Abstract
Bakgrunn
Bone danne metastaser er en vanlig og invalidiserende konsekvens av prostatakreft (CAP). Den potensielle rolle osteoclastaktivitet i Cap benmetastaser er ikke helt forklart. I denne studien undersøkte vi
ex vivo
om osteolytic aktivitet er til stede og hvordan den er styrt i Cap pasienter med bein danner metastaser.
Metodikk
Førti-seks pasienter påvirket av nylig diagnostisert Cap og friske kontroller ble inkludert. Ved diagnose, 37 pasienter hadde bare en primærtumor, mens 9 hadde primærtumor og ledsagende skjelettdannende metastaser. Hos alle pasienter var det ingen tegn på metastasering til andre ikke-ben-steder. For alle pasienter og kontroller vi samlet blod og urinprøver. Vi vurderte pasientenes bein homeostase; vi gjort perifert blod mononukleære celler (PBMC) kulturer å oppdage
in vitro
osteoclastogenesis; vi dosert serum ekspresjon av molekyler som er involvert i kreft indusert osteoclatogenesis, slik som RANKL, OPG, TNF-alfa, DKK-1 og IL-7. Real-Time PCR, kvantifisert vi DKK-1 og IL-7 genekspresjon på mikro dissekert svulsten og seksjoner friske vevet.
hovedfunnene
Cap beinmetastatiske pasienter viste beinmetabolisme avbrudd med økt benresorpsjon og dannelse sammenlignet med ikke-bein metastatiske pasienter og friske kontroller. Hetten PBMC kulturer viste en forbedret osteoclastogenesis i bein metastatiske pasienter, på grunn av en økning på RANKL /OPG forholdet. Vi har registrert økt DKK-1 serumnivåer og vev genuttrykk hos pasienter sammenlignet med kontroller. IL-7 resulterte høy i pasientenes sera, men dens vev genekspresjon var sammenlignbar hos pasienter og kontroller.
Konklusjoner
Vi demonstrerte
ex vivo Hotell som osteoclastogenesis er en aktiv mekanisme i tumor hekke av bein danner metastatisk kreft og at serum DKK-1-nivå øker i Cap pasienter, noe som tyder på dypt undersøke sin rolle som svulst markør
Citation. Roato jeg, D’Amelio P, Gorassini E , Grimaldi A, Bonello L, Fiori C, et al. (2008) osteoklaster Aktiv i Bone Forming metastaser av prostatakreftpasienter. PLoS ONE 3 (11): e3627. doi: 10,1371 /journal.pone.0003627
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 30 september 2008; Godkjent: 15 oktober 2008; Publisert: 03.11.2008
Copyright: © 2008 Roato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Compagnia di San Paolo og Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2008)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostate kreft (CAP) er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn [1]. Et typisk trekk ved Cap er evnen til å metastatize til beinet, som mer enn 80% av menn som døde for Cap utviklet benmetastaser [2]. Vekst av Cap innenfor bein fremmer primært osteoblastiske lesjoner med underliggende osteolytiske områder [1]. I fysiologiske forhold osteoklastene (OC) og osteoblastaktivitet er godt balansert, men i patologisk tilstand denne likevekt (bein homeostase) blir forstyrret. Rollen til piller i osteolytiske metastaser er blitt klart demonstrert, og det har vært antydet at piller kan spille en viktig rolle i de osteoblastiske metastaser også. Interaksjoner mellom Cap celler, osteoblaster og p-piller tyder på at bein tropisme kan være forårsaket av svulst avhengighet av en eller flere osteoblast /OC-avledet faktorer for kreft celle vekst og vedlikehold [3].
Vi har tidligere vist at pasienter med osteolytiske benmetastaser fra ulike solide svulster viste enhanced spontan osteoclastogenesis, på grunn av økt T cell frigjøring av pro-osteoclastogenic faktorer, slik som TNF-alfa, IL-7 og RANKL [4]. Rollen OPG /RANKL aksen i osteolytic komponent i Cap-mediert benmetastaser er klarlagt [5], mens TNF-alfa og IL-7 mulige funksjoner i Cap benlesjoner fortsatt uklare.
Andre viktige faktorer i ben biologi er WNTs, en familie av små utskilte glykoproteiner, som hemmer OC differensiering [6], stimulerer osteoblastogenesis og mineralizing aktiviteten til osteoblaster [7]. Aktiviteten av WNT familie antagoniseres av flere utskilte faktorer som dickkopf (DKK) proteiner. Nyere data rapportert DKK-1 uttrykk i noen menneskelige eksemplarer av svulster, noe som tyder på at en kreft-mediert modulering av WNT aktivitet påvirker metastatisk fenotype [8], [9].
Denne tverrsnitts etterforskning er designet for å studere hvordan bein danner metastaser ved Cap påvirker bein omsetning, OC dannelsen av perifere mononukleære blodceller (PBMC), og produksjon av osteoclastogenic og anti-osteoclastogenic faktorer hos pasienter rammet av beinmetastatisk Cap.
Vi rapporterer økt osteoclastogenesis i Cap bein metastatiske pasienter, på grunn av en økning i serum RANKL /OPG-forhold, noe som tyder på at økt OC formasjon spiller en aktiv rolle i bein danner metastaser. Vi oppdaget høy DKK-en serumnivåer og genuttrykk i Cap pasienter sammenlignet med friske kontroller.
Resultater
Bone omsetningen er økt i beinmetastatiske pasienter
De markører for bein omsetningen var høyere hos pasienter med skjelettmetastaser sammenlignet med ikke-bein metastatiske pasienter og friske kontroller (tabell 1). I detalj, fikk CAP pasienter ikke viser signifikante forskjeller i beintetthet, men hadde høyere PTH, BAP, BGP, TRAPC5b og tverrbindings nivåer enn friske kontroller. Disse resultatene bekrefter avbrudd i bein homeostase med økt benresorpsjon og dannelse i metastatiske pasienter.
Osteoclastogenesis økes i Cap benmetastaser
For å vurdere om styrking av benresorpsjon i metastatisk pasienter skyldes en økning i OC formasjon, undersøkte vi muligheten for
in vitro
PBMC spontant skille i p-piller hos pasienter med eller uten benmetastaser og hos friske kontroller.
The OC differensiering ble demonstrert ved nærvær av flerkjernede /TRAP-positive celler fra kreftpasienter og friske kontroll PBMC (fig. 1 A-C). Som vist i fig. 1D antall p-piller var signifikant høyere i beinmetastatiske pasienter (gjennomsnitt ± SE, 216,22 ± 39,55) enn hos pasienter uten skjelettmetastaser (112,71 ± 14,76) og friske kontroller (73.55 ± 11.69),
p
. 0,001
FELLE positive multinucleated celler ble identifisert som p-piller og telles, både pasienter og friske kontroller kulturer, (A). The OC nummer i beinmetastatiske pasienter var betydelig høyere enn hos ikke-bein metastatiske pasienter
p
0,004 og hos friske kontroller,
p
. 0,001 (B)
RANKL /OPG forholdet økes ved metastaserende pasienter
for å undersøke hvilke faktorer som er ansvarlig for den økte osteoclastogenesis hos pasienter, vi dosert serumnivåene av TNF-alfa, RANKL og OPG. De TNF-alfa serumnivåene var ikke signifikant forskjellig mellom de tre gruppene (data ikke vist), mens vi observerte en betydelig økt ratio RANKL /OPG i beinmetastatisk sera (19,62 ± 6,52) sammenlignet med ikke-metastatiske pasienter (5,48 ± 2,48) og friske kontroller (6,89 ± 2,6),
p
. 0,03
IL-7 serum nivået økes hos kreftpasienter
Vi målte IL-7 serumnivåer i pasienter og kontroller. Serum IL-7-nivåene var signifikant høyere hos pasienter med metastatisk bein pasienter (middelverdi ± SE, 19,86 ± 2,01 pg /ml) enn i friske kontroller (7,07 ± 1,27 pg /ml), p 0,001. Vi dosert tilsvarende IL-7-nivåer i ikke-metastaserende ben (19,75 ± 3,55 pg /ml) og skjelettmetastatiske pasienter (19,86 ± 2,01 pg /ml), (fig. 2A). Dette resultatet førte oss til å undersøke om tumorceller var ansvarlige for økningen av IL-7 produksjon; derfor har vi undersøkt den kvantitative IL-7 uttrykk i hetten og i friske prostata vev. Tumor-celler uttrykte lave og sammenlignbare nivåer av IL-7 i pasienter og friske kontroller (fig. 2B). Dette tyder på at øket sirkulerende IL-7 kan være avhengig av produksjonen av immunsystemet cellen, slik som T- og B-lymfocytter [4].
IL-7-serumnivåer i pasienter med /uten benmetastaser og i friske kontroller ble målt ved hjelp av ELISA. Bone metastatisk (
p
0,01) og ikke-bein metastatiske pasienter (
p
0,03) hadde signifikant høyere IL-7 serumnivåer sammenlignet med friske kontroller (A). Cap og friskt vev ble analysert ved Real-Time PCR for å kvantifisere IL-7 genuttrykk. IL-7 kvantisering ble uttrykt som IL-7 på β-Actin (kontrollen genet) plasmid-kopiantall. Histogrammet viste sammenlign IL-7 uttrykk nivåer i Cap og friskt vev.
DKK-1 uttrykk er høyere i Cap pasienter
Litteratur data rapportert at DKK-en er involvert i bein homeostase [8]. Vi dosert DKK-en serumnivå i Cap pasienter og friske kontroller. Cap pasienter viste høyere DKK-1-nivåer enn friske kontroller,
p
0,004 (Fig. 3A). For å vurdere hvorvidt DKK-en er produsert av kreft vev, studerte vi uttrykket på hetten og friskt vev ved RQ-PCR. Våre data viser at CAP vev uttrykt betydelig mer DKK-en enn friskt vev, p. 0,001 (Fig. 3B)
DKK-1 nivåene ble dosert i serum hos pasienter med /uten benmetastaser og hos friske kontroller av ELISA. Bone metastatisk (
p
0,004) og ikke-bein metastatiske pasienter (
p
0,01) hadde signifikant høyere DKK-1 serumnivåer sammenlignet med friske kontroller (A). Cap og friskt vev ble analysert ved Real-Time PCR for å kvantifisere DKK-1gene uttrykk. Den DKK-en kvantisering ble uttrykt som DKK-1 på β-Actin (kontrollen genet) plasmid-kopiantall. Histogrammet viste høyere DKK-1 uttrykk nivåer i Cap enn i friskt vev,
p
. 0,001 (B)
Diskusjoner
Prostatakreft ofte utvikle bein danner metastaser; likevel en rask osteolytic aktivitet er til stede i metastatisk sammenlignet med ikke-metastatiske pasienter [10]. Mekanismene gjennom hvilke Cap fremmer avvik benremodelleringen er ikke klart definert. Avsløringen av tumor hekkende i bein kan gi nye verktøy for tidlig diagnose av benmetastaser og foreslå nye terapeutiske regimer for kontroll av Cap progresjon. Målet med vår studie var å undersøke hvordan osteolytic komponent av bein metastase påvirker bein omsetning, OC dannelsen av PBMC, og produksjon av osteoclastogenic og anti-osteoclastogenic faktorer hos pasienter som lider av beinmetastatisk Cap.
I utvalg av Cap tilfeller, bestemte vi oss for å unngå pasienter med avansert metastatisk sykdom, siden terapeutiske regimer kan representere en bias for vår analyse. I denne studien har vi en ubalanse mellom bein og ikke-bein metastatiske pasienter nummer, som avhenger av tilstedeværelsen av en mindre mengde bein metastatisk sammenlignet med ikke-bein Cap pasienter med metastatisk ved diagnose [3]. Faktisk, i den naturlige historie av sykdom, benmetastaser er en hyppig, men sent aktivitet [11].
Benomsetningen ble forbedret i bein metastatiske pasienter, spesielt vi observert både en økning i beindannelse og resorpsjon markører. PTH nivå ble noe økt i beinmetastatiske pasienter sammenliknet med friske kontroller, ifølge PTH evne til å fremme vekst og invasivitet av prostatakreftceller i bein [12].
Den observerte økningen i benresorpsjon og tidligere demonstrert spontan osteoclastogenesis hos kreftpasienter med osteolytiske metastaser [13] bedt oss om å undersøke osteoclastogenesis fra Cap pasientenes PBMC
in vitro
. OC formasjonen var høyere i beinmetastatiske pasienter sammenlignet med både ikke-bein metastatiske pasienter og friske kontroller. For å identifisere de faktorene ansvarlig for økningen i OC formasjon, målte vi molekyler hovedsakelig involvert i osteoclastogenesis, for eksempel TNF-alfa, RANKL, OPG, IL-7 og DKK-en. TNF-alfa-serumnivåer ble ikke signifikant øket i pasienter med netting, forskjellig fra andre bein metastatiske tumorer, hvor TNF-a spiller en viktig rolle i osteoclastogenesis [14]. Ellers RANKL /OPG forholdet var høyere i bein metastatiske pasienter, forklarer den økte osteoclastogenesis og i henhold til tidligere litteraturen [15].
Samspillet mellom kreftceller, immunforsvaret og beinvevet har blitt en relevant gjenstand for intensive studier. Siden IL-7 engasjement i beinmetastaser ble tidligere demonstrert i andre svulster [4], [16] undersøkte vi dette problemet viser en økning i serum IL-7 nivåer i Cap pasienter med og uten bein lesjoner. Økningen av IL-7 kan redegjøre for RANKL /OPG augment, ettersom IL-7 stimulerer RANKL produksjon fra T-celler [17]. Vi evaluerte IL-7 genuttrykk i Cap og normal prostata vev, viser sammenlign IL-7 uttrykk i prostatakreft og normalt vev. Dette resultatet er forskjellig fra vår publiserte data på lungekreft, hvor tumorvevet uttrykt høyere IL-7-nivåer sammenliknet med den normale motstykke [18]. Vi foreslår at dette avviket kan skyldes de ulike tumortype og bein metastatisk atferd, som lungekreft fører osteolytiske metastaser, mens Cap produserer bein forming lesjoner. Den økte IL-7-serumnivå kan avhenge av immunsystemaktivering mot tumoren. Faktisk har det tidligere blitt vist at T- og B-celler produserer IL-7, på begge tumorer og andre patologier forbundet til benresorpsjon [4], [19], [20]. WNT signalisering spiller en viktig rolle i utviklingen av bein, siden det hindrer OC differensiering [6], stimulerer osteoblastogenesis og mineralizing aktiviteten til osteoblaster [7]. Wnt proteiner er også uttrykt av CAP og kan fremme svulst bein invasjonen [21]. DKK er et løselig hemmer av kanonisk WNT signale [22]. En fersk studie knytter DKK-1 uttrykk i brystkreft med tilstedeværelse av benmetastaser [23]. Data om DKK-1 uttrykk i Cap er snaut: noen forfattere rapporterer en økning DKK-1 uttrykk i osteolytiske lesjoner, men ikke i primærsvulster [8]. Hall
et al
rapportert at CAP-avledet DKK-en er involvert i osteoblastisk aktivitet i skjelettmetastaser, siden DKK-en signale kan konto for å bytte bein reaksjon på Cap celler fra osteolytic til osteoblastisk og vice versa [24 ]. I dette arbeidet studerte vi bare pasienter med bein som danner metastaser, derfor har vi ikke klarer å relatere osteolytic aktivitet indusert av Cap celler og DKK-1 uttrykk, som tidligere beskrevet [8]. Likevel fant vi en stor mengde av DKK-en i serologiske prøver fra kreftpasienter og en forbedret DKK-en genekspresjon i Cap vev, noe som tyder på at økt serum DKK-1-nivå i Cap pasienter kan avhenge av Cap celle sekresjon. Dette resultatet vil bli dypt studere for å vurdere den potensielle rolle DKK-en som svulst markør i Cap. Videre kan vi spekulere at CAP-celler stimulerer benmargen miljø for å øke DKK-en utgivelse gjennom ukjente mekanismer. I våre bein metastatiske pasienter, serum DKK-1-nivå litt økt sammenlignet med ikke-metastatiske pasienter, uten en statistisk signifikant forskjell. Dette kan avhenge av vår lave antall pasienter, men å undersøke et stort antall pasienter, forventer vi å vise en forskjell mellom de to gruppene, bekrefter litteraturen [23].
Materialer og Metoder
pasienter og markører for beinomsetning
den eksperimentelle prosjektet og alle studier utført på pasienter ble godkjent av etisk komité vår institusjon (Azienda Ospedaliera-Universitaria San Giovanni Battista i Torino) og skriftlig informert samtykke fra pasienter og friske kontroller ble oppnådd. Den studerte populasjonen inkluderte 46 pasienter som er berørt av nydiagnostiserte lokket (37 hadde bare en primærtumor, mens ni hadde primærtumor og samtidige bein danner metastaser) og 20 friske menn. Hos alle pasienter var det ingen tegn på metastasering til andre ikke-ben-steder. Det har blitt vist at østrogen tap i vesentlig grad påvirker osteoklastdannelse [25]. Dermed har vi studert cap at, som en eneste mannlige svulst, unngår som standard alle mulige skjevheter på grunn av sykliske østrogen variasjoner og postmenopausal fall i østrogennivået hos kvinner. Pasienter og kontroller ble matchet for alder og kroppsmasseindeks. Benmineraltetthet (BMD) ble målt ved å dobbelt utslipp røntgenabsorpsjonsmetri med en Hologic QDR 4500 ved korsryggen og lårhals både pasienter og kontroller. Individer med intestinal malabsorpsjon sykdommer, annen form for mangelfull ernæringsstatus, sekundær osteoporose eller tar narkotika aktive på benutskiftingen eller anti kreftbehandling ble ekskludert. Tilstedeværelsen av benmetastaser ble bekreftet ved hjelp av
99Tc bein skanning og ytterligere bildediagnostikk i henhold til standard klinisk praksis.
For å undersøke bein status metabolisme, pasienter og kontroller ble utsatt for analyse av standard kliniske markører av bein metabolisme, slik som serum PTH, bein alkalisk fosfatase (BAP), kalsium, fosfat, osteocalcin (BGP) og urin deoxypyridinolin (urintverrbindinger) [26]. Spesielt, kryssbinder doseringen har blitt valgt i klinisk praksis for å overvåke beinmetastatisk sykdom og responsen til anti-resorberende behandlinger som bisfosfonater [27], [28]. Som markører for benresorpsjon vi også målt tartrate Bestandig Acid fosfatase 5b (TRAP5b) i sera [29] ved Bonetrap ELISA kit (Suomen Bioanalytiikka Oy, Turku, Fin). Serologiske markører, slik som PSA og histologisk gradering, ifølge Gleason, ble registrert for alle pasientene i denne studien [30], [31]. Alle biokjemiske målinger ble utført på en enkelt blod eller urinprøven ved et enkelt tidspunkt per gjenstand.
Cellekulturer
Som tidligere beskrevet [13], for alle pasienter og friske kontroller, ble PBMC isolert fra perifert blod og dyrket i α-MEM, supplementert med 10% FBS, penicillin 100 enheter /ml og streptomycin 100 ug /m (Cambrex Bio Science, Walkersville, MD), uten tilsetning av eksogene stimulerende faktorer som m-CSF og RANKL. Etter 15 dager, kulturer ble stoppet, ble modne p-piller identifisert som multinucleated celler som inneholder tre eller flere kjerner og positiv for TRAP uttrykk (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
Cytokiner dosering
for å evaluere faktorer involvert i osteoclastogenesis mengden av serum-total RANKL (fri og OPG-bundet), OPG, TNF-alfa, IL-7 og DKK-1 ble bestemt ved kommersielt tilgjengelige ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Prøver ble analysert i duplikat og data ble uttrykt som middelverdier. De sensitiviteter var: 1.56 til 30 000 pg /ml for total RANKL (Apotech Corporation, Epalinges, CH); 0 til 4000 pg /ml for OPG; 0,12 til 32 pg /ml for TNF-alfa; 0,1 til 16 pg /ml for IL-7 (R D system, Abingdon, UK) og 0,38 til 50 pmol /L for DKK-en (Biomedica, Wien, A)
RNA ekstraksjon fra formalin. faste, parafininnstøpte (FFPE) CAP vev
Vi hentet RNA fra FFPE cap og friskt vev. For 19 pasienter, fikk vi prøver fra svulsten og blokker friske vevet, ble tumorområder valgt på haematoxylin /eosin deler av mikroskop og manuelt dissekert. RNA ble isolert fra FFPE Cap vevsblokk (10 mikrometer seksjoner) med RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Huntingdon, UK). 1 mikrogram av RNA ble omgjort til enkeltkjedet cDNA ved High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK).
Generering av pasienten plasmid standard
PCR primere for IL -7, DKK-1 og β-Actin ble utformet ved hjelp Primer Express v2.0 programvare og syntetisert av Applied Biosystems (Warrington, UK). IL-7 og p-aktin-sekvenser ble tidligere publisert [18], mens DKK-1-sekvenser var: 5′-følelse GGAAGCGCCGAAAACG-3 «og 5′-antisense ACACACATATTCCATTTTTGCAGTA-3». Purified ferske PCR-produkter av 80-bp for IL-7, 75-bp for DKK-en og 78-bp for β-Actin ble direkte klonet ved hjelp av TA Cloning Kit Dual Arrangøren (Invitrogen, Carlsbad, California) som tidligere beskrevet [18] . Positive kloner ble sekvensert for å bekrefte sin identitet. 10 ug av det valgte plasmid for genene ble spaltet med 8 U Hind III restriksjonsenzym over natten ved 37 ° C. Lineariserte plasmider ble endelig renset med NucleoSpin rydde opp utvinning kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, D), resuspendert med 1 x TE og OD
260 ble bestemt. Kopiantall ble beregnet fra plasmidet konsentrasjon, midlere molekylvekt av nukleotidene (660 g /mol) og plasmid pluss sett lengde.
Real-Time Kvantitativ analyse av IL-7 og DKK-1-genekspresjon
med tanke på høyere beløp av serum IL-7 og DKK-en i Cap pasienter både med og uten benmetastaser, bestemte vi oss for å undersøke om disse faktorene er produsert av kreftceller. Vi utførte kvantitativ analyse av IL-7 og DKK-1 uttrykk ved Real-Time Kvantitativ PCR (RQ-PCR), β-Actin var housekeeping kontroll. RQ-PCR-analyse av IL-7 og DKK-1 ble utført ved anvendelse av iCycler iQ ™ system (Bio Rad, Hercules, CA, USA). TaqMan prober ble utformet ved hjelp Primer Express v2.0 programvare og syntetisert av Applied Biosystems (Warrington, UK). IL-7 og β-Actin spesifikk TaqMan prober ble tidligere brukt [18], mens den DKK-en probe var (5′-ATGCGTCACGCTATGTGCTGCC-3 «). Alle prober ble merket i 5′-enden med 6-karboksy-fluorescein (FAM) og 3»-enden med 6-karboksy-tetrametil rhodamin (TAMRA). Reaksjoner for IL-7, DKK-1 og β-Actin kvantifisering ble utført i en 25 ul sluttvolum med 2 ul prøve cDNA, 1 x iQ Supermix (Bio Rad, Hercules, CA, USA), 0,3 uM av hver enkelt primer og 0,4 uM av probene. PCR-primere var de samme som brukes for IL-7, DKK-1 og β-Actin kloning. Forsterker betingelser for kvantisering var: 95 ° C i 15 minutter, 50 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder, 58 ° C for IL-7, 60 ° C for DKK-1 og β-Actin i 1 minutt
.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført av Statistisk Package for Social Sciences (spssx /pc) programvare 15,0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Kontinuerlige variabler ble uttrykt som middelverdi og standardavvik. For å sammenligne pasienter både med og uten benmetastaser og kontroller, utførte vi en enveis variansanalyse (ANOVA). Bonferroni korreksjon ble utført for multiple sammenligninger. For å utforske virkningen av de kontinuerlige variabler analysert på OC formasjon, vi montert en lineær regresjonsmodell for skritt måte fremgangsmåte. Genuttrykket av DKK-1 og IL-7 ble sammenlignet mellom svulst og friskt vev av paret Student t-test. Resultatene ble vurdert som statistisk signifikant for
p
. . 0,05
Takk
Vi takker Raffaele Troiano for teknisk assistanse
