Abstract
Samler bevis indikerer at mange microRNAs er involvert i tumordannelse og progresjon av magekreft, mens den kliniske betydningen av mikroRNA-214 i magekreft er dårlig forstått, og den eksakte rollen mikroRNA-214 i magekreft er fortsatt uklar. I den foreliggende studien ble ekspresjonsnivåer av mikroRNA-214 i 80 magekarsinom vev, 18 nontumourous gastrisk vev, og 4 typer av gastrisk kreft-cellelinjer kvantifisert ved revers transkripsjon, etterfulgt av sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR), og forholdet mellom mikroRNA-214 uttrykk og cliniopathological egenskaper inkludert prognose ble utforsket. For å undersøke den potensielle rolle mikroRNA-214 i magekreft celle biologisk atferd, utførte vi celleproliferasjon, apoptose, migrasjon og invasjon analyser i fire magekreft cellelinjer og en udødelig mage cellelinje
in vitro
. Våre resultater viste at mikroRNA-214 ble dramatisk nedregulert i mage kreft vev og mage kreft cellelinjer, sammenlignet med nontumourous mage vev. Trinnvis nedregulering av mikroRNA-214 uttrykk ble observert blant nontumourous mageslimhinnen, nonmetastasis mage kreft vev og metastase mage kreft vev. Ekspresjonen av mikroRNA-214 var signifikant omvendt korrelert med lymfeknutemetastase og tumorstørrelse, men hadde ingen sammenheng med pasientens prognose. Ektopisk uttrykk for mikroRNA-214 kan hemme celle migrasjon og invasjon evne i SGC7901 og MKN45 magekreftceller. Og knockdown av mikroRNA-214 i betydelig grad lettes celle proliferasjon, migrering og invasjon i en celle-spesifikk måte i MKN28, BGC823 og GES-1-celler. Kolonistimulerende faktor 1 (CSF1) ble identifisert som et målgen av mikroRNA-214. Oppsummert våre data viste at mikroRNA-214 er en lovende ny biomarkør for lymfeknutemetastaser hos pasienter med magekreft. Og vi identifisert at nedregulering av mikroRNA-214 kan regulere spredning, invasjon og migrering av magekreftceller ved direkte rettet mot CSF1
Citation. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) Clinicopathological Betydningen av mikroRNA-214 i magekreft og dens effekt på cellebiologiske Behaviour. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10,1371 /journal.pone.0091307
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 25. april 2013, Godkjent: 11 februar 2014; Publisert: 10 mars 2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81172351 og 81372856). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftdødelighet i verden [1]. Til tross for betydelige studier på tumorgenesen og progresjon av GC, er patogenesen av denne komplekse sykdom dårlig forstått. Det er således av stor klinisk verdi for å identifisere og karakterisere den nøyaktige molekylære mekanismen som er involvert i utvikling og progresjon av gastrisk karsinom.
I tillegg til konvensjonelle genetiske og epigenetisk endring av protein-kodende onkogener og tumor-suppressor-gener i den carcinogenesen av GC, nonprotein-koding RNA, spesielt microRNAs (mirnas), har dukket opp som en ny spiller å belyse mekanismen av GC utvikling [2]. Mirnas er endogene 19-25 nt ikke-kodende RNA som negativt regulerer protein uttrykk ved å fremme mRNA degradering eller undertrykke protein oversettelse, gjennom interaksjon med 3′-UTR til målet mRNA. Et økende antall miRNAs har blitt rapportert å delta i kreftutvikling og utvikling av kreft hos mennesker, inkludert GC [2] – [4]. Disse mirnas er vanligvis dysregulerte og funksjon enten som tumor suppressors eller onkogener i initiering og progresjon av menneskelige karsinomer. For eksempel, Tsukamoto et al. har vist at MIR-375 er nedregulert i magekreft og utøver sin proapoptotiske effekt gjennom downregulating PDK1, en kinase som fosforylerer Akt, og i sin tur undertrykker PI3K /Akt sti [5]. Mens MIR-21 er blitt funnet å fremme tumor proliferasjon og invasjon i GC ved negativt å regulere viktige tumor-suppressorer som PTEN, PDCD4, og RECK, og deretter konferere GC-celler med øket invasivitet og evnen til å unngå anoikis [6] – [8 ]. Tidligere har vi funnet ut at MIR-145 ble nedregulert i mangfoldige menneskelige kreftceller og undertrykt invasjonen-metastase kaskade i GC ved å hemme N-cadherin protein oversettelse [9], [10].
I dag, kliniske betydningen av mikroRNA-214 (MIR-214) i prognosen for pasienter med GC er dårlig forstått, og den eksakte rolle MIR-214 i GC er fortsatt uklart. Her undersøkte vi sammenhengen mellom Mir-214 uttrykk og cliniopathological parametere samt vurdert effekten av MIR-214 på biologiske atferd inkludert celleproliferasjon, apoptose, migrasjon og invasjon av GC-celler.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Vevsprøver ble fremstilt på en lignende måte som beskrevet tidligere [9]. Kort, 80 prøver (fra 65 menn, 15 kvinner, 58,3 ± 17,49 og 61,5 ± 9,162 år, henholdsvis) av GC vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Qi Lu Hospital of Shandong University fra 2004 til 2006. Nontumourous mageslimhinnen mer enn 3 cm fra tumorer ble tilfeldig valgt fra 18 av disse pasientene og anvendt som kontroller. Ingen av pasientene fikk preoperativ behandling, slik som strålebehandling eller kjemoterapi. Prøvene ble skrevet histologisk henhold til Lauren og Verdens helseorganisasjon (WHO) s klassifikasjoner (IARC Press, Lyon, 2000), og kategorisert i henhold til UICC 2002 TNM klassifisering.
Etikk uttalelse
studien ble godkjent av etikkomiteen av School of Medicine, Shandong University, Shandong, Kina (godkjenning kode: 201101015). Vi innhentet skriftlig informert samtykke fra alle deltakerne i vår undersøkelse.
Cell kultur
Fire typer av humant GC cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (MKN28 og MKN45, Manassas, VA , USA) og Shanghai Cancer Institute (BGC823 og SGC7901, Shanghai, Kina). Den foreviget mage mucosal epitel cellelinje GES-en er hentet fra Beijing ComWin Biotech Co., Ltd (Beijing, Kina). Cellene ble holdt i RPMI 1640 dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet inkubator celle med en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
mirna ekstraksjon
Ved hjelp av en miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Beijing, Kina), isolert vi miRNA fra parafininnstøpte vev i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA cellelinjer ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Takara, Dalian, Kina) etter produsentens protokoll. Kvaliteten og kvantiteten av RNA prøver ble vurdert ved hjelp av standard spektrofotometriske metoder (BioPhotometer pluss; Eppendorf, Hamburg, Tyskland) og fortynnet til 2 ng /mL for RT-qPCR analyse
revers transkripsjon etterfulgt av sanntid. kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR)
miRNA uttrykk nivåer ble kvantifisert ved hjelp av en SYBR Primescript miRNA RT PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner med et Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Fast -Tid system. Kort fortalt ble RNA prøver konvertert til cDNA ved en ett-trinns Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Kina), etterfulgt av real-time qPCR og normalisert ved hjelp U6 liten kjernefysiske RNA (RNU6B) av 2
-ΔCT metode. Primere for MIR-214 og U6 var fra GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Alle reaksjoner ble kjørt i duplikat.
Cell transfeksjon
eksponentielt voksende celler (1,5 × 10
5) ble sådd i 12-brønners plater 12 timer før transfeksjon og ble transfektert med 30 nM MIR-214 forløper (MIR-214), anti-MIR-214 inhibitor (MIR-214-hemmer), eller den negative kontrollen (Ambion, Austin, TX, USA) ved hjelp av X-tremeGENE transfeksjon reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfeksjonseffektiviteten ble overvåket ved RT-qPCR på 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon.
For stabil ekspresjon av MIR-214, SGC7901 og MKN45-celler ble transfektert med lentivirus MIR-214-uttrykkende vektor LV3-HSA -miR-214 eller en negativ kontroll LV3NC, som har GFP som en markør protein, i henhold til produsentens protokoll (GenePharma, Shanghai, Kina). Tre dager etter transfeksjon, ble ekspresjon av GFP-proteinet overvåket i henhold til fluorescens mikroskop. De transfekterte celler ble screenet med puromycin (1,5 ug /ml) for de som stabilt uttrykker MIR-214.
celleproliferasjonsanalyse
Etter transfeksjon ble cellene trypsinisert, telles og sådd ut på 96 -vel plater ved en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn. Og deretter celleproliferasjon ble målt ved anvendelse av EDU proliferasjonsanalyse som tidligere rapportert [11]. Kort, 24 timer etter transfeksjon, ble cellene dyrket i tre eksemplarer på 5 × 10
3 celler per brønn i 96-brønners plater dagen før Edu inkubasjon (Ribobio, Guangzhou, Kina). Etter EDU merking ble cellene behandlet med 100 ul av 1 x Apollo reaksjon cocktail, farget med 100 ul av Hoechst 33342 (5 ug /ml) og visualisert under et fluorescens mikroskop (Olympus, Japan). Prosentandelen av EDU-positive celler ble definert som den formeringshastigheten. Data ble hentet fra tre uavhengige forsøk og presenteres som betyr ± standardavvik (SD).
Cell apoptose analysen
Tre dager etter transfeksjon av MIR-214 forløper eller inhibitor, celler ble samlet og farget bruker Annexin V-FITC /PI apoptose Detection Kit (BestBio, Shanghai, Kina) som tidligere beskrevet [12]. I korte trekk ble cellene trypsinert, samlet og deretter farget med Annexin V-FITC /PI apoptose Detection Kit følge produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon med Annexin V-FITC og PI ble de apoptotiske celler umiddelbart analysert ved hjelp av strømningscytometri. Tidlig apoptotiske celler ble definert som det materiale som var PI negativ og Annexin V-FITC positiv, mens slutten av apoptotiske celler ble PI positive og Annexin V-FITC positiv. Den totale apoptotiske ble beregnet som tidlig apoptotisk rente pluss sent apoptotiske rate. Annexin V-PE /7-AAD apoptose Detection Kit (keygen, Nanjing, Kina) ble brukt for apoptose analysen av lentivirus vektor transfekterte celler, som ligner på de ovennevnte protokoller. Hvert forsøk ble utført in triplo, og data ble presentert som gjennomsnitt ± SD.
Cellemigrering og invasjons assays
cellemigrering og invasjons analyser ble utført som tidligere beskrevet [13]. Migrasjon assay ble utført med Transwell innsatser med 8,0 mm porestørrelse membran (24-brønners-formatet, Corning, New York, USA). For å måle invasjon evne til GC-celler, de tidligere nevnte innskudd ble forhåndsbelagt med Matrigel matrise (BD Science, Sparks, MD, USA). Cellene (1 x 10
5) ble resuspendert i serumfritt medium og podet til det øvre kammer. De nedre kamre ble fylt med komplett kulturmedium inneholdende 10% FBS. Etter inkubering ved 37 ° C i 24 timer, ble de migrerte celler tilstede på den nedre side av membranen fiksert, farget og tellet. Hvert forsøk ble utført in triplo.
Luciferase-analyse
Dual-luciferase-analyser ble utført som tidligere beskrevet [9]. 3′-UTR fragmenter av CSF1 gen som inneholder den MIR-214 bindingssete ble amplifisert ved PCR fra MKN45 celle RNA ved å bruke primerne i tabell S1, og satt inn i stedet for Xba1 pmirGLO miRNA target-ekspresjonsvektoren (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Den resulterende vektor ble kåret pmirGLO-CSF1. For luciferase reporter analysen ble MKN45 og BGC823 celler sådd ut i en 12-brønn plate på dag før transfeksjon. Cellene ble ko-transfektert med 30 nM av MIR-214 forløper eller MIR-214-hemmer, negativ kontroll og 30 ng pmirGLO-CSF1 bruker X-tremeGENE transfeksjon reagens (Roche Applied Science). Etter 48 timers transfeksjon, ble luciferase-aktivitet målt ved hjelp av den doble luciferase-analysesystemet (Promega) og normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. Hvert forsøk ble utført in triplo.
Western blot
I 48 timer etter transfeksjon med MIR-214-forløper eller inhibitor, ble cellene underkastet Western blot-analyse, som beskrevet tidligere [19]. I korthet protein ble ekstrahert fra celler eller vev. Lysates ble løst ved elektroforese, overført til nitrocellulosemembraner og utslettet med antistoffer mot CSF1 (1:1000, Epitomics) eller β-aktin (1:1000, Santa). Data ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter.
Statistisk analyse
Analyser ble utført ved hjelp av statistikkpakken Prism 5-programvaren (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Forskjeller ble analysert med Student
t
-test mellom to grupper eller med enveis ANOVA mellom tre grupper. Korrelasjonen mellom MIR-214 uttrykk og tumorstørrelse i grunnskolen GC ble beregnet ved Spearman korrelasjon. I overlevelseskurve, ble data analysert av Log-rank test. For å finne ut i hvilken grad uttrykk for MIR-214 kan effektivt skille ulike kliniske subsettings, mottaker drift karakteristikk (ROC) kurve analyse ble bygget og området under kurven (AUC) ble beregnet til å vurdere muligheten av MIR-214 uttrykk å differensiere mellom krefttilfeller og nontumourous tilfeller og å skille metastatisk vev og ikke-metastatisk vev.
P
-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
MiR-214 er nedregulert i mage karsinom vev og fire GC cellelinjer, sammenlignet med nontumourous mageslimhinnen
i sammenligning med 18 nontumourous mageslimhinnen prøver, MIR-214 var signifikant nedregulert (ca. seks ganger) i 80 primær mage vevsprøver (Figur 1A,
P
= 0,0001). Mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver av MIR-214 reflektert sterk skille mellom GC vev og nontumourous vev, med et areal under kurven (AUC) av 0,7764 (figur S1 A, 95% konfidensintervall (CI), 0,6466 til 0,9062). Konsekvent, nedregulering av MIR-214 ble validert i fire mage cellelinjer. Som vist på figur 1C, ble MIR-214 ekspresjonsnivå i GC cellelinjer MKN28, BGC823, MKN45, og SGC7901 markert svekkede sammenlignet med 18 nontumourous gastrisk vevsprøver (
P
0,05).
(A) Sammenlignet med 18 nontumourous mageslimhinnen ble MIR-214 signifikant nedregulert i 80 primær mage vev (
P
= 0,0001). MiR-214 uttrykk var e no lavere i primær mage vev med spredning (metastase) enn primær mage vev uten metastaser (Nonmetastais). (B) Primære gastrisk vev ble videre delt inn i en lav-metastasering gruppe og en høy-metastase gruppe i henhold til antallet av lymfeknutemetastase. (The cutoff ble satt som seks, som er en terskel for å skille N0~N1 og N2~N3 i TNM trinn (UICC, 2002). MiR-214 ble dramatisk redusert i høy-metastaser sammenlignet med gruppen med lav metastase gruppe (
P
= 0,0455). (C) MiR-214 downregulation ble validert i fire mage cellelinjer. Sammenlignet med godt moderat differensiert cellelinje MKN28, MIR-214 ble markert svekket i dårlig differensiert cellelinje MKN45 og BGC823, og moderat dårlig differensiert og svært metastatisk cellelinje SGC7901. Men vi har oppdaget lavere uttrykk for MIR-214 i GES-en, en udødelig gastrisk epitel cellelinje, sammenlignet med fire magekreftceller (
*
P
.. 0,05) (D) Association mellom Mir-214 uttrykk og tumorstørrelse i grunnskolen GC ble beregnet ved Spearman korrelasjon Våre data antydet at Mir-214 uttrykk ble omvendt korrelert med tumorstørrelse (Spearman r = -0,2673,
P
= 0,0083).
Men vi har oppdaget enda lavere uttrykk for MIR-214 i GES-en, en udødelig gastrisk epitel cellelinje, enn i fire GC cellelinjer (figur 1C
P
0,05). Vi spekulere uoverensstemmelse kan skyldes i det minste delvis til forskjellen mellom kliniske prøver og cellelinjer, fordi en cellelinje, isolert fra en pasient med en viss sykdom, representerer miRNA ekspresjon signatur av kun en klinisk prøve, og kan endringer i løpet av celle kultur
in vitro
; med andre ord, vevsprøver er mye mer som den menneskelige sammenheng enn cellelinjer. Derfor vi kommentere at Mir-214 uttrykk i menneskelige GC vev var mer representativ og troverdig enn det som finnes i cellelinjer.
Redusert Mir-214 uttrykk i GC er assosiert med lymfeknutemetastaser og tumorstørrelse, men har ingen sammenheng med pasientens prognose
for å finne potensielle clinicopathological konsekvenser av endret Mir-214 uttrykk, kombinert vi qPCR resultatene og kliniske parametre. Sammenhenger mellom Mir-214 uttrykk nivå og clinicopathological kjennetegn ved GC er oppsummert i tabell 1. MiR-214 uttrykk ble omvendt korrelert med tumorstørrelse (tabell 1,
t
-test,
P
= 0,0265, figur 1D, Spearman r = -0,2673,
P
= 0,0083) og lymfeknutemetastase (tabell 1, Figure1A,
t
-test,
P
= 0,0164). Men det var ingen signifikant forskjell i andre clinicopathological funksjoner som kjønn, distal metastaser, WHO histologiske klassifikasjon, og Lauren histologisk type mellom disse to gruppene.
Forbløffende nok fant vi trinnvis nedregulering av MIR-214 blant nontumourous mageslimhinnen, nonmetastasis vev og metastase vev (Figur 1A, enveis ANOVA,
P
= 0,0006). For å evaluere MIR-214 uttrykk i GC som en ny biomarkør for lymfeknutemetastaser, ble ROC-kurver etablert. Vi observerte klare separasjoner mellom pasienter med lymfeknutemetastaser og de uten lymfeknutemetastaser, med en AUC på 0,5880 (figur S1B, 95% CI, 0,4526 til 0,7166). De primære gastrisk vev ble videre delt inn i en lav-metastasering gruppe og en høy-metastase gruppe i henhold til antallet av lymfeknutemetastaser (LNM): lav metastase ble definert som tilfeller med mindre enn seks LNM, og tilfeller med mer enn seks LNM ble vurdert som høy metastaser. Som forventet, ble MIR-214 uttrykk dramatisk redusert i høy-metastase gruppen sammenlignet med den lave metastase gruppe (figur 1B,
P
= 0,045).
I samsvar med vevsprøve data som indikerer sammenhengen mellom Mir-214 uttrykk og LNM, fant vi ut at, sammenlignet med moderat godt differensiert cellelinje MKN28, Mir-214 uttrykk var markant mindre i dårlig differensierte cellelinjer MKN45 og BGC823, og spesielt metastatisk cellelinje SGC7901 [14] (
P
0,05)
Men våre data viste ingen signifikant forskjell fra Mir-214 uttrykk i 18 primær mage vevsprøver og deres sekundære metastase loci (figur 1B.
P
= 0,2676). Disse resultatene tyder på at nedregulering av Mir-214 uttrykk skjedde i den tidlige fasen av LNM utvikling og holdt seg stabil uten ytterligere svekkelse i sent stadium av metastaser.
For ytterligere å undersøke effekten av MIR-214 på prognosen for pasienter, analyserte vi uttrykket nivåer av MIR-214 i tilfeller med forskjellige tilbakefall status og overlevelsesvilkår. Men våre data viste at det var ingen uttalt forskjell mellom tilbakefall gruppen og nonrelapse gruppe, eller mellom overlevelse gruppen og død gruppen (figur 2A-B,
t
-test,
P
0,05). Av notatet, fordelt vi pasientene inn i high-uttrykk og lav-uttrykk grupper basert på medianverdien for Mir-214 uttrykk, og Kaplan-Meier overlevelseskurver viste ingen signifikant korrelasjon mellom Mir-214 uttrykk og tilbakefall overlevelse (Figur 2C , hazard ratio (HR) 1,23, 95% konfidensintervall (KI) 0,6596 til 2,285;
P
= 0,5781) eller total overlevelse (figur 2D, HR 1,20, 95% KI 0,6667 til 2,151;
P
= 0,5832) hos pasienter med GC.
(A) Vevsprøver ble delt inn i en utgivelse gruppe og en nonrelease gruppe i henhold til utfallet av pasientene. Våre data viste ingen signifikant forskjell i Mir-214 uttrykk mellom disse to gruppene (
P
0,05). (B) Som i (A), bortsett fra de kliniske prøvene ble klassifisert som overlevelse gruppe og død gruppe (
P
0,05). (C, D) Vi delte pasientene inn i høy-uttrykk og lav-uttrykk grupper basert på medianverdien for Mir-214 uttrykk. Kaplan-Meier overlevelseskurver viste ingen signifikant korrelasjon mellom Mir-214 uttrykk og tilbakefall overlevelse (hazard ratio (HR) 1,23, 95% konfidensintervall (KI) 0,6596, 2,285,
P
= 0,5781) eller generelle overlevelse (HR 1,20, 95% KI 0,6667, 2,151,
P
= 0,5832), selv om det var en trend som høy uttrykk for MIR-214 var assosiert med kortere tilbakefall overlevelse (median overlevelse: 28.00 måneder versus 74,50 måneder, for High uttrykk og lav uttrykk, henholdsvis) eller total overlevelse (median overlevelse:. 40.00 måneder versus 47.50 måneder, for høy uttrykk og lav uttrykk, henholdsvis)
Effekt av MIR-214 på celle spredning av GC-celler
for å overvåke transfeksjon effektivitet, bestemt vi Mir-214 uttrykk ved RT-qPCR på 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon i MIR-214 forløper eller inhibitor transfekterte celler og kontinuerlig oppdaget speil 214 ekspresjon av lentivirus vektorer behandlede celler i 4 uker. Som forventet, transfeksjon av MIR-214 forløper effektivt resulterte i betydelig overekspresjon av MIR-214 (figur S2A-B,
P
0,05) og Mir-214 hemmer påfallende redusert Mir-214 uttrykk i speil 214 hemmer-transfekterte celler enn de negative grupper (figur S3E-F, figur S4 A,
P
0,05). Vi fant også at celler transfektert med lentivirus vektor LV3-HSA-MIR-214 kan føre til en 7-96 ganger endring av Mir-214 uttrykk i SGC7901 og MKN45 celler (figur S3A-D,
P
0,05), med 80% -90% celler som uttrykker GFP markør protein (figur S3A, B)
for å finne ut om MIR-214 kan påvirke spredning av GC-celler, edu spredning analysen ble brukt til. oppdage cellevekst evne. Våre data viste at overekspresjon av MIR-214 med lentiviurs vektorer eller MIR-214 forløper ikke påvirke cellevekst av SGC7901 (figur 3A-B, Figur S2C-D, P 0,05) og MKN45 cellelinjer (figur S2E-F, figur s5a-B, P 0,05). Men vi fant ut at downregualtion av MIR-214 kan fremme spredning av BGC823 (figur 3C-D,
P
= 0,0010) og GES-en (figur S4B-C,
P
= 0,0474), men ikke MKN28 cellelinje (figur S5C-D,
P
= 0,0938), i en celle-spesifikk måte.
(A, C) Representative fotografier etter transfeksjon med lentivirus mir -214-uttrykke vektor i SGC7901 celler og MIR-214 inhibitor i BGC823 celler (forstørrelse 100 ×). (B, D) Prosentandelen av Edu positive celler, beregnet av Edu-merket celle (rød) tall i forhold til total celle nummer (Hoechst-farget, blå), ble definert som spredning rate. Dataene viste ingen signifikant forskjell på formeringshastigheten mellom LV3-HSA-MIR-214-transfektert gruppe og den negative kontrollgruppen i SGC7901 celler (
P
0,05). Mens vi fant ut at MIR-214 inhibitor transfeksjon kan resultere i en påfallende øke spredning evne BGC823 celler (
P
= 0,0010).
Role of MIR-214 i celle migrasjon og invasjon av GC-celler
Som Mir-214 uttrykk ble omvendt assosiert med lymfeknutemetastaser, var vi spesielt interessert i muligheten MIR-214 for å påvirke celle migrasjon og invasjon. Våre resultater viste at SGC7901 og MKN45-celler transfektert med LV3-HSA-MIR-214 viste en betydelig redusert migrering og invasjon evne, sammenlignet med LV3NC behandlede celler (figur 4A-B, figur S6a-B,
P
0,05). Og vi observert at downregualtion av MIR-214 kan lette migrasjon og invasjon av MKN28 (figur 4C-D,
P
= 0,0491 og
P
= 0,0127, henholdsvis). Selv knockdown av MIR-214 ikke påvirker migrasjon av GES-1 celler (Figur S4D-E,
P
= 0,0879), stanse av MIR-214 førte til en mer enn 40% økning i invasive egenskaper av disse cellene (
P
= 0,0046). Men våre data viser at transfeksjon av MIR-214 forløper ikke har en robust effekt på celle migrasjon og invasjon i SGC7901 (figur S2G-H,
P
0,05) og MKN45 (figur S2I-J,
P
. 0,05) celler, sammenlignet med de respektive negative kontroller
(A, C) Representative bilder av migrasjon og invasjon analyser i SGC7901 og MKN28 celler (forstørrelse 200 ×) er vist . (B, D) De migrerte celler ble tellet ved å velge fem felt av hvert kammer tilfeldig og beregning av det gjennomsnittlige antall. Våre resultater viste at LV3-HSA-MIR-214 transfeksjon markant redusere migrasjon og invasjon evne SGC7901 (
P
= 0,0143 og 0,0210, henholdsvis). Mens knockdown av MIR-214 med MIR-214 hemmer fremmer cellemigrasjon (
P
= 0,0491) og invasjon (
P
= 0,0127) i MKN28 celler.
påvirkning av MIR-214 på celle apoptose av GC-celler
for å undersøke effekten av MIR-214 på celle apoptose, utførte vi apoptose analyser ved hjelp av Annexin V-FITC /PI farging metoden. Våre resultater viste at overekspresjon (MIR-214-forløper og lentivirus-vektor) og knockdown av MIR-214 ikke kan påvirke celle apoptose åpenbart sammenliknet med negative kontroller i fire GC-cellelinjer (figur 5, Figur S2K-N,
P
0,05) og udødeliggjort cellelinje gastrisk GES-1 (data ikke vist). Faktisk fant vi en tendens til pro-apoptose evne MIR-214 forløper i MKN45 cellelinje (figur S2M-N,
P
= 0,0606), men forskjellen var ikke statistisk signifikant.
(A, C, E, G) Celler ble merket med Annexin V-PE /7-AAD eller Annexin V-FITC /PI, og analysert ved flowcytometri. Alle disse tallene er representative for tre uavhengige analyser. Quadrant statistikk: nekrose eller mekanisk skadde celler i øvre venstre (UL), slutten av apoptose celler i øvre høyre (UR), levedyktige celler i nedre venstre (LL) og tidlig apoptose celler i nedre høyre (LR). (B, D, F, H) Andelen av tidlige apoptose celler, sent apoptose celler og totalt apoptose celler ble henholdsvis forhold mellom LV3hsa-MIR-214 transfektert gruppen og NC gruppe, eller mellom MIR-214 inhibitor-transfektert gruppe og inhibitor NC gruppe. Våre data viser at LV3-HSA-MIR-214 eller MIR-214-hemmer har ingen effekt på celle apoptose i SGC7901, MKN45, MKN28 og BGC823 celler (
P
0,05). Selv om vi har observert en trend med pro-apoptose evne MIR-214 i MKN45 cellelinje, men forskjellen var ikke statistisk signifikant (
P
= 0,0950).
speil 214 direkte rettet mot og nedregulerer CSF1 i magekreftceller
for å identifisere mål av MIR-214, brukte vi TargetScan algoritme for å forutsi Mir-214 mål i human magekreft. Blant de mange mulige kandidater, vi plukket ut de overuttrykt i kreft og proliferation- og metastaseassosierte gener, inkludert NOTCH2, FGFR1, CSF1 (figur 6A), AGAP2, CREB1, for videre analyse. Våre resultater viste at MIR-214 forløper transfeksjon signifikant reduksjon i aktiviteten av et luciferase reporter-gen fusjonert til CSF1 3′-UTR, med 29,60% og 30,61% reduksjon i forhold til de negative kontrollgrupper (Figur 6B,
P
= 0,0227 og 0,0093, henholdsvis for MKN45 og BGC823 cellelinjer). Mens når MIR-214 inhibitor ble transfektert, ble luciferase aktiviteten økt med 34,49% og 42,25% i MKN45 og BGC823 celler sammenlignet med kontrollene (figur 6C,
P
= 0,0115 og 0,0085, henholdsvis).
(A) den komplementære sekvenser av CSF1 mRNA 3′-UTR er vist med MIR-214 sekvens. (B) Luciferase aktivitet i MKN45 og BGC823 celler transfektert med MIR-214 og pmirGLO-CSF1 var signifikant avdøde sammenlignet med de negative kontrollene (
P
= 0.0227 og 0,0093, henholdsvis). (C) Etter MIR-214 inhibitor ble transfektert, luciferase aktivitet ble dramatisk økt i MKN45 og BGC823 celler sammenlignet med kontrollene (
P
= 0,0115 og 0,0085, henholdsvis). (D) Virkning av MIR-214 på CSF1 nivåer ble testet i GC cellelysater ved Western blot. (E). Våre data viser at den relative CSF1 ekspresjon ble betydelig redusert i celler transfektert med MIR-214 precrusor sammenlignet med celler transfektert med negativ kontroll (
P
= 0,0037 og 0,0066, henholdsvis).
Vi bestemte ytterligere ekspresjon av CSF1 protein ved western blot i GC-celler transfektert med MIR-214-forløper eller inhibitor. I samsvar med luciferase resultatene er uttrykk for CSF1 protein ble betydelig redusert i SGC7901 og MKN45 celler (Figur 6D-E,
P
= 0,0037 og 0,0066, henholdsvis) transfektert med MIR-214 forløper og økt i MKN28 og BGC823 celler (figur S7A-B,
P
= 0,0049 og 0,0416, henholdsvis) transfektert med MIR-214 inhibitor, sammenlignet med de respektive kontrollene. Disse data antydet at MIR-214 hemmer CSF1 oversettelse i magekreftceller.
Diskusjoner
Emerging bevis har fremhevet den avgjørende betydningen av miRNA feilregulering på tumorgenesen menneske karsinom [3], [4] . Mirna dysregulation fremmer celledeling, gir resistens mot apoptose, og forbedrer invasivitet og metastasering, gjennom å undertrykke nedstrøms tumor suppressors eller indusere akkumulering av målet onkogener, og dermed er involvert i initiering, progresjon, og metastasering av humane tumorer.
Blant overfloden av miRNAs, feilregulering av MIR-214 ble funnet i god kreft hos mennesker [15] – [22]. Nedregulering av MIR-214 i livmorhalskreft har blitt rapportert av flere grupper, og MIR-214 har vist seg å hemme veksten, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller ved å målrette onkogener MEK3, JNK1, Plexin-B1, og GALNT7 [15 ] – [17]. MiR-214 er også funnet å være redusert i brystkreft og bidra til bryst tumorgenesen ved å tillate abnormt forhøyet oncogen Ezh2 akkumulering og etterfølgende ukontrollert celleproliferasjon og invasjon [18]. Ueda et al. [28].
