivere ekspresjonen av disse genene, og for å reversere gemcitabin motstand (ikke vist).
A. Total histondeacetylase aktivitet viste ingen store endringer mellom basal og resistente celler, faktisk en liten nedgang ble observert i de resistente celler som vurderes med HDAC aktivitet kit. B. Total acetylering av H3 og H4 som vurderes av Chip viste en nedgang i H3 og H4 acetylering på
hENT1
arrangøren, en mild økning i acetylering av H3 og ikke endre på H4 på
dCK
promoter.
for å få ytterligere innsikt i de epigenetiske mekanismer for
hENT1 Hotell og
dCK
stanse i denne modellen av gemcitabin motstand, ble histon metylering analysert. Metylering av H3K9 er et kjent undertrykkende mark mens metylering ved H3K4 aktiverer, derav metylering på disse lysines ble evaluert av Chip analyse i basal staten, i resistente celler og etter hydralazin behandling. Figur 5 viser at for
hENT1
genet, ble det ikke observert endringer i H3K4me3 metylering men H3K9me2 mild økning i resistente celler og redusert etter hydralazin behandling. Når det gjelder
dCK
gen en svak reduksjon i H3K4me3 ble observert i de resistente celler som ikke ble endret av hydralazin. Likevel metylering ved H3K9me2 mild økning i resistente celler og redusert etter hydralazin. Endringene i båndintensitet ble normalisert mot sine respektive inngangs intensitet. Som DNA demethylating agenten 5-aza-CDR har vist seg å redusere H3K9me2 brukte vi MetaDrug ™ program for å avdekke om hydralazin kan være involvert i reguleringen av H3K9 metylering. Som vist i figur 6, kan hydralazin påvirke ikke bare DNA-metylering i cytosin, men også kan være involvert i negativ regulering av H3K9 metylering. For å bekrefte disse spådommene mRNA uttrykk for
G9A
ble evaluert i Calo celler ved qPCR. Resultatene viser at ekspresjon av dette gen økt i de resistente celler, mens hydralazin reduserte nivået (figur 7A). Lignende resultater ble oppnådd ved western blot, økt G9A protein i de resistente celler og ble redusert etter behandling hydralazin (figur 7B). For ytterligere å undersøke G9A hemmende evne hydralazin, en H3K9 metyltransferase
in vitro
hemming analysen ble utført ved hjelp av
EpiQuik
™ Histone metyltransferase Aktivitet /hemningsmetoden Kit (H3-K9). Hydralazine 2 mikrometer og 10 mikrometer sterkt redusert H3K9 metylering (figur 7C). For å bekrefte den biologiske betydning av denne in vitro funnet, knockout av det G9A-genet ved hjelp av en IRNA analyse viste at Transfekterte Calo celler gjenvunnet følsomhet for hydralazin som ikke ble ytterligere modifisert når disse cellene også ble behandlet med hydralazin (fig. 8).
For
hENT1
genet, ble det ikke observert endringer i H3K4m3 metylering men H3K9me2 mild økning i resistente celler og redusert etter hydralazin behandling. I
dCK
genet var det en svak nedgang i H3K4me3 i resistente celler som ikke ble endret av hydralazin. Metylering ved H3K9me2 mild økning i resistente celler og redusert etter hydralazin. Endringene i bandet intensiteten ble normalisert mot sine respektive innganger.
MetaDrug ™ program spådd at hydralazin kan påvirke ikke bare DNA metylering i cytosin, men også kan være involvert i negativ regulering av H3K9 metylering.
A. Kvantitativ RT-PCR av
G9A
viser at resistente CaLoGR cellene hadde en økning i forhold til basal og at hydralazin reduserer dens uttrykk (basal vs motstandsdyktig, p 0,05). B. På proteinnivå, var det en økning i G9A i resistente celler som sank etter hydralazin behandling. C. H3K9 metyltransferase
in vitro
hemming analysen. Hydralazin på 2 mikrometer og 10 mikrometer sterkt redusert H3K9 metylering (ubehandlet vs hydralazin, p 0,05)
En.. Hemmende konsentrasjon av gemcitabin i Calo cellene ikke nådd. B. Nedbryting av G9A restaurert gemcitabin følsomhet (IC
50 10,3 mm). C. Ingen ytterligere endringer i IC
50 ble sett når hydralazine ble lagt til G9A utarmet celler. D. qPCR av G9A bekrefter delvis utarming av
G9A
messenger.
Diskusjoner
Resultatene fra denne studien av gemcitabin motstand i livmorhalskreftceller og dens hjemfall med den svake DNA demethylating agenten hydralazine viser at utviklingen av resistens er ledsaget av nedregulering av viktige gener for gemcitabin intracellulære opptak og metabolisme,
hENT1 Hotell og
dCK
. Interessant denne nedregulering skyldes ikke-genpromoteren hypermethylation som demonstrert av MSP og bisulfitt sekvensering; likevel var hydralazine stand til å reaktivere sitt uttrykk og å gå tilbake gemcitabin motstand. Disse dataene antyder at andre epigenetiske mekanismer operere til taushet kjemoterapi resistensgener og at hydralazin har DNA metylering uavhengig effekter, mest sannsynlig gjennom å påvirke negativt regulering av H3K9 metylering som spådd av METADRUG ™ -programmet.
Disse funnene er viktig å få mer kunnskap på mekanismene for kjemoterapi narkotika motstand. Gene inaktivering av DNA metylering var den første epigenetisk mekanisme vist seg å være direkte involvert i oppkjøpet av kjemoterapi motstand i
in vitro
modeller [31], [32] men som kunnskap om epigenetiske prosesser har utviklet seg, den deltakelse fra andre epigenetiske aktører som histone deacetylases både sink-og NAD-avhengig samt histone metyltransferaser, histone demethylases og microRNAs i inaktivering prosessen med gener involvert i kjemoterapi følsomhet og resistens har blitt avdekket [33] – [38]. Våre resultater tyder sterkt på at i denne modellen av gemcitabin motstand i livmorhalskreft, kan metylering ved H3K9 være den viktigste mekanismen for å kneble uttrykk for
hENT1 Hotell og
dCK
gener som baner vei for videre testing deltakelse av denne histone modifikasjon i andre modeller av kjemoterapi motstand. Relevansen av dette funnet øker etter hvert som hemmere av G9A histone metyltransferaser blir tilgjengelig for studier [39].
Tidlige studier har vist at DNA metylering hemmere indusert
dCK
nytt uttrykk i CEM /dCK- celler [19] og at mangelen på ekspresjon av dette genet nøkkel for aktivering av flere nukleosid-analoger, inkludert gemcitabin skjer ved promoter metylering [40] – [43]. Så langt har ingen annen epigenetisk mekanisme for å stanse dette genet er beskrevet i kjemoterapi motstandsmodeller. Likeledes, mangel på ekspresjon eller lave nivåer av hENT1 sterkt korrelert med resistens mot gemcitabin og andre nukleosid-analoger [6], [9], [10], [44]. Selv om flere membrantransportør kodende-gener så som hOAT3 (SLC22A8), det oppløste stoff bæreren familie 5 iodidetransporter (SLC5A8), den reduserte folat bæreren (RFC), den cellulære retinol-bindingsprotein 1, og det humane Na + /I-symporter er kjent å bli nedregulert av DNA metylering og reaktiveres ved DNA metyltransferase hemmere [45] – [49], her var vi ikke i stand til å vise at arrangøren metylering på
hENT1
står for sin observert downregulation, men dens reaktive ble oppnådd av hydralazin gjennom en DNA-metylering-uavhengig mekanisme som tyder på at faktisk
hENT1
er ned regulert av en epigenetisk effekt mest sannsynlig gjennom G9A histone metyltransferase-mediert H3K9 metylering.
Til tross for at begge genene inneholder CpG øyer på sine arrangører [50], [51] og at minst for
dCK
genet det har konsekvent vist at dens promoter er metylert i resistente celler [19], i vår modell er det ingen sammenheng mellom promoter metylering på disse arrangørene og uttrykk. Likevel demethylating effekt på andre gener (
DAPK
) ble påvist, utelukker at hydralazin har ingen demethylating effekt. Disse data førte oss til å søke etter andre epigenetiske mekanismer som kunne står for genet demping. Ingen konsistente endringer i histondeacetylase eller i histone acetylering ved disse gen-arrangører ble observert utelukker dette histone modifikasjon som en stillemekanisme for disse genene i denne modellen. Som DNA metyltransferase hemmer 5-aza-CDR decitabine kan vise alternative virkningsmekanismer til DNA metylering med hensyn til transcriptional reaktive som histon H3K9 demetylering i de regulatoriske regioner av forstummet gener [52] utførte vi et søk i METADRUG ™ -programmet til få ledetråder til andre mulige effekter av hydralazin. Våre resultater viste at faktisk hydralazine er spådd å være involvert i negativ regulering av H3K9 metylering. Dette resultatet førte oss til å analysere av Chip analyse for endringer i H3K9me2 på begge
dCK Hotell og
hENT1
arrangører i CaLoGR cellene. Begge arrangører finnes H3K9me2 i ubehandlede celler, noe økt i resistent tilstand, og dette lyddemping mark ble delvis avløst av hydralazin. Vi må imidlertid understreke at disse endringene selv i H3K9m2 selv konsekvent i tre separate analyser, var mild som kan forklares på grunnlag av at minst åtte histone metyltransferaser inkludert G9A har også H3K9 som deres metylering mål [52].
for ytterligere å bekrefte funnene, en kvantitativ RT-PCR viste at ekspresjon av G9A ble øket i de resistente celler sammenlignet med sensitive celler og nivåer gjorde reduseres etter behandling med hydralazin. Ikke desto mindre ble en dramatisk reduksjon i proteinnivået av denne histon-metyltransferase observert ved western blot i de resistente celler etter behandling hydralazin. Bemerkelsesverdig, disse resultatene er svært like de som finnes med 5-aza-CDR i en brystkreft modell av MASPIN re-uttrykk hvor reduksjoner i G9A histone metyltransferase protein nivåene er ikke på grunn av effekter på G9A genuttrykk [53]. Ytterligere støtte for denne effekten av hydralazin ble oppnådd ved en in vitro analyse av H3K9 metylering viser at hydralazin hemmer aktiviteten til denne histon metyltransferase. Den biologiske betydningen av disse observasjonene ble påvist ved å vise at tappe G9A i de resistente Calo cellene ført til gjenvinne følsomhet for gemcitabin av disse cellene, og at høyere følsomhet for gemcitabin ble ikke oppnådd ved å legge hydralazine til G9A utarmet celler kranglet mot en
off-target
effekten av hydralazin.
av notatet, METADRUG ™ programmet viste også at hydralazin kan fungere positivt i reguleringen av H3K4 metylering som ikke ble observert i vår studie, men nyere data fra vår gruppen viser at i flere kreftcellelinjer behandling med hydralazin og valproinsyre førte til over-uttrykk for MIC A og MIC B ligander som ble ledsaget av en økning i H3K4 metylering på disse gen-arrangører som tyder på at hydralazin kan ha denne effekten på denne histon mark [54].
enten iboende eller ervervede medikamentresistens er en kompleks og pleiotropisk fenomen og andre potensielle spillere deltar i gemcitabin motstand i denne modellen ble ikke undersøkt i denne studien. For tilfeller, til tross for
RRM1 Hotell og
RRM2
løpet uttrykket har vært knyttet til legemiddelresistens [55] ingen store endringer ble observert ved disse genene i denne studien. Paradoksalt nok, CD-genet ble nedregulert i resistente celler til tross for sin overuttrykk har gjennomgående vært vist i slekt med resistens mot gemcitabin og andre nukleosidanaloger [56]. Dette funnet ytterligere understreker kompleksiteten av resistens som synes å være genet og celle modellavhengig.
Funnene i denne studien er av potensiell klinisk relevans i hvert fall for denne modellen av resistens. Gemcitabin er ofte brukt for livmorhalskreft enten samtidig for stråling eller i kombinasjon med cisplatin for avanserte stadier [3]. Ervervet resistens mot dette stoffet kan være ansvarlig for mislykket behandling; dermed kan hydralazin forhindre motstand og potensielt øke effekten av gemcitabin. I tillegg avdekke at H3K9 metylering kan føre til kjemoterapi motstand fortjener sin testing i andre eksperimentelle modeller.
Materialer og metoder
Cell kultur
livmorhalskreft cellelinjer HeLa , Siha og C33A ble oppnådd fra ATCC. Den Calo cellelinjen ble en vennlig donert av Dr. Monroy-Garcia [57]. Cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% C0
2 i DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum (Gibco, Grand Island, NY).
cytotoksisitetsanalyser
celler ble sådd ut i 6-brønns mikrotiter Falcon-plater (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved 2 x 10
3 celler /brønn i 0,2 ml komplett medium og deretter behandlet i 24 timer med gemcitabin ved konsentrasjoner i området fra 1 x 10
-8 M til 1 x 10
-4 M. Deretter ble medium inneholdende gemcitabin ble fjernet, og friskt medium ble tilsatt. Etter 72 timer ble mediet aspirert og erstattet i 10 minutter med 50 ul av 0,75% krystallfiolett i 50% etanol, 0,25% NaCl og 1,75% formaldehyd-oppløsning. Cellene ble deretter vasket med vann, lufttørket, og fargestoffet eluert med PBS + 1% natrium duodecyl sulfat (SDS) -løsning. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved fargestoff absorbansen målt ved 570 nm med en automatisk ELISA-leser. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. Den cytotoksiske effekten av hver behandling ble uttrykt som en prosentandel av cellelevedyktighet i forhold til ubehandlede kontrollceller (prosentandel av kontroll) og er definert som [A
570 nm behandlede celler /A
570 nm ikke-behandlede celler] x 100.
Induksjon av gemcitabin motstand og hydralazin behandling
Calo-cellelinjen ble dyrket ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% C0
2 i DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum (Gibco, Grand Island, New York). Økende doser av gemcitabin (IC
30, IC
50, IC
80 og til slutt to trinn ved IC
90 ble lagt ukentlig for å indusere gemcitabin motstand. Etter å legge IC
90 to ganger, cytotoksiske analysen ble gjentatt for å bekrefte gemcitabin motstand.
gemcitabin-indusert resistente Calo celler (CaLoGR), ble dyrket ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% C0
2 i DMEM supplementert med 10% føtalt kalve serum (Gibco, Grand Island, NY). Deretter ble hydralazin tilsatt ved 10 uM og 30 uM i 5 dager og 2 uM i 10 dager. mediet inneholdende medikamentet ble påfylt daglig.
RT-PCR
RNA ble isolert fra cellelinjer ved standardmetoder. Deretter 5 mikrogram av RNA ble behandlet med DNAse. Revers transkripsjon ble gjort ved hjelp av RNA kit PCR Kjerne Gene Amp
R (Applied Biosystems Roche) å følge leverandørens anbefalinger .
GAPDH
,
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
gener var amplifisert ved anvendelse av følgende oligonukleotidprimere:
GAPDH product:: S: 5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3 «, AS: 5′-ATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3»
hENT1 product:: S: 5’GCAAAGGAGAGGAGCCAAGA-3 « , AS: 5’CCCAACCAGTCAAAGATATTG-3 «
dCK product:: S: 5′-CGATCTGTGTATAGTGACAG-3′, AS: 5’GTTGGTTTTCAGTGTCCTATG-3 «,
RRM1 product:: S: 5′-GCAGCTGAGAGAGGTGCTTT -3 «, AS: 5′-CAGGATCCACACATCAGACA-3′, RRM2: S: 5»-GAGTTCCTCACTGAGGCC-3 «, AS: 5′-TTAGAAGTCAGCATCCAAG-3»,
CDA product:: S: 5 «GTTGCCTTGTTCCCT TGTAA -3 «, AS: 5′-TCTTGCTGCACTTCGGTATG-3». PCR ble utført i et totalvolum på 25 pl inneholdende cDNA, 20 pmol av primerne, 200 pM dNTP, 0,25 U Taq-polymerase, og 1 x buffer levert av produsenten (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR ble initiert av et denatureringstrinn ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 35 sek, 59 ° C i 35 sek, og 72 ° C i 45 sekunder; en endelig forlengelse ble utført ved 72 ° C i 7 min. Produktene ble elektroforert på 2% agarosegeler.
G9A
genekspresjon ble evaluert av kvantitativ RT-PCR (iCycler iQ, Bio-Rad, Hercules, CA), ved hjelp av SYBR Grønn Jeg fargestoff (Bio-Rad, Hercules, CA), ved hjelp av følgende primere:
G9A
; Sense 5′-CTCCGCTGATTTTCGAGTGTAA-3 «og 5′-antisense GTCGAAGAGGTAAGAATCATCC-3».
GUSB
(human beta glucuronidase) spesifikke primere ble brukt som endogen kontroll; forstand 5′-CCTGTGACCTTCTGAGCAA-3 «og 5′-antisense AAACCCTGCAATGGTTTCTG-3». PCR startet ved inkubasjon ved 95 ° C i 1 minutt, etterfulgt av PCR-sykluser med 35 sek, ved 94 ° C, 35 sek ved 59 ° C, 50 sek ved 72 ° C, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 minutter. Antall PCR-sykluser ble bestemt eksperimentelt. Data ble analysert ved hjelp av to-ΔΔCT metode og rapportert som ganger endring i genekspresjon normalisert til den endogene kontroll genet (
GUSB
) og i forhold til celler uten behandling.
IRNA transfeksjon analysen
gemcitabin kjøpt resistente celler ble sådd på 24 microtitier Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) på 1,5 × 10
5 celler /brønn i 0,2 ml OptiMem og etter 24 timer ble transfektert med lipofektamin og
G9A
siRNA (Ambrion katt # 439242). Negativ kontroll ble gjort med lipofektamin RANiMAX inneholder siRNA Scramble (Ambrion, katt # 4390844). Celler ble dyrket ble dyrket ved 37 ° C i fuktet atmosfære inneholdende 5% C0
2. Etter 72 timer ble mediet aspirert og RNA ble ekstrahert, ble samt et cytotoksisk analyse utført.
Western blot-analyse
Hele celleekstrakter ble fremstilt i lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH
