Abstract
Bakgrunn
Prostatakreft (PCA) er en svært heterogen sykdom med hensyn til klinisk utfall. Denne studien utforsket differensial DNA metylering i a priori utvalgte gener å diagnostisere PCa og forutsi klinisk svikt (CF) hos høyrisikopasienter.
Metoder
En kvantitativ multipleks, metylering spesifikke PCR-analysen ble utviklet for å vurdere arrangøren metylering av
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2 Kjøpe og
R R
gener i formalin faste, parafininnstøpte vevsprøver fra 42 pasienter med benign prostatahyperplasi og radikal prostatektomi eksemplarer av pasienter med høy risiko PCA omfatter opplæring og validerings årskull av 147 og 71 pasienter, henholdsvis. Log-rank tester, univariate og multivariate Cox modeller ble brukt til å undersøke den prognostiske verdien av DNA metylering.
Resultater
Hypermethylation av
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2 Hotell og
R R
var svært kreftspesifikke. Men bare
GSTP1
metylering var signifikant assosiert med CF i både uavhengige høyrisiko PCA kohorter. Viktigere, trichotomization i lav, middels og høy
GSTP1
metylering nivå undergruppene var svært forutsigbare for CF. Pasienter med enten lav eller høy
GSTP1
metylering nivå, sammenlignet med de moderate metylering gruppene, var på et høyere risiko for CF i både trening (Hazard ratio [HR] 3,65 95% KI, 1,65 til 8,07) og valideringssett (HR, 4,27; 95% CI, 1,03 til 17,72) så vel som i den kombinerte gruppen (HR, 2,74; 95% CI, 1,42 til 5,27) i multivariat analyse
Konklusjoner.
Klassifisering av primære svulster med høy risiko i tre undergrupper basert på DNA metylering kan kombineres med klinisk-patologisk parametere for en mer informativ risikolagdeling av disse PCA pasientene
Citation. Litovkin K Van Eynde A, Joniau S, Lerut E, LAENEN A, Gevaert T, et al. (2015) DNA Metylering-Guided Prediction of Clinical Svikt i høyrisiko prostatakreft. PLoS ONE 10 (6): e0130651. doi: 10,1371 /journal.pone.0130651
Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 29 august 2014; Godkjent: 25 mai 2015; Publisert: 18 juni 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen Fournier-Majoie (FFM ), Industrial Research Fund av KU Leuven (IOF-HB 07/04 og IOF-HB /12/011), og den belgiske Nasjonal kreftplan (Handling 29_023). DNAlytics SA gitt støtte i form av lønn for forfattere [PG og TH], men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. . De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser: En GB patent, med tittelen» Marker genbasert prognose av prostatakreft», ble arkivert i Storbritannia med prioritetsdato av 27. januar 2014 (GB1401371.8), og med AVE, KL og MB som oppfinnere. TH er administrerende direktør og Pierre Gramme rektor analytiker av DNAlytics, SA (Chemin du Syklotron 6, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgia). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I løpet av de siste to tiår, omfattende bruk av serum prostata-spesifikt antigen (PSA) testing har ført til en dramatisk økning i diagnose av prostatakreft (PCA) [1]. Men mange av PSA-diagnosen svulster er klinisk irrelevant. Bare om lag en firedel av pasienter med nylig diagnostisert PCa anses å ha høy risiko for å utvikle dødelig sykdom, manifestert ved Klinisk Failure (CF) og kreft-relaterte dødsfall (CRD) [2-4]. Ifølge European Association of Urology (EAU) og National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer, disse høy-risiko PCA pasientene definert som klinisk stadium ≥T3a, en biopsi Gleason score på 8-10 og /eller et serum PSA nivå 20 ng /ml [5,6]. Likevel, 62-84% av høyrisiko PCA pasienter opplever kreftspesifikk overlevelse på minst 15 år etter radikal prostatektomi (RP), som viser at ikke alle pasientene i denne gruppen har en dårlig prognose [7]. Denne heterogene klinisk utfall i høyrisikogruppen er potensielt forklares med bruk av Risikostratifisering modeller som ikke tar hensyn til underliggende (EPI) genetiske og molekylære egenskaper av svulsten som bestemmer tilstedeværelsen av mikrometastaser. Derfor er en av hovedutfordringene i dagens PCa forskning er å identifisere biomarkører som forbedrer prediksjon av CF og CRD. En bedre karakterisering av pasienter med høy risiko PCa på molekylnivå bør tillate en mer personlig medisin, matchende behandling intensitet til sykdom aggressivitet og forventet prognose. Men til dags dato er det ingen etablert klinisk indikasjon for bruk av molekylære prediksjon verktøy.
Det er nå velkjent at både mutasjoner og epigenetiske forandringer, særlig differensial DNA metylering, spille en rolle i kreftutvikling [8]. DNA metylering, som forekommer hovedsakelig på cytosinrester i en sekvens sammenheng med CpG dinukleotider, finner sted på ulike regioner i genomet, dvs. promotor CpG øyer (promoter-forbundet CpG-tett regioner), arrangøren CpG Island Shores (region med lavere CpG tetthet i umiddelbar nærhet av CpG island), genet organer og repeterende sekvenser [9]. I den voksne menneskelige genom fleste CPGs er denaturert, med unntak av arrangøren CpG øyer og strender. Det er generelt akseptert at PCa er assosiert med endring av disse mønstrene, som omfatter genom-wide hypometylering samt promoter-spesifikk hypermethylation [8-12]. En global hypometylering oppdages på mange genomisk loci, inkludert repeterende elementer og gen organer, bidrar til genom ustabilitet og falsk transkripsjons innvielser, henholdsvis. Arrangøren-assosiert hypermethylation er assosiert med genet Slå og fremmer PCa progresjon ved stanse av tumor-suppressor gener [8,13]. I PCA har ulike hypermethylated gener er identifisert med
GSTP1
blir det oftest endres og studert [13].
Med denne studien ønsket vi å utvikle en pålitelig kvantitativ analyse for å samtidig bestemme promoter metylering nivåer av a priori valgt PCA- koblede gener
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
R R Hotell og
PTGS2
, og å vurdere deres diagnostiske og prognostisk verdi for høyrisiko PCA pasienter [13].
Materialer og Metoder
pasienter og prøvetaking
pasienter med høyt -risk PCa ble valgt i henhold til de kriterier som er vedtatt av EAU og NCCN, dvs. en klinisk stadium ≥T3a, en biopsi Gleason score på 8-10 og /eller PSA nivåer 20 ng /ml [5,6]. Formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) normal prostata og PCA vev ble oppnådd fra University Hospitals Leuven (UHL, Leuven, Belgia) og Universitetssykehuset i Würzburg (UHW, Würzburg, Tyskland). Ved UHL prøver ble oppnådd fra pasienter med godartet prostatahyperplasi (BPH, n = 42) eller høy-risiko PCa (PCa2, n = 71). Prøver fra høyrisiko PCA pasienter ble også hentet fra UHW (PCa1, n = 147). Preoperativ staging i begge kohorter inkludert en digital rektal undersøkelse, en abdominopelvic-computertomografi (CT) skanne og et bein scan. Neoadjuvant hormonelle, stråling eller cellegift behandling var et eksklusjonskriterium. Staging og gradering av prostata kreft prøver (hele mount seksjoner, 4 mm avstand) ble utført i henhold til 2002 TNM klassifisering og Gleason gradering system, som tidligere beskrevet [14]. Oppfølging ble utført hver 3. måned for de første 2 år etter operasjonen, hver 6. måned i følgende 3 år, og deretter årlig. CF ble erklært da enten lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser ble histologisk påvist eller bekreftet av CT eller bein scan. De klinisk-patologiske egenskaper ved alle kullene er beskrevet i tabell 1. Av pasientene i PCa1 og PCa2 kullene, 84% og 21%, henholdsvis, fikk hjelpestoff-behandlinger (radioterapi og /eller hormonbehandling). Studien ble godkjent av medisinsk etikk Commission of universitetssykehus Leuven. Sistnevnte gitt tillatelse til å utføre denne retrospektive studien uten informert samtykke, fordi bare arkivert PCA prøver (venstre-over FFPE- blokker) ble brukt. Alle prøvene ble analysert anonymt.
Cell kultur
Menneske prostata PC-3 (CRL-1435, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA), LNCaP ( ATCC, CRL-1740) og DU 145 (ATCC, HTB-81) celler ble dyrket som monolag i 50% Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og 50% Ham F12, RPMI1640 og DMEM, henholdsvis, supplert med 10% føtalt kalveserum . PZ-HPV-7-celler (ATCC, CRL-2221), en udødeliggjort cellelinje som stammer fra normale humane prostata-celler, ble dyrket i keratinocytt-serumfritt medium supplert med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 0,05 mg /ml bovint hypofysen ekstrakt. Den benign prostatahyperplasi BPH-1 celler ble vennlig levert av professor J. Swinnen (KU Leuven, Belgia) og ble opprettholdt i RPMI medium 1640 pluss 10% føtalt kalveserum [15].
DNA-ekstraksjon og bisulfite konvertering
Fullblod humant genomisk DNA ble kjøpt fra Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA, USA. Fra cellelinjer genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av GenElute pattedyr Genomisk DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). I BPH kohort, ble genomisk DNA ekstrahert fra hele parafin delen, ved hjelp av WaxFreeTM DNA-kit (TrimGen, Sparks, MD, USA). For begge PCA kohorten ble FFPE blokken med den største tumorområdet hentet frem, og områder med 90% kreftvev, omfatter både svulst epitel og tumor-assosiert stromale celler, ble preget av den samme uro-patolog og senere macrodissected. Isolering av genomisk DNA ble utført ved å følge en standard fenol-chlorophorm prosedyre. Deretter genomisk DNA (~ 500 ng) fra hver prøve var sulfitt-omregnes til EZ DNA metylering kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll, og eluert i 25 mL H
2o .
Metylering uavhengig (MI) PCR og kloning
MI primere som inneholder maksimalt en CpG område nær 5 «enden ble designet for å forsterke 100-200 basepar (bp) fragmenter rundt transkripsjon start stedet for
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2 Hotell og
R R plakater (tabell A i S1 File Figur A i S1-fil). MI-PCR ble utført som tidligere beskrevet [16]. Deretter ble amplifiserte fragmenter klonet inn i DH5a-kompetente celler (Invitrogen Ltd, Paisley, UK), ved hjelp av pGEM-T Easy vektor System (Promega Corporation, Madison, WI, USA) og omtrent fire kolonier ble tilfeldig valgt og analysert ved hjelp av dideoksynukleotid-sekvensering. Plasmider med DNA-innskuddene som tilsvarer fullt metylert (avledet fra LNCaP eller PC-3-celler) eller unmethylated (avledet fra humant fullblod) promotorområdene etter bisulfitt konvertering, betegnet som plasmidene pM og PU, henholdsvis, ble valgt ut for videre bruk i andre trinn av kvantitativ multipleks metylering-spesifikk PCR (QM-MSP) analyse [16].
QM-MSP assay
A QM-MSP assay ble utviklet for å kvantifisere promoteren metylering tilstand
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2 Hotell og
R R plakater (figur A i S1-fil). En detaljert protokoll er beskrevet i [15], og alle primersett er definert i tabell A i S1 fil. Kort, i første PCR reaksjon en blanding av validerte gen-spesifikke primere ble brukt til å co-forsterke arrangører av
GSTP1
,
CCND2
,
R R
,
PTGS2 Hotell og
APC
gener uavhengig av deres metylering status (MI primersett i tabell A i S1-fil). For å sikre at QM-MSP kan brukes med svært fragmentert DNA, som ofte er problematisk i DNA isolert fra FFPE-vev ble multipleks primere laget for å forsterke PCR-fragmenter av ≈ 100-200 bp. I den andre PCR-reaksjonen, ble den absolutte kvantifisering av denaturert og unmethylated DNA-fragmenter separert utført for hvert gen med de validerte kvantitative metylerte og unmethylated spesifikke primere (MSP og USP primere settene, respektivt, i tabell A i S1 Fil, fig B i S1 Fil). Til slutt, for å beregne% av DNA-metylering av mengden av total DNA ble avledet fra summen av denaturert og unmethylated DNA (U + M). Bare prøver som inneholder 3000 genkopier etter pre-forsterkning ble akseptert for kvantifisering som beskrevet i [16]. Den metylering av
GSTP1
,
APC Hotell og
CCND2
ble kvantifisert i 147 og 70 prøver fra PCa1 og PCa2 kohorter, henholdsvis.
PTGS2
ble kvantifisert i 147 og 66 prøver, og
R R
i 146 og 66 prøver fra PCa1 og PCa2 kohorter, henholdsvis.
Immunohistochemistry
FFPE deler av kohorten PCa2 ble farget på en BOND MAX Autostainer (Leica). Kort, parafin-embedded seksjoner ble først avvokset, og antigen gjenfinning ble utført i BOND epitop-henting løsning 1 (Leica). Mus monoklonal 3F2 anti-GSTP1 (1: 2000, 3369) og kanin-monoklonalt anti-ERG (1: 100, ab92513) ble anskaffet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og Abcam (Cambridge, UK), henholdsvis. Slides ble analysert ved lysmikroskopi, anmeldt og scoret med en uropathologist, ifølge den Allred metoden [17]. Den Allred score er en semi-kvantitativ system som tar hensyn til andelen positive celler (skala fra 0-5) og fargeintensitet (skala fra 0-3). Andelen og intensitet poengsum ble summert for å få den totale score fra 0, 2-8. En score på 0-2 ble ansett som negativt, mens 3-8 ble tatt som positivt [17].
Statistisk analyse
BPH kohorten ble benyttet for å bestemme baseline metylering nivåer for alle DNA metylering markører. Mottakeren-drifts-egenskaper (ROC) analyse, sensitivitet, spesifisitet og positiv /negativ prediktiv verdi ble fastsatt ved bruk MedCalc for Windows, versjon 12.5 (MedCalc Software, Oostende, Belgia). Sammenhengen mellom metylering (som kontinuerlig variabel) og klinisk-patologisk parametre (Gleason score og patologisk stadium), ERG og GSTP1 immunostainings og stroma innhold ble utforsket med Mann-Whitney U-test (for to kategorier) eller Kruskal-Wallis test ( for mer enn to kategorier). Fisher eksakt test brukes for assosiasjonen mellom to kategoriske variabler. Sammenhenger mellom metylering av ulike gener ble anslått av Pearsons korrelasjonskoeffisient (
r
).
Kategorisering av DNA metylering for risikoklassifisering er basert på Cox-modeller. Den funksjonelle sammenhengen mellom omfanget av DNA metylering og tid-til-event utfall (CF) ble undersøkt ved å sammenligne en lineær trend til kvadratiske og kubiske-splines baserte funksjoner ved hjelp av likelihood ratio test [18]. En eller to cut-off-verdier ble bestemt i tilfelle av ikke-linearitet. Den første cut-off verdi ble fastsatt ved å vurdere alle mulige dichotomizations, mens den andre ble bestemt ved å feste den første cut-off og vurderer alle mulige trichotomizations. Både modellen passer (sannsynlighet) og klinisk resultat per datasett ble vurdert i det endelige valget av disse cut-off-verdier.
forskjell i risiko mellom metylering gruppene ble analysert ved univariate Cox modeller og log-rank test . Resultatene er presentert ved hjelp av hazard ratio (HR) og deres 95% konfidensintervall (KI), og med en grafisk representasjon gitt ved å plotte Kaplan-Meier-estimatene. Multivariat Cox analyser ble anvendt til å designe klinisk-patologiske modeller med og uten metylering markører. Den prediktive Nøyaktigheten av begge modellene ble evaluert ved hjelp av concordance sannsynlighetsestimatet (CPE), en AUC-lignende indeks for tid-til-event data, med verdier mellom 0,5 (ingen prediktiv verdi) og 1 (perfekt prediktiv verdi) [19 ]. For å sikre at den målte CPE er reproduserbare på ut-av-prøve pasienter, gjentatt tilfeldig sub-sampling kryssvalidering ble anvendt. Kategoriseringen av DNA metylering beskrevet ovenfor, og vekten av en Cox-modell var innstilt på treningssett og evaluert på de tilsvarende testsett. Vi utførte 200 tilfeldige splittelse av kohorten til 80% treningssett og 20% test sett. Analysene ble utført ved hjelp av SAS-programvare, versjon 9.2 for Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
P
-verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
metylering av de fem markørgener i menneskelige prostata cellelinjer og fullblod
Gene-spesifikk primerpar ble designet for å forsterke CPG øyene i promoter-regionen i
GSTP1
,
APC
,
R R
,
CCND2
, og
PTGS2
, uavhengig av deres metylering status (tabell A i S1-fil). Amplifisering av disse loci ble utført i natrium-bisulfitt konverterte genomisk DNA isolert fra 5 humane prostatacellelinjer, inkludert tre PCa (LNCaP, PC-3 og DU 145) og to benigne (PZ-HPV-7 og BPH-1) cellelinjer , og i genomisk DNA isolert fra humant fullblod fra en kreft-frie person. DNA-bisulfitt-sekvensering av disse klonede fragmenter viste at nesten alle CpG-dinukleotider ble metylert i LNCaP og /eller PC-3-kreft-cellelinjer, men ikke i godartede cellelinjer og blod (illustrert i figur A i S1-fil for
APC
). Deretter ble QM-MSP for de fem utvalgte gener utviklet som beskrevet i materialer og metoder seksjon og utført i disse seks genotyper (tabell 2). Alle genene ble helt metylert (≥99% metylering) i de hormonsensitive LNCaP-celler, i overensstemmelse med våre bisulfitt sekvense data og tidligere studier [20]. I hormon-ildfast cellelinjer PC-3 og DU 145, DNA metylering nivåene var mindre fremtredende, som bare to gener (
APC Hotell og
PTGS2
) var 100% metylert i PC- 3 linje, mens ingen av de genene ble fullstendig metylert i DU 145 celler. DNA metylering i de ikke-maligne genotyper, inkludert BPH-en, PZ-HPV7 og fullblod, ble ikke oppdaget på
GSTP1
,
R R
,
PTGS2
,
CCND2
, og
APC
genloci, med unntak av
CCND2
i BPH-1, som var 13% denaturert.
Kreft spesifikke DNA metylering i høyrisiko PCa
Deretter arrangøren metylering av
APC
,
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
og
R R
ble kvantifisert i FFPE prostata vevsprøver, ved hjelp av QM-MSP prosedyre. Prøvene ble avledet fra transurethral reseksjon eller adenomectomy eksemplarer av 42 pasienter med BPH og radikal prostatektomi eksemplarer av 218 pasienter med høy risiko PCa. PCA pasienter omfattet to grupper, videre betegnet som PCa1 eller opplæring kohort (
n
= 147) og PCa2 eller validering (
n
= 71) kohort. I BPH kohort, gjorde den gjennomsnittlige metylering nivået av disse markørgener ikke overstige 2% (figur 1, tabell B i S1 File). Imidlertid ble en mye høyere grad av CpG metylering oppdaget for alle gener i både høyrisiko PCA kohorter, noe som indikerer en kreft-spesifikke metylering av de utvalgte markører (fig 1, tabell C og D i S1 File). Med en metylering grenseverdi på 1 eller 2%,
GSTP1
viste den høyeste følsomhet i PCa1 (0,99) og PCa2 (0,97) kohorter, på en spesifisitet på 1,00 for de fem enkeltmarkører (Tabell E i S1 File ). Andre kombinasjoner av markørgener ikke ytterligere forbedre følsomheten uten å redusere spesifisiteten (tabell E i S1-fil). For å vurdere ytterligere nøyaktigheten i diskriminerende høyrisiko PCa av BPH, ble mottaker-drifts-egenskaper (ROC) analyse for hver av de enkelte markører utføres, og arealet under kurven (AUC) ble beregnet (figur 1). AUC varierte fra 0,85 (
PTGS2
) til 0,99 (
GSTP1
), bekrefter kreftspesifikke metylering, med
GSTP1
metylering som den beste klassifikator.
metylering av
R R
,
GSTP1
,
APC
,
CCND2 Hotell og
PTGS2
ble bestemt av QM-MSP i radikal prostatektomi prøver fra 42 pasienter med BPH og fra 147 (PCa1) og 71 (PCa2) pasienter med høy risiko PCa. Dataene er vist i prikkplotter for de angitte genene (A-E, venstre grafer). Metylering nivåer av hver genet i hver PCa kohort var betydelig høyere enn i BPH gruppen, som bestemmes av Mann-Whitney U-test (*, P 0,001). Mottaker-drifts-karakteristikk (ROC) analyse metylering markører for å skjelne BHP fra høyrisiko prostatakreft prøver (A-E, midten, PCa1 og høyre, PCa2), ved hjelp av data som vises på punktplottene ble utført. Grå linje, median; AUC, arealet under kurven.
Metylering heterogenitet i høyrisiko PCa
metylering nivået av alle enkeltgener varierte fra 0% til ~ 80%, noe som tyder på et stort inter og intratumor molekylær heterogenitet i prostatakreft med høy risiko (fig 1). Siden DNA ble ekstrahert fra områder med 90% kreftvev, som omfatter både tumor-epitel og tumorassosierte stromale celler, har vi semi-kvantifisert stroma innholdet i vev fra den PCa2 kullet og analysert korrelasjonen med
GSTP1
DNA metylering. Stroma innhold varierte fra 10% til 35% med to uteliggere 40 og 60% (tabell F i S1 File). Viktigere var ingen sammenheng finnes mellom
GSTP1
DNA metylering og stroma innhold, som analyseres ved Spearman (
P
-verdi, 0.1550), Kruskal-Wallis og Fisher eksakte tester (tabell G i S1 fil), noe som indikerer at forskjellen i stroma innhold er ikke den underliggende årsak for inter- og intratumor heterogenitet av DNA-metylering. Derfor er våre data er konsistente med forestillingen om at det er en stor inter- og intratumor heterogenitet i høyrisiko PCa på DNA metylering nivå.
Interessant, ved å rangere pasientene av trening og validerings kohorter i henhold til metylering nivå av
GSTP1
, den hyppigst denaturert markørgenet, fant vi at metylering nivået av de andre 4 merker vanligvis fulgt samme mønster i begge gruppene (figur 2A). I tillegg analyserer spredningsplott mellom metylering av
GSTP1 Hotell og andre gener (figur 2B og figur C i S1 File) viste at svulster som ikke ble metylert ved
APC
,
CCND2
,
PTGS2
eller
R R
, ble ofte metylert på
GSTP1
, med nivåer som spenner fra ~ 5-70%. Men hvis svulstene ble hypermethylated på
APC
,
CCND2
,
PTGS2
eller
R R
, deres metylering grad var generelt proporsjonal med
GSTP1
metylering nivåer. Disse funnene ble bekreftet av den svært betydelige positive Pearson korrelasjonskoeffisienter av metylering nivåene av disse markørene (
r
= 0,45 til 0,82;
P
0,001; Tabell H i S1 File). Til sammen viser disse data at metyleringen av de fem genene er moderat til sterkt korrelert og mest sannsynlig forekommer i de samme cellene.
Color-skalert fremstilling av DNA-metylering i tumorer fra PCa1 og PCa2 kullene. (A) Pasientene ble beordret i henhold til deres
GSTP1
metylering verdi. Det% av metylering av de andre fire markørgener er også vist. Grå bokser indikerer manglende verdier. (B) Spredningsplott av sammenhengen mellom
GSTP1
metylering og
R R
metylering i PCa1 (venstre panel) og PCa2 (høyre panel) kohorter.
Arrangøren hypermethylation versus klinisk-patologisk parametre
sammenhenger mellom metylering av genet loci, patologisk stadium (pT), og Gleason score (GS) ble evaluert i begge PCA kohorter. Ingen av markører viste en signifikant sammenheng med PT, som ble kategorisert i fire grupper (pT2, pT3a, pT3b og pt4). For GS, ble dataene delt inn i grupper med lav (GS2-6), middels (GS7) og høy klasse (GS8-10). Median metylering nivåene for disse gruppene er gitt i tabell 3. Basert på den Kruskal-Wallis og Mann-Whitney U-test, ingen av markørene var signifikant assosiert med GS i begge gruppene (Tabell 3 og Tabell I i S1-fil). Parvise sammenligninger av GS-grupper viste at bare
PTGS2
metylering var signifikant økt i GS8-10 og GS7, sammenlignet med GS2-6, i PCa1 (tabell I i S1-fil).
APC Hotell og
R R
metyleringer var bare signifikant høyere i GS7, sammenlignet med GS2-6, i PCa2 (tabell I i S1 File).
GSTP1
metylering spår klinisk svikt i høyrisiko PCa pasienter
Deretter har vi utforsket forholdet mellom omfanget av merket metylering og klinisk svikt, ved hjelp av Cox-modeller [21]. Klinisk svikt ble erklært da enten lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser ble histologisk påvist eller bekreftet av CT eller bein scan. Ingen vesentlig lineært forhold ble observert mellom hver av de fem gener og CF. Siden det er velkjent at biomarkører, når anvendt klinisk, er ofte dikotomisert, brukte Cox modeller for å velge de optimale konsentrasjon for hvert av de enkelte markørene [22]. Univariat og multivariat Cox regresjonsanalyse viste at dikotomisering basert på
CCND2
,
GSTP1
,
PTGS2
, eller
R R
metylering var bare signifikant korrelert med CF i en kohort, noe som indikerer at det er klinisk relevant (tabell J i S1 File). Likevel, la vi merke til at
GSTP1
metylering var signifikant assosiert med CF i PCa1 og PCa2 når ulike tidsavgrensninger ble brukt, dvs. 15% og 50%, henholdsvis (Tabell J i S1 File). Derfor undersøkte vi kliniske resultatet av flere
GSTP1
metylering undergrupper. svulster med høy risiko ble kategorisert i tre grupper, basert på
GSTP1
metylering nivå, dvs. lav metylering (LM, metylering 15%), moderat metylering (MM, metylering 15-50%) og høy metylering (HM, metylering 50%). Pasienter med enten lav eller høy metylering, i forhold til de moderate metylering gruppene, var på et betydelig høyere risiko for CF i opplæringen PCa1 kullet, som vist ved univariat Cox regresjonsanalyse (tabell 4, HR, 2,96; 95% Cl, 1,38 -6,36;
P
-verdi 0,005). Denne økte risikoen ble validert i PCa2 kohort (tabell 4, HR, 3,34; 95% Cl, 1,03 til 10,89;
P
-verdi 0,045) såvel som den kombinerte gruppen (tabell 4, HR, 2,59; 95% CI, 1,38 til 4,87;
P
-verdi 0,003). I tillegg univariat Cox regresjonsanalyse av preoperative PSA, GS og pT viste at bare GS var en signifikant prediktor for klinisk svikt i begge gruppene (Tabell 4). Den prognostisk effekt av GS i disse kohortene er i tråd med flere tidligere studier [14,23,24].
For å støtte videre tanken om at trichotomization av høyrisiko PCA pasienter basert på deres
GSTP1
metylering nivå forbedrer prediksjon av kliniske utfall, overlevelsessannsynlighet for hver gruppe ble vist ved hjelp av Kaplan-Meier plott (fig 3). Denne analysen viste et betydelig skille i svingene i både trening (log-rank test,
P
-verdi 0,014) og validering (log-rank test,
P
-verdi 0,043) kohorter så vel som i den kombinerte gruppen (log-rank test,
P
-verdi 0,006) (figur 3A, 3C og 3E). En sammenligning av LM + HM og MM grupper avdekket at mer enn halvparten av de med høy risiko PCA pasienter ble klassifisert i MM gruppen og hadde en mye bedre CF overlevelse i PCa1 (log-rank test,
P
-verdi 0,007) og kombinerte gruppen (log-rank test,
P
-verdi 0,002). Men denne forskjellen var border i PCa2 kohort (log-rank test,
P
-verdi 0,062).
Kurvene viser CF overlevelse av pasienter fra lav (LM, 50%
GSTP1
metylering) grupper i PCa1 (A), PCa2 (C) og PCa1 + 2 (E). Sammenligning av CF-overlevelse mellom MM og LM + HM-grupper i PCa1 (B), PCa2 (D) og i PCa1 + 2 (F) er også vist. CF, klinisk svikt;
P
, log-rank test
P
-verdi.
P
-verdi, log rank test.
Viktigst, trichotomized
GSTP1
metylering dukket opp som en uavhengig prediktor for CF når det justeres for PT, endelig GS, preoperativ PSA-nivå i både trening (tabell 4; HR 3,65; 95% CI, 1,65 til 8,07;
P
-verdi 0,001) og validerings gruppene (Tabell 4, HR, 4,27; 95% CI , 1,03 til 17,72;
P
-verdi 0,046), samt i leddet kohort (tabell 4, HR, 2,74; 95% CI, 1,42 til 5,27;
P
-verdi 0,003 ). Blant de andre testede variabler, bare GS også dukket opp som en uavhengig prediktor for CF i både single og kombin kohorter. Dermed har DNA metylering prediktiv kraft uavhengig av GS i høyrisiko PCa.
Deretter sammenlignet vi prediktiv verdi av modellen for CF, inkludert alle klinisk-patologisk parametere, med og uten trichotomized
GSTP1
metylering, ved hjelp av concordance sannsynlighetsanslag (CPEs) [19]. De arbeidsmål ble betydelig forbedret ved inkludering av
GSTP1
metylering i den kliniske modellen i begge kohorter (tabell 5). Dermed kan nøyaktigheten av prediktive modeller for CF basert på klinisk-patologisk parametere bli ytterligere forbedret ved inkludering av trichotomized
GSTP1
metylering modell.
Metylering styrt risiko stratifisering av pasienter med høy risiko PCa
Siden overlevelse analyser viste at pasienter med enten lave eller høye nivåer av
GSTP1
metylering er på et høyere risiko for CF enn de med moderat
GSTP1
metylering nivåer, utforsket vi metylering nivået av de andre 4 testet markører i disse undergruppene. Først stratifisert vi pasientene av trening, validering og kombin kohorter inn i tre grupper, dvs. lav ( 15%), moderat (15% -50%) og høy ( 50%) metylering, ved å rangere dem i henhold til
GSTP1
metylering nivå (figur 4A). Når dataene for alle fem markørgener ble kombinert, ble median metylering verdiene i LM-gruppene ikke overstige 6% og, med unntak av noen få avvik, de absolutte verdier var mindre enn 25% i både enkelt- og kombinkullene (fig 4B -4D). Dette er konsistent med den høye Pearson korrelasjonskoeffisientene (tabell H i S1 File), og antyder at bare en liten prosentandel av cellene i LM-tumorer ble metylert ved markørgener. I motsetning til dette median metylering verdiene for markørgener i MM /HM grupper oppe i 18/45% (treningssett) 28/50% (valideringssettet) og 25/50% (kombinerte sett), respektivt. 50%.
