Abstract
organotypiske, tre dimensjonal (3D) cellekultur modeller av epiteliale krefttyper, for eksempel prostatakreft rekapitulere de viktigste aspektene ved arkitektur og histologi av solide kreftformer. Morfometrisk analyse av flercellede 3D organoids er spesielt viktig når tilleggskomponenter slik som den ekstracellulære matriks og tumormikromiljøet er inkludert i modellen. Kompleksiteten i slike modeller har så langt begrenset deres vellykket gjennomføring. Det er et stort behov for automatiske, nøyaktige og robuste bilde segmenteringsverktøy for å lette analysen av slike biologisk relevante 3D-cellekultur-modeller. Vi presenterer en segmentering metode basert på Markov tilfeldige felt (MRFs) og illustrere vår metode ved hjelp av 3D stabelen bildedata fra et organotypiske 3D-modell av prostatakreftceller co-dyrket med kreft-assosiert fibroblaster (kafeer). 3D segmentering utgangs antyder at disse celletyper er i fysisk kontakt med hverandre innenfor modellen, som har viktige implikasjoner for tumorbiologi. Segmentering ytelse kvantifiseres ved hjelp av bakkesannhets etiketter og vi viser hvordan hvert trinn av vår metode øker segmentering nøyaktighet. Vi tilbyr bakken sannhet etiketter sammen med bildedata og kode. Ved hjelp av uavhengige bildedata viser vi at vår segmentering metoden er også mer generelt gjeldende for andre typer cellemikroskopi og ikke bare begrenset til fluorescens mikros
Citation. Robinson S, Guyon L, Nevalainen J, Toriseva M, Åkerfelt M, Nees M (2015) Segmentering av bildedata fra komplekse organotypiske 3D-modeller av kreft vev med Markov Random Fields. PLoS ONE 10 (12): e0143798. doi: 10,1371 /journal.pone.0143798
Redaktør: Olivier de Wever, Ghent University, BELGIA
mottatt: 03.07.2015; Godkjent: 10 november 2015; Publisert: 02.12.2015
Copyright: © 2015 Robinson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. VTT Oy er en non-profit, fullt statseide forskningsinstitusjon som offisielt lykkes forrige organisasjon, grunnlagt i 1942, tidligere kjent som Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus eller VTT (The National Technical Research Centre of Finland). VTT Oy ble stiftet i 01.01.2015 og opprettholder strukturen i en storstilt forskningsinstitusjon. Forskningen som beskrives her er av utelukkende faglig art, ikke relatert på noen måte til kommersielle produkter, tjenester eller pågående oppdragsforskning med tredjeparter gjennomført på VTT Oy. Dette arbeidet ble støttet av Academy of Finland, gir tallene 284 619 (M A) og 267326 (MN). SR er mottaker av en CEA-industri avhandling kontrakt og en VTT avhandling kontrakt. VTT gitt støtte i form av lønn for forfattere SR, MA, og MN, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. MT har jobbet som en ekstern forsker tilknyttet VTT gjennom forskningsgruppen (ledet av MN). De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § forfatterens bidrag
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer relatert til deres tilknytning til VTT. Denne tilknytningen endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Cellular prosesser naturlig forekommer i tre dimensjoner (3D) og celler er vanligvis innebygd i ekstracellulære matrise , som er en viktig del av den cellulære mikromiljøet. Følgelig fysiologisk relevante cellekulturmodeller er i økende grad utformet på 3D-formater er innleiret i ekstracellulær matrise for å fange opp komplekse vev-lignende biology mer trofast [1]. En fast tumor representerer en forstyrret og kompleks vev med sin egen karakteristiske vev homeostase og rundt svulsten mikromiljøet. Tumorcelle plastisitet og viktige egenskaper slik som differensiering sammenlignet med tumorcelle-invasjon er sterkt påvirket av svulsten mikromiljøet. For å rekapitulere funksjonene i solide tumorer
in vitro
krever cellebaserte analyser som samtidig etterligner den ekstracellulære matrise og svulstens mikromiljø, homeotypic og heterotypic celle-celle kontakter og tillate dannelsen av relevante celle-matrix interaksjoner. Organotypiske 3D cellekulturteknikker representerer for tiden den mest biologisk relevante
in vitro
modeller for etterforskningen av epithelial kreft differensiering, polarisering og invasjonen [1-3]. Men mangelen på egnede mikros bilde analysemetoder har så langt begrenset en vellykket gjennomføring og tolkning av slike modeller.
Bortsett fra kreftceller, ulike stromale celler representerer den mest kritiske komponenten av svulsten mikromiljøet. Kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) er den mest tallrike stromal celletype i de fleste karsinomer og spille en viktig rolle i tumorprogresjon [4-6]. Kafeer representerer derfor et viktig mål for kreftbehandling. Samspillet mellom tumorceller og kafeer er fortsatt dårlig forstått og mer pålitelige og robuste cellekultur modeller som bedre rekapitulere komplekset histologi av
in vivo
svulster er pålagt å studere tumor-stroma interaksjoner.
Vi anser flerkanals 3D stabelen bildedata fra et komplekst organotypiske 3D cellekultur modell av prostatakreft kreftceller co-dyrket med kafeer. Vår 3D-cellekultur og avbildningsprotokoll angår flercellede nivå i hvilket den samlede egenskapene til tumor organoids og CAF strukturer er mer kritisk enn å fange opp de enkelte celler eller cellekjerner. Ervervet med en relativt stor avstand mellom bilder i bunken, oppløsningen på bildedataene i et bilde var opp til 20 ganger høyere oppløsning mellom bilder i bunken.
sunn prostata vev dannes av acini, som er hule klynger av celler som danner de minste funksjonelle enheter av en sekretorisk kjertel. I tidlig stadium prostatakreft disse acini begynner å fylle opp med pre-maligne eller maligne celler til å bli solide kuler. Formen og størrelsen på flercellede organoids inneholder verdifull morfometrisk informasjon [7] og vår interesse ligger i flercellede svulsten og CAF strukturer som distinkte informative stedene. Nøyaktig segmentering av både flercellede svulsten og CAF strukturer er første skritt i å undersøke i hvilket format og skalere disse celletypene kan danne direkte celle-celle kontakter. Derav vårt mål er å produsere en automatisk segmentering for begge typer objekter uten forutsatt forutgående form informasjon eller vurderer individuelle celler.
Automatisert datamaskin visjon tillater vanligvis for mye større effektivitet og objektivitet enn manuell menneskelig analyse [8]. Segmentering og identifisering av deler av bildet som er av interesse er det første skrittet på mange computer vision applikasjoner. Enkle Terskelverdier metoder danner grunnlaget for mange typiske segmentering metoder [9]. Populære freeware bildeanalyse plattformer som Cell Profiler [10] og ImageJ /Fiji [11] gi praktiske implementasjoner av slike segmentering metoder som er spesielt utviklet for cellulære mikroskopi data og gir mulighet for analyse utover segmentering i spesialiserte rørledninger for bestemte datasett. Men en slik analyse er typisk fokusert på høy oppløsning mikroskopidata ved enkelt celle eller til og med sub-cellulære nivåer, og er også i hovedsak fokusert på to-dimensjonale (2D) monolag cellekulturer, selv om 3D volumet visning og gjengivelse er mulig i ImageJ. Kommersielle programvareprodukter som fokuserer på 3D mobilmikroskopi bildeanalyse som Imaris (bitplan) og Volocity (PerkinElmer) er designet for svært detaljert analyse av bilder med høy oppløsning på celle-nivå hvor det kan være så lite som 0,5
μ
m mellom bildene i 3D stabelen. De spesifikke behovene til bildedata fra vår komplekse 3D cellekultur-modell, blir flerkanals 3D bildedata der det er store avstander mellom bildene i 3D stabelen, krever inngående manipulasjon av segmentering metode som ikke er tilgjengelig i løpet av disse plattformene.
Markov tilfeldige felt (MRFs) brukes for datamaskinen visjon på mange forskjellige områder, og for et bredt spekter av problemer [12]. Slike modeller er populære fordi Markov nabo struktur gjør det mulig for de romlige relasjoner pikslene som skal tas i betraktning samtidig være beregningsmessig gjennomførbart. For cellulært mikrosbildedata, har MRF baserte metoder er anvendt for å spore individuelle celler [13, 14], klassifisering [15], bevegelsesdeteksjon [16], bilde restaurering og dekonvolvering [17, 18], og identifikasjon av mitosen [19, 20]. MRFs har også vært mye brukt for bildesegmentering i en bred rekke områder, med mange «naturlige image» (ikke-mikroskopi) applikasjoner [21]. For
in vivo
cellulære mikroskopi bilder, MRFs har blitt brukt for segmentering i bestemte histologi applikasjoner [22, 23] og for å segmentere spesielle funksjoner som blodkar [24]. De har blitt brukt for
in vitro
cellulære mikroskopi bilder til segmentet individuelle cellekjerner [25] inkludert bruk av en bestemt kjerner form før [26, 27]. En MRF basert metode har også blitt brukt for segmentering og klassifisering av sub-cellulære strukturer i enkeltceller [28].
Vi implementerer vår 3D segmentering metode basert på MRFs og vise at den utfører nøyaktig på bildedata fra komplekse organotypiske 3D-modeller av prostatakreft. Styrkene i vår segmentering metoden blir demonstrert ved hjelp av ulike, men nært beslektede eksperimentelle bildedata og kvantitativt sammenligne med andre segmentering metoder bruker bakken sannheten etiketter. Vi viser at vår MRF basert metode nøyaktig fanger biologisk relevante, men ofte tynnere og svakere funksjoner som komplekse CAF strukturer og æren av tumor mot stromaceller i et 3D-miljø. Vi viser også at vår segmentering metoden er mer generelt gjelder andre typer cellemikroskopi bildedata og ikke bare begrenset til fluorescens mikroskopi.
Materiale og metode
Cellular mikroskopi bildedata
Vi bruker 3D-stack konfokalmikroskopi bildedata fra tre forskjellige, men nært beslektede organotypiske 3D cellekultur modeller, som vi refererer til som «IF bildedata», den «LIVE bildedata» og «FAK bildedata». Fullstendige opplysninger om de eksperimentelle og bilde protokoller har tidligere blitt publisert [29] og er kort beskrevet nedenfor. Alle 3D-stabler av bilder fra både IF og Live bildedata ble manuelt segmentert etter biologene som utførte eksperimentene. Den manuelle segmentering ble utført i Adobe Photoshop (Adobe Systems) og resulterte i hver piksel blir gitt en grunn sannhet etiketten enten «i fokus tumorceller «,» i fokus kafeer» eller «ute av fokus /bakgrunn». Disse første sannhets etiketter brukes i valideringen av vår segmentering metode.
Kommersielt tilgjengelige ekstracellulære matriks-preparater (vekstfaktor-redusert Matrigel med en lager-konsentrasjon på 8 mg /ml og kollagen type-I med et lager 3 mg /ml) ble innkjøpt fra Invitrogen BD og benyttet for alle 3D-ko-kultur-eksperimenter. En 25% eller 50% fortynning av Matrigel ble brukt, og en 1: 1 blanding av de to preparater ble rutinemessig anvendt (2-4 mg /ml Matrigel, 1,5 mg /ml kollagen). Både tumor og stromale celler ble sådd ut som enkeltcellesuspensjoner, med innledende tettheter på 700-1500 celler /brønn. 3D ko-kulturer ble fremstilt ved anvendelse av en «sandwich-prinsippet, hvor alle celler innbefattende stromale komponenter ble sådd i samme plant lag for å lette avbildning. Under disse lokalene, initial seeding tetthet var ca. 1800 celler /cm
2.
I IF 3D co-kulturen innstilling, LNCaP prostata kreft celler [30] var co-dyrket med PF179T kafeer isolert fra en prostata kreftpasient [31], ved en innledende celle poding forhold på 1: 2 i ekstracellulær matriks. Etter 14 dagers kultur ble cellene fiksert og indirekte immunofluorescens-farging ble utført. Et antistoff som er spesifikt for pan-keratin ble anvendt for spesifikk farging av kreft organoids, mens kafeer ble farget med et antistoff mot humant vimentin. CAF celler etter hvert slått sammen til store flercellede strukturer, som ble karakteristisk rundt periferien av tumor organoids.
I LIVE 3D co-kultur setting, varianter av de samme cellene som for IF bildedatasettet ble brukt. I dette eksperimentet, LNCaP-tumorceller som uttrykker DsRed protein ble ko-dyrket med PF179T kafeer som uttrykker GFP. De samme forsøksbetingelser, ekstracellulære matriks-ekstrakter og andre innstillinger som ovenfor ble anvendt. Dannelse, vekst, differensiering og morfogenese av tumor organoids, samt dannelsen av flercellede strukturer fra enkelt kafeer ble overvåket over en periode på 14 dager, hvoretter avbildnings ble utført. Den FAK 3D co-kulturen innstillingen var den samme som LIVE innstilling med tillegg av fokale vedheft kinase (FAK) hemmere Y11 og PF-573 228 kjøpt fra Tocris Bioscience. De tre forholdene var: DMSO kontroll (0,01%), 5
μ
M konsentrasjon av Y11 og 5
μ
M konsentrasjon av PF-573228
Multichannel 3D confocal digital. bildene ble kjøpt der tumorceller og kafeer ble fotografert separat. Begge celletyper Nedenfor presenteres i forskjellige (falske) fargekanalene rød for tumorceller og grønt for kafeer. IF og LIVE bildedata ble kjøpt med en Zeiss Axiovert-200M mikroskop, utstyrt med en Yokogawa CSU22 spinnende-disc konfokalmikroskoper enheten med en Zeiss Plan-Neofluar 20 × objektiv (numerisk apertur 0,17). IF bildedata består av 8 stabler av bilder mens LIVE bildedata består av 12 stabler av bilder. Hvert bilde har dimensjon 512 x 672 piksler og antall bilder i én enkelt stakk varierer fra 9 til 22. For alle bildene fra begge datasettene, en piksel ≈ 0,5
μ
m i et bilde og avstanden mellom tilstøtende bilder i en stabel er 10
μ
m. De FAK bildedata ble kjøpt med samme mikroskop innstillingene ved hjelp av en Zeiss Plan-Neofluar 5 × objektiv (numerisk apertur 0,16) og består av 24 stabler av bilder (8 for hver tilstand). En piksel ≈ 2,5
μ
m i et bilde, og avstanden mellom tilstøtende bilder i en stabel er 40
μ
m. Hvert bilde har dimensjon 512 x 672 piksler og antall bilder i en enkelt stabel er 18.
En uavhengig, lavere kompleksitet 2D-bilde datasett (BBBC003v1) gitt i Broad Bioimage Benchmark Collection [32] er også brukes til segmentering validering. Dataene består av 15 bilder av enkelt flercellede mus embryo, som hver er en 640 × 480 piksler gråtoner bilde tatt med differensial interferens kontrast mikroskopi og med en bakke sannhet segmentering av hele embryo struktur. Vi i tillegg vurdere segmentering ytelse med 2D-fasekontrast «melanoma» og «Tscratch» bildedata (BBBC019), også fra Broad Bioimage Benchmark Collection. Melanom bildedata består av 20 bilder hver med dimensjon 1024 x 1280 piksler, mens Tscratch bildedata består av 24 bilder hver med dimensjon 1028 × 1384 piksler. Begge datasettene er fra «sårtilheling» eksperimenter med bakken sannhets segmentations også gitt.
segmentering metoden
Innenfor Markov tilfeldig feltet (MRF) rammeverk, hver piksel i et digitalt bilde er gitt en etikett fra noen forhåndsdefinert sett (klassisk «forgrunn» og «bakgrunnen» for segmentering). Vi finner den merking som optimaliserer en funksjon tilsvarende energi, slik at merket for hver piksel tilsvarer den observerte pikselverdi og slik at det er en «glatt» merking over hele bildet. For hver piksel
i
i et digitalt bilde, la
X
i
og
Z
i
være tilfeldige variablene for pixel etikett (usett) og pikselintensitet (observert) hhv. La den samling av tilfeldige variable for alle pikslene har betinget uavhengighet grafen vist i figur 1. Deretter samling av tilfeldige variabler er en betinget MRF med tilsvarende energi funksjonen (1) for bildeelementer
i
og tilstøtende par av bildeelementer (
i
,
j
) med etiketter
l Hotell og
k
, og der
i
er indikatoren funksjon, ( 2)
Vi finner minimum energimerke (segmentering)
de enhetlige potensialer
u
i
;
l
er definert til å være (3) der
z
i
er den observerte pikselverdien og π
l
er sannsynlighetstettheten funksjon som tilsvarer merke
l
. De parvise potensialer
w
ij
;
lk
er definert til å være (4) der
z
i Hotell og
z
j
er de observerte pikselverdiene,
λ
0,
λ
1 og
β
er parametere som skal sette, og dist (
i
,
j
) er avstanden mellom pikslene
i
og
j
. Legg merke til at avstanden kan være forskjellig for nabo piksler i et bilde i forhold til nabopiksler mellom bilder avhengig av oppløsningen på bildedataene i hver dimensjon.
De hjørner og kanter på en betinget uavhengighet graf kode betinget uavhengighet egenskapene til det tilsvarende sett av tilfeldige variabler. I den betingede MRF grafen (figur 1), tilsvarer hver kant til enten en enhetlige (
X
i
,
Z
i
) eller parvis (
X
i
,
X
⋅) potensial i den tilsvarende energifunksjon Eq (1). Figur 1 viser en 6-nabo betinget MRF (6 parvise potensialer for hver piksel), som vi bruker for vår 3D segmentering metoden. Hver piksel har 4 naboer i et bilde og 2 naboer mellom bilder i 3D stabelen, med mindre naboer for piksler på grensen av stabelen.
enhetlige og parvise potensialer etablere korrespondanse og «mykhet» av generelle pixel merking hhv. Parametrene
λ
0,
λ
1 og
β
bestemme hvor mye innflytelse som de parvise potensialene har gjennom enhetlige potensialer i minimering av energien funksjonen (1). Avveiningen er at vi trenger en merking med «glatt» sammenhengende segmenterte regioner (nabopiksler har samme etikett), men også ønsker å bevare diskontinuiteter stede i bildet (S1 fig). Formen på enhetlige og parvise potensialer er standard for MRF segmentering problem [33]. Potensialene tilfredsunder modularitet tilstand som garanterer at det eksisterer en minimumsenergi oppløsning i den binære etikett tilfelle og tillater en tilnærming av den minste energi løsningen i multi-etikett tilfellet [34].
For å stille enhetlige potensialer likning (3) trenger vi en tetthetsfunksjon π
l
over pikselverdier som tilsvarer hver etikett
l
. Standardmetoden er å ansette en «interaktiv segmentering «prosedyre og har brukeren manuelt» frø «områder i bildet for hver etikett [33]. Deretter blir de empiriske fordelinger av kimsatte regionene brukt for å beregne enhetlige potensialer. I stedet for manuelt poding av bildet, passer vi en univariate Gaussisk modell blanding med tre komponenter til tettheten av de observerte pikselverdiene i de røde og grønne kanaler hver for seg. De tettheter brukes for segmentering etikettene er så bivariate blandinger av de univariate komponenter oppnådd i hver fargekanal (fig 2)
De tre etikettene er:. «I fokus» kreftceller med en blanding av «ut av fokus «kafeer og «bakgrunn» i den andre dimensjonen (red), «i fokus» kafeer med en blanding av» ute av fokus «tumorceller og» bakgrunn «i den andre dimensjonen (grønn) og en blanding av» ute av fokus » og «bakgrunnen» i begge dimensjoner (stiplet).
parametere
λ
0,
λ
1 og
β
settes basert på fordelingen av de enhetlige potensialer for å balansere trade-off mellom korrespondanse og glatthet i segmentering utgang. Selv om det finnes metoder for å lære disse parametre ved hjelp av et treningssett med første sannhet merkede bildedata, er disse fremgangsmåter er meget beregningsmessig kostbar og så ofte ikke utnyttes i praksis [35]. Dessuten er en bakke sannhet merking sjelden tilgjengelig i de fleste programmer. For hver stabel bilder setandso vi at de enhetlige og parvise potensialer har samme rekkevidde. Verdien av
β
stilles manuelt på en kandidat bunke bilder og samme verdien brukes for alle andre stabler fra samme eksperiment.
Som en pre-prosessering trinn, bruker vi en lokal entropi filter [9] for å kvantifisere lokale tekstur (innebygd funksjon entropyfilt i MATLAB bildebehandling Toolbox). Den lokale entropi filteret brukes på både de røde og grønne kanaler separat. Den rå gråtonebilder er ned-samplet til 8-bit, slik at hver piksel tilsvarer direkte til en intensitetsverdi i settet {0, 1, …, 255}. For hver piksel
i
, lokal entropi filtrert verdi iswhere
p
j
er andelen av piksler i nabolaget som har lik intensitet til pixel
j
. Nabolaget i hver piksel
i
er 9 × 9 kvadrat sentrert på pixel
i
inkluderende med symmetrisk polstring rundt kanten av bildet.
Vår 3D segmentering metoden er oppsummeres i følgende trinn (fig 3):
Process 3D bunke bilder ved hjelp av lokal entropi filter i den røde (kreftceller) og grønne (kafeer) kanaler separat, etter
Tilpass univariate Gaussian blandingsmodeller til de filtrerte pikselverdier i den røde (kreftceller) og grønne (kafeer) kanaler separat, etter
Kombiner blandingsdensiteter (fig 2) og beregne enhetlige og parvise potensialer
Finn minimum energimerking.
Konfokalmikroskopi brukes til bilde 3D co-kultur modeller som resulterer i en 3D bunke bilder. Vår 3D segmentering metoden brukes på 3D bunke bilder som resulterer i 3D segmentering utgang.
Vi gjennomførte vår segmentering metoden i MATLAB og brukt
α
-expansion algoritme for å finne den minimum energimerking [34, 36, 37].
Validering metode
Ingen enkelt verktøy er tilgjengelig for å utføre de nødvendige segmentering for en gitt datasettet. Hver metode har sine egne fordeler og ulemper, og er ofte tilpasset spesifikke applikasjoner som bruker før formen informasjon når segmentere enkeltceller eller cellekjerner [25-27]. Selv om mange avanserte segmenterings metoder finnes, er vi ikke klar over noen som ville være egnet til å gjelde for 3D-stack bildedata fra vår komplekse 3D cellekultur modell. Derav for sammenlikning bruker vi en rekke standard segmentering metoder som kan anses for å «bygge opp» til vår MRF tilnærming:
intOtsu Bruke Otsu metode [38] til terskel de røde og grønne intensitet kanaler separat og kombinere etikettene slik at tumor celle «eller» CAF «overskrivninger bakgrunn «, eller hvis en piksel er merket både tumor celle» og «CAF» det er tilfeldig tildelt en av disse etikettene.
Entotsu Ved hjelp av Otsu metode til terskel lokale entropi filtrert røde og grønne kanaler separat og kombinere etikettene med samme prosedyre som ovenfor.
blandinger thresholding de lokale entropi filtrerte bilder ved hjelp av bivariate blandingsdensiteter (fig 2).
MRF metoden som presenteres i denne artikkelen.
Otsu metode finner global terskel som maksimerer den inter-klasse variansen av de resulterende grupper, og er en mye brukt teknikk for grunnleggende gråtone bilde segmentering [ ,,,0],9]. Blanding modeller er selv også mye brukt for mange bildesegmentering programmer [39]. Siden bivariate blandinger brukes til å beregne de enhetlige potensialene i vår MRF basert segmentering metoden, er den «blandinger» metoden tilsvarer MRF metoden presentert i denne artikkelen med
λ
0 =
λ
1 = 0.
utgangen av de fire segmenteringsmetoder i forhold til bakken sannhets etiketter med den generelle makro F
1-score, den harmoniske middelverdien av klassifiseringen presisjon og husker [40]. Derfor F
1-poeng = 1 for en perfekt merking. IF og Live bildedata så vel som selvstendig museembryo bildedata blir brukt for validering. Diskusjon
Resultater og
Vi presenterer en serie med resultater for å diskutere fordelene med vår MRF basert metode for våre spesielt komplisert biologisk anvendelse, spesielt, multikanal 3D-bildedata med store avstander mellom bildene i stabelen. Ved hjelp av segmenteringen 3D utgang, er det mulig å undersøke om tumorceller og kafeer danner celle-celle-kontakter eller er fysisk atskilt i vår 3D ko-kulturmodell, som har viktige implikasjoner for tumorbiologi. Vi har i tillegg viser anvendeligheten av den lokale entropi filteret og at vår MRF basert metode oppnår de mest nøyaktige segmenterings resultater. Koden for vår segmentering metoden, blir bildedataene og bakken sannhets etiketter alle gitt som supplerende materiale (S1, S2 og S3-filer).
Segmentering utgang antyder fysisk kontakt av flercellede svulst og CAF strukturer
utgangen fra vår 3D segmentering metoden kan brukes til å undersøke om flercellet tumor organoids og CAF-strukturer er i direkte kontakt.
Ved hjelp av konfokal mikroskopi å avbilde 3D celledyrkningsresultatene i en 3D-stabel bilder svarende til en rekke parallelle fokalplanene. En maksimal intensitet projeksjon kan oppnås ved å projisere maksimal intensitet pikselverdiene inn i (
x
,
y
) planet. Selv om en betydelig mengde informasjon kan gå tapt, er den potensielle 2D-bildeanalyse mye mer utviklet og mindre beregningsmessig kostbar enn med tanke på hele 3D stabelen av bilder. Av disse grunner, er dagens bildeanalyse rammeverk for 3D cellekultur modeller av prostatakreft basert på maksimal intensitet projeksjoner [41, 42]. Selv om maksimal intensitet projeksjoner kan være egnet til å analysere monokultur modeller for enkelte programmer, de er ikke egnet for mer komplekse organotypiske modeller som co-kultur-modeller. Siden all strukturell informasjon projiseres inn i (
x
,
y
) fly, ville det ikke være mulig å finne ut om kreft organoids og kafeer er i direkte kontakt eller fysisk atskilt ved hjelp av en 2D-analyse .
figur 4 (a) viser maksimal intensitet projeksjon av både røde og grønne kanaler (falske farger) for et eksempel 3D stabelen. Det er fortsatt uklart om den sentrale svulsten og CAF strukturer er i direkte kontakt. De CAF strukturer synes å være plassert inne i svulsten struktur (blå pil), som er biologisk irrelevant. I kliniske tumorprøver, er fibroblaster ikke vanligvis funnet innenfor kreft organoids, men karakteristisk bare surround epitelceller (tumor) aggregater. Bare av og til, kan kafeer komme i kontakt med tumorceller på overflaten av tumor strukturer.
(a) Maksimal intensitet projeksjon av en representativ 3D-stabel. (B) – (d) Ulike synspunkter på den tilsvarende 3D segmentering tilkobling ved å bruke vår MRF basert metode. Den blå pilen viser hvor kafeer synes å være inne i svulsten organoid i maksimal intensitet projeksjon, men kan ses å være ute i 3D segmentering utgang. Se S1 Video for en video av 3D-segmentering utgang.
3D segmentering av tumorceller (rød) og kafeer (grønn) er vist i figur 4 (b) og 4 (d). Segmenter utgang fremhever spesielt de segmenterte områder svarende til CAF-strukturer som er i direkte kontakt med de segmenterte regionene som tilsvarer flercellet struktur tumor. Spesielt kafeer som syntes å være plassert inne i svulsten struktur i den maksimale intensitet fremspring (fig 4 (a)) kan nå ses å være utenfor, men i kontakt med hver side av den sentrale tumor organoid (blå pil). S1 Video gir flere synspunkter på 3D-segmentering.
3D gjengitt segmentering utgang (fig 4 (b) og 4 (d)) ser heller «klumpete», spesielt i
z
der svulst organoid har en «flat top «. Dette er en funksjon av bildedataene og skyldes den relative sparsity av dataene i
z
. Det ville ikke være riktig å ekstrapolere gjengivelsen slik at tumor organoids ser mer ut som «runde kuler «i 3D som dette ville potensielt skamme viktig strukturell informasjon og vil ikke bli støttet av oppløsningen på bildedataene.
det er mulig å identifisere manuelt hvis og hvor det segmenterte CAF regioner er i direkte kontakt med de segmenterte tumor organoids med visualisering tilgjengelig for våre 3D segmentering utgang. For å demonstrere en proof of concept av automatisk kvantifisere tumor-stroma kontakt med segmentering utgang, anser vi FAK bildedata (S2 Fig). Med vår MRF segmentering, anser vi at kontakten mellom «kreftceller» og «kafeer» segmenterte regioner vil gi et estimat av svulsten-stroma kontakt i modellen.
Figur 5 viser spredningsplott av totalvolumet , total areal og total kontakt for segmentert «kreftceller «og» kafeer «regioner i FAK bildedata. Totalvolum er det totale antall av merkede bildepunkter, er totalt overflateareal det samlede antall av merkede piksler tilstøtende til en piksel med en annen etikett og total kontakt er det totale antall av merkede «tumorceller «og» kafeer pikslene som er tilstøtende. Totalvolum og totalt overflateareal på både tumor organoids og CAF strukturer er generelt mindre på FAK-inhibering (figur 5 (a) og 5 (b)), og dette er i overensstemmelse med tidligere studier [29]. DMSO kontroll viser en baseline av tumor-stroma kontakt (Fig 5 (c)) og FAK-hemmere klart forstyrre denne kontakten. Med inhibitoren Y11, synes det å være mindre kontakt i gjennomsnitt, men kontakten er også mer variabel. Det er to bildestakker som har høyere totalvolum, areal og kontakt spesielt (angitt med blå stjerne i S2 figur). Det er klart at PF-573 228 hemmer tumorvekst organoid (figur 5 (a) og 5 (b)), og dermed er det noen fysisk kontakt mellom de to celletyper (figur 5 (c)). En Kruskal-Wallis-test ble utført på total kontakt (figur 5 (c)) og den null-hypotesen at de forskjellige prøvene er alle realisasjoner av samme fordeling ble avvist (p-verdi = 2,6 x 10
-4). Tilsvarende parvise sammenligninger ble utført med Mann-Whitney
U
test.
