Abstract
Akutte feberinfeksjoner har historisk blitt brukt til å behandle kreft. For å utforske den underliggende mekanisme, studerte vi effektene av kroniske feber på kreftcellevekst og kjemoterapeutisk virkning i cellekultur. Vi har funnet at dyrking av kreftceller ved 39 ° C svakt inhiberte cellevekst ved å arrestere cellene ved G1 fasen av cellesyklusen. Når cellene ble sådd ut på kulturskåler ved en lavere densitet, f.eks ca. 1000-2000 celler pr 35 mm skål, den veksthemming var meget større, manifestert som mange færre cellekolonier i den 39 ° C retter, sammenlignet med resultatene til en høyere tetthet såing, f.eks 20.000 celler pr tallerken, noe som tyder på at celle-cellesamarbeid som Allee virkning i cellekultur blir hemmet ved 39 ° C. Tilbaketrekking av celler fra serum forbedret G1 rest ved 39 ° C og, for enkelte cellelinjer så som A549 lungekreftceller, serum fylling ikke klarte å raskt drive cellene fra G1 til S og G2-M-faser. Terapeutiske effekter av flere kjemoterapeutiske midler, inkludert fedd knoppen ekstrakter, ved flere kreftcellelinjer var mer potent ved 39 ° C enn ved 37 ° C, spesielt når cellene ble sådd ut ved en lav tetthet. For enkelte cellelinjer og noen agenter, er denne forbedringen langvarig, dvs. fortsetter etter opphør av behandlingen. Samlet antyder disse resultatene at hypertermi kan hemme kreftcellevekst av G1 arrest og ved inhibering av celle-cellesamarbeid, og kan øke effektiviteten av flere kjemoterapeutiske midler, en effekt som kan vedvare utover avslutning av kjemoterapi.
Citation: Zhu S, Wang J, Xie B, Luo Z, Lin X, Liao DJ (2015) kultur på en høyere temperatur Hemmer Mildt kreft celle vekst, men Forbedrer Kjemoterapeutiske effekter ved å hemme Cell-Cell Collaboration. PLoS ONE 10 (10): e0137042. doi: 10,1371 /journal.pone.0137042
Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA
mottatt: 9. juni 2015. Godkjent: 20 juli 2015; Publisert: 23 oktober 2015
Copyright: © 2015 Zhu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Akutte febrile infeksjoner av ulike patogener har i århundrer vært antatt å spille en rolle i kreft profylakse [1,2] og i kreft spontan regresjon [3-7], som anmeldt før etter oss [8] og andre [ ,,,0],9]. Egentlig ulike patogener som kan forårsake akutt feber, for eksempel bakterier og malaria-forårsaker parasittiske protozoer, ble allerede brukt til å behandle kreft over et århundre siden [5,10]. Under 1866-1867, Busch i Tyskland infisert sarcoma pasienter med erysipelas fremkallende bakterier, noe som resulterte i ikke bare høy feber, men også det tumorremisjon i løpet av to uker, og gjentakelser av fremgangsmåten hindret gjenvekst av tumor [4,11,12] . I 1882 bekreftet Fehleisen Busch terapi og identifisert
Streptococcus pyogenes
som erysipelas-bakterier [13]. I 1887 Bruns også kurert et tilbakevendende melanom med rosen og oppsummert 14 rapporterte tilfeller med fullstendig eller stabil remisjon [14]. Under 1891-1936, Coley i New York injisert en bakteriell blanding av
S pyogenes Hotell og
Serratia marcescens product: [15] inn pasienter med sarkom eller visse epiteliale kreftformer [10]. Om 500 av de 1000 pasientene så behandlet av Coley og andre viste tumor regresjon [15-18]. Sannsynlig, dette bakteriell blanding, kalt som «Coley vaksine» eller «Coley er gift», er ikke bare en immunterapi [15], men også fungerer gjennom hypertermi (HT), fordi dens effekt i stor grad avhengig av om pasientene reagerte med høyere feber [10 , 16]. Egentlig HT terapi av kreft virker hovedsakelig ved å stimulere immunsystemet, inkludert aktivering av dendrittceller, naturlige dreperceller og T-celle-immunrespons [19-21]. Videre har mange kreftpasienter manifest hypotermi eller føler seg «kald» under kjemoterapi, muligens fordi kroppen feil chemo narkotika for en gift, og dermed senker temperaturen for å minimere sin «giftighet» [22]. Hvis dette formodning er riktig, kan øke kroppstemperaturen gjenopprette chemo effekt.
To viktige artikler publisert på midten av 1980-tallet har slått fast at en temperatur på 42 ° C i en time kan drepe kreftceller mens sparsom normalt celler [23,24] og dermed har satt en termisk mål til 42-43 ° C i HT terapi av kreft i de fleste nyere studier [25,26]. Mange anordninger har siden da blitt utviklet og benyttet klinisk for å behandle kreft, med formål å øke kjernelegemet temperaturen til 43-45 ° C i en varighet fra 15 minutter til 6 timer [27]. Denne utformingen av «en kort periode med høy temperatur» er også utviklet fordi det ikke er praktisk å holde pasientene i anordningen for en lang tid og i mange gjentatte eksponeringer. Imidlertid har praksis vist at disse innretninger har vansker med å heve tumor temperaturen til 42 ° C. Siden det er i utgangspunktet ingen pasienter som viser en febrilsk høyere temperatur enn 42 ° C, blir 39-42 ° C målet i noen studier [26]. Stevens et al rapporterte at kulturen av COLO-357 humane kreft i bukspyttkjertelen celler ved 42 ° C øker kromosom fragmentering, en nylig identifisert mitotisk celledød, og induksjon skjer innen 24 timer [28].
I tillegg til en direkte termisk drepe kreftceller, har HT også vist seg å forbedre radio- og chemo-terapi for mange kreftformer, spesielt behandling med cisplatin [29-31]. Mekanismene for disse effekt forbedringene varierer mellom ulike cytostatika. For cisplatin, øker HT cellemembranen permeabilitet og flyt som resulterer i mobilnettet akkumulering av cisplatin, og øker platina-DNA addukt formasjon, mens hemmer reparasjon av cisplatin-forårsaket DNA-skade [29-31].
Bestemme en mild virkning av en faktor på cellevekst in vitro er teknisk vanskelig. MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay eller lignende kolorimetriske metoder som detekterer de levedyktige celler ved å bestemme reduksjonen av MTT eller en beslektet tetrazoliumsalt kan bare detektere cellenes levedyktighet etter en periode på flere dager. Dette skyldes at i en 96-brønns plate i ubehandlede celler er inkludert som kontroller vil vokse til konfluens i noen dager, manifestert som et platå av den optiske tetthet av reduserte MTT. Knyttet til studier av HT, ettersom celler ved en HT temperatur og deres 37 ° C kontroller er sådd i to forskjellige 96-brønners plater for kulturen i to forskjellige inkubatorer, er variant større sammenlignet med den rutine MTT analyse hvor det testede gruppen og dens kontroll er i samme plate. Kolonivekst analysen kan oppdage en mye lengre periode av cellevekst og gi informasjon om den trinnvise veksten i hver utgangspunktet seeded celle. Men cellene trenger å bli sådd ut ved en mye lavere antall i dyrkningsskålen for å unngå smelting av koloniene. For de fleste cellelinjer, cellene trenger å bli sådd ut ved et visst antall eller densitet fordi cellene trenger for å samarbeide med hverandre for å overleve og vokse, som regnes som den cellekultur versjon av Allee virkning [32,33]. Derfor til en viss grad kolonivekstanalyse velger disse subpopulasjoner av celleoverlevelse og vekst av disse er mindre avhengig av celle-celle-samarbeid, selv om denne virkning Allee
per se
kan også være en parameter for å vurdere en behandling.
Materialer og metoder
humane cellelinjer og reagenser
Hela livmorhalskreft cellelinje, A549 og H1650 ikke-småcellet lungekreft cellelinjer, HCT116 tykktarmskreft cellelinje, samt som HEK293T (T stort antigen-uttrykkende humane embryonale nyrecellelinje) ble opprinnelig ble kjøpt fra American Type Cell Culture (ATCC) og anvendt i studien. Tørre fedd knopper ble kjøpt fra en kinesisk matbutikk. For å gjøre sin etanol ekstrakt, ble 1 gram fedd knopper lagt inn 5 ml 95% etanol i en 15-ml falk rør og ekstraksjon ble tillatt for to uker ved romtemperatur [34]. Etanolen ble deretter overført til et nytt rør, og betraktes som en 100% ekstrakt for bruk. I tillegg ble en ren eterisk olje av fedd knopper kjøpt fra NÅ Foods Bloomingdale, IL 60108, USA, og ble fortynnet med absolutt etanol. Etanol ble benyttet som den ubehandlede kontroll. Cisplatin og 5-fluorouracil (5-FU) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com) og fortynnet med saltvann eller DMSO.
Cell kultur
celler ble dyrket i to vann-jakke inkubatorer med temperaturen innstilt på 37 ° C og 39 ° C, respektivt. For å sikre nøyaktigheten og stabiliteten av temperaturen, ble et termometer satt i kuvøser for å overvåke den faktiske temperatur. De inkubatorer ble levert med 5% CO
2 som ble rekalibrert nå og da for å sikre nøyaktigheten. Under medium forandring, ble kulturskåler tatt ut ved stykkevis fra inkubatoren for å minimere tiden ved romtemperatur. Den friskt medium ble forvarmet i samme inkubator.
MTT-analysen
Celler i den logaritmiske fase ble høstet og sådd ut på en 96-brønns plate ved en densitet på 8 x 10
3 per brønn, etterfulgt av dyrking over natten for å tillate festing. For å bestemme virkningen av 37 ° C og 39 ° C kulturer ble cellene tillatt å vokse i ytterligere 72 timer. MTT ble deretter tilsatt i brønnen, og 3 timer senere ble 200 pl DMSO tilsatt for å oppløse formazanet ved romtemperatur i 30 minutter. Den optiske tetthet av den reduserte MTT ble målt ved anvendelse av et Multiskan-spektrum instrument med et fast program for MTT-analysen som rapportert før [35,36]. For å bestemme virkningene av kjemoterapeutiske medikamenter, etter over natten festing av cellene ble behandlet med et medium inneholdende cisplatin, 5-FU eller fedd ekstrakt ved den angitte konsentrasjon i 72 timer i 37 ° C eller 39 ° C inkubator med relevante oppløsningsmiddel som ubehandlede kontroller.
Krystallfiolett fiolett~~POS=HEADCOMP farging
Celler ble sådd ut ved en indikert tall pr skål og dyrket i 37 ° C og 39 ° C inkubatorer med en RPM-1640 medium inneholdende 5% føtalt bovint serum og streptomycin. Medium ble endret hver 3-4 dager eller når fargen slått litt gul. For behandling, ble et medium som inneholder en indikert konsentrasjon av cisplatin, 5-FU eller fedd ekstrakt tilsatt. Før farging med krystallfiolett, ble mediet fjernet og formen ble forsiktig vasket med PBS. Et fiksativ (metanol-eddiksyre i 3: 1 forhold) ble tilsatt for å fiksere cellene i 30 minutter. Fiksativ ble kassert og skålen ble tillatt å lufttørke fullstendig, etterfulgt av farging av cellene med en 0,1% krystallfiolett vann oppløsning i 15 minutter. Etter restkrystallfiolett ble vasket bort med avionisert vann, parabolen ble lufttørket og fotografert med et digitalt kamera.
Cell syklus analyse
Celler ble dyrket i 60 mm-retter til de nådde 70 ~ 80% samløpet. Cellene ble høstet med trypsin milde fordøyelse, vasket med kald PBS, og deretter fiksert med 70% etanol i PBS i 30 minutter. Cellene ble sortert ved anvendelse av en Becton Dickinson FACS Calibur strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Etter at cellene ble inngjerdet i FSC /SSC komplott for å utelukke små rusk ble bestandene av celler på ulike stadier av cellesyklusen kvantifisert ved hjelp av en ModFit LT programvare (Verity Software House, Inc., Topsham, ME), som beskrevet tidligere [35,37,38]. I hvert forsøk, ble hver gruppe satt for det meste i lett og dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (standardavvik).
Statistisk analyse
De fleste data varierte sterkt mellom forskjellige rapporter av forsøkene og ble dermed analysert ved hjelp av Wilcoxon rank sum test. Metodene som ble brukt var angitt i de tilsvarende tallene.
Resultater
HT kan forårsake artefakter i MTT analyser
Vi vanligvis observert færre celler eller lavere celletettheter i henhold mikroskop, og oppdaget færre cellekolonier ved hjelp av krystall-fiolett farging, i de 39 ° C retter enn i deres 37 ° C motstykker, men MTT målings ofte ga opphav til et motsatt resultat (figur 1A). MTT-analysen bestemmer reduksjonen av MTT, som forekommer i cytosol, mitokondrier og til og med kjerne [39]. Siden en høyere temperatur vanligvis forbedrer kjemiske reaksjoner, vi har en tendens til å konkludere med at «høyere celleviabilitet» ved 39 ° C oppdaget av en MTT analyse skyldes en økt aktivitet av noen MTT-reduserende enzymer, og dermed er en gjenstand. Hjelpemiddel denne slutning, dyrkingsmediet ved 39 ° C ble gul raskere enn ved 37 ° C og må skiftes oftere, noe som indikerer en høyere metabolisk hastighet ved 39 ° C. Siden andre kolorimetriske metoder for påvisning av cellelevedyktighet faktisk detektere metabolske aktiviteter, så vel [40-42], i de fleste tilfeller med en tetrazoliumsalt som substrat [39], som for tiden mangler vi en pålitelig og gjennomførbar metode for å kvantifisere effekten av HT i kultur
A:. Den optiske tettheten av MTT er ofte høyere i cellene ved 39 ° C enn ved 37 ° C, selv når det er færre celler ved 39 ° C observeres i henhold mikroskop, hvilket indikerer at cellenes levedyktighet kan overvurderes ved 39 ° C ved MTT-test. B, C og D: Behandling av Hela, A549 og HCT116-celler med 1 pM cisplatin (CDDP), 4 uM 5-FU eller 0,05% fedd knopp etanolekstrakt reduseres signifikant cellelevedyktighet sammenlignet med den ubehandlede kontroll ved den samme temperatur (
en
i C, B og D, p 0,05;.
t
test), mens sammenligning mellom 37 ° C og 39 ° C er ikke anbefalt
celler ved 39 ° C vokse litt tregere
ved hjelp av en MTT analyse der cellene ved 37 ° C og 39 ° C ble sådd i egne 96-brønners plater, gjorde vi ikke oppdage åpenbare forskjellen i levedyktigheten til Hela, A549, HCT116, H1650 og HEK293T celler mellom de to temperaturer (ikke vist), delvis på grunn av den tekniske begrensningen av MTT analysen beskrevet ovenfor. Imidlertid celletetthet visualisert ved krystallfiolett farging faktisk var lavere i de 39 ° C retter enn i de 37 ° C de (figurene 2 og 3, kontrollpaneler)
Cellene ble deretter behandlet med 1 pM cisplatin. eller 2 uM 5-FU i 3 dager, og etter at stoffet var trukket tilbake, ble videreført på kultur i 3 ytterligere dager, slik at cellekolonier vokse til synlige størrelser. Legg merke til at cellene i oppløsningsmiddel-behandlede kontroll viser også en lavere tetthet ved 39 ° C enn ved 37 ° C
Øvre panel:. 20.000 HCT116-celler ble sådd i en 35-mm skål og tillatt å vokse i 3 dager ved 37 ° C eller 39 ° C. Cellene ble deretter behandlet med angitte middel i 3 dager, etterfulgt av farging av levedyktige celler med krystallfiolett. Nedre panel: Cellene ble behandlet som ovenfor, men ble tillatt å vokse i ytterligere 3 dager etter 3 dagers behandling med det indikerte middel ble avsluttet. Merk at forskjellen i celletetthet mellom 37 ° C og 39 ° C ble utvidet for cisplatin- og fedd-behandlede celler sammenlignet med motstykket på toppanelet. Men dette etterbehandlingseffekt ikke skjelnet i 5-FU behandlede celler ved 39 ° C.
For å bestemme en langsiktig effekt på 39 ° C på cellevekst, vi sådd bare 1000-2000 celler i en 35-mm skål, slik at cellekolonier ikke vil smelte sammen. Overraskende, ble mange færre kolonier av synlig størrelse skjelnet i de 39 ° C retter enn i de 37 ° C som etter 6, 9, 12 og 15 dagers dyrking (figur 4 og 5). Men under mikroskop det fremdeles var koloniene som var mindre enn den synlig størrelse i de 39 ° C etter, selv om antallet av disse små kolonier var fremdeles mindre sammenlignet med de 37 ° C retter. Disse forskjellene, som var mer tydelig for HCT116-celler (figur 3), viser at i de 39 ° C retter mange celler hadde dødd mens de fortsatt er i live hadde vært vekst arrestert. Vi konkluderer med at cellene trenger for å samarbeide med hverandre for overlevelse og replikering, som er den såkalte Allee effekt i fatet, og dette samarbeidet er sperret ved 39 ° C. Imidlertid er reduksjonen i antallet levedyktige celler ved 39 ° C, enten på grunn av økt celledød og /eller hemmet cellereplikasjon, er så minimal at det ikke kunne skjelnes i de tre første dagene av kultur.
Legg merke til at det er færre kolonier av synlige størrelser i 39 ° C tallerken enn på 37 ° C en. A549 cellene danner større kolonier enn HeLa-celler ved de senere tidspunkter, spesielt ved 37 ° C.
Vekst er mye langsommere ved 39 ° C enn ved 37 ° C, men cellene er fortsatt i live, som observert under mikroskopet (pilene i 6-dagers parabol).
under mikroskopet, kan Hela celler replikert i tre dimensjoner, dvs. også hoper seg opp sammen, noe som gjorde utvidelsen av koloniene mindre uttalt i to dimensjoner. De sfæriske koloniene lett felle av under krystallfiolett farging, slik at bare en periferi av koloniene i fatet (fig 6). I motsetning til A549 celler dannet mye større kolonier fordi disse cellene er større i cellestørrelse og vokste bare i to dimensjoner uten hopet seg opp sammen, selv om de vokste mye langsommere enn Hela-celler (fig 4)
Venstre panel.: Hela-celler vokser vanligvis i tre dimensjoner i fatet for å danne kuleformede kolonier som, etter å ha vokst utover 9 dager, lett felle ut ved krystallfiolett farging, slik at fatet med bare omkretsen av koloniene, særlig i det 37 ° C fatet, karakterisert ved at koloniene er mye større. Høyre panel: Seks dager etter at cellene ble sådd, individuelle celler sådd med en tetthet på omkring 20.000 celler pr 35 mm skål utvikle seg til større kolonier, sammenlignet med de koloniene i formen, karakterisert ved at cellene ble sådd ut ved en tetthet på 2000 celler. Celler ved 37 ° C utvikle større kolonier enn ved 39 ° C.
Effekter av kjemoterapeutika er forsterket og langvarig ved 39 ° C
Sammenlignet med tilsvarende ubehandlet kontroll, behandling med en lav konsentrasjon av cisplatin (ca. 1 pm) i tre dager svakt redusert levedyktighet av HeLa-celler, men ikke av A549 og HCT116-celler, ved 37 ° C; imidlertid forekommet avtar til alle tre cellelinjer ved 39 ° C, som detektert ved MTT-analyser (figur 1B, 1C og 1D). Farging av cellene i rettene med krystallfiolett, viste at alle tre cellelinjer ble behandlet med cisplatin viste en redusert celletetthet ved 37 ° C, og mer utpreget, ved 39 ° C (figur 2 og 3). Mikroskopisk observasjon også hadde samme funn (ikke vist). Til sammen bekrefter disse resultatene at 39 ° C potenserer effekten av cisplatin.
MTT-analyser påvises redusert levedyktighet av Hela og A549-celler behandlet med en lav konsentrasjon (4 pM) av 5-FU (figur 1B, 1C og 1D). Andre, og vi hadde tidligere rapportert at etanol ekstrakt av fedd knopper hadde en potent terapeutisk effekt på en rekke kreftcellelinjer [34,43,44]. Når behandlet med etanol ekstrakt av fedd knopper, Hela, A549 og HCT116 cellene viste alle redusert levedyktighet som oppdages med MTT-analyser (figur 1B, 1C og 1D). Imidlertid krystallfiolett farging viste redusert tetthet av Hela, A549 og HCT116-celler behandlet med 5-FU eller fedd etanolekstrakt ved 37 ° C, og viste en mer uttalt effekt på A549-celler ytterligere, men viste knapt noen effekt på Hela og HCT116-celler, ved 39 ° C (figur 2 og 3). Fordi etanol hovedsakelig trekker hydrofobe komponenter, vi behandlet også disse cellelinjer med en essensiell olje av fedd knopper, noe som resulterte i kraftig drap effekt også (fig 3). Disse resultatene indikerer at 39 ° C faktisk forsterker chemo følsomhet, men potensiering er celle-linje og middel bestemt.
Hela, A549, H1650 og HEK293T celler vise ikke åpenbar forskjell i morfologi mellom 37 ° C og 39 ° C. Imidlertid HCT116-celler var normalt i en uregelmessig form ved 37 ° C, men mange av dem krympet til en sfærisk form ved 39 ° C (figur 7). Ved behandling med en lav konsentrasjon (1 uM) av cisplatin, mange HeLa-celler ved 39 ° C, men ikke ved 37 ° C, byttet til spindel form, som skjedde så tidlig som 30 minutter etter behandlingen (figur 7). Ved en konsentrasjon på 0,025%, fedd olje forårsaket celle krymping og løsgjøring på mindre enn 30 minutter, som ble mer uttalt ved 39 ° C to timer etter behandlingen (figur 7). Sannsynlig, kan slike raske endringer ikke innebærer kaskader av genet aktivering og inaktive
Venstre panel. HCT116 cellene ved 37 ° C vanligvis viser uregelmessig form (pil), men blir sfærisk ved 39 ° C. Behandling med 0,025% fedd olje dreper mange flere celler ved 39 ° C enn ved 37 ° C, med de gjenværende cellene krympede til sfærisk form i løpet av 30 minutter. Høyre panel: Tretti minutter etter behandling med 1 uM cisplatin (CDDP), mange HeLa-celler har endret seg til en spindel form (pil) ved 39 ° C, men forblir uendret ved 37 ° C. To timer etter en behandling med 0,025% fedd olje, mange flere HeLa celler dør ved 39 ° C enn ved 37 ° C.
Interessant, vekstinhibering og celledød fortsatte etter cisplatin ble trukket tilbake, som manifestert ytterligere reduksjon i celletetthet eller koloni antall bestemmes både mikroskopisk observasjon og krystallfiolett farging, spesielt ved 39 ° C, og når cellene ble sådd ut ved en lav tetthet (figur 8). Disse endringene ble mer tydeligvis manifestert i HCT116-celler (fig 3). Egentlig er det i utgangspunktet var ikke levedyktig Hela, A549 og HECT116 celler startet tre dager etter cisplatin uttak i de 39 ° C etter, mens det fremdeles var et betydelig antall levedyktige celler i de 37 ° C retter. Åpenbare potensiering ble også skjelnes ved en 3-dagers behandling med cisplatin ved 37 ° C ble etterfulgt av 3 dagers dyrking ved 39 ° C (data ikke vist). Disse resultater antyder at effekten av 39 ° C på det kjemoterapeutiske effekt av cisplatin er langvarig, går utover behandling. Men dette etterbehandlingseffekt på 39 ° C var både cellelinje og agent bestemt, så det var ikke opplagt i fedd olje behandlet HCT116-celler (figur 3) og heller ikke i 5-FU behandlet HCT116 og Hela-celler (figur 3 og 6 ).
cellene ble deretter behandlet med 1 pM cisplatin, 4 uM 5-FU eller 0,025% fedd olje i 3 dager. Etter at midlet var blitt trukket tilbake, ble cellene tillatt å vokse i én uke. Legg merke til at det er knapt noen kolonier i de 39 ° C retter av Hela og A549 celler behandlet med cisplatin, eller av A549 celler behandlet med fedd olje, selv om én uke hadde fått for vekst, noe som tyder på en post-behandling vekst inhibering. Men dette etterbehandlingseffekt ved 39 ° C ikke skjelnet i 5-FU behandlet Hela eller fedd olje behandlet A549 celler.
39 ° C arrestasjoner celler i G1 fasen og noen ganger motvirker vekst stimuli av serum
Vi lot Hela og A549-celler til å vokse ved 39 ° C i to uker eller lenger med passasjer, slik at cellene hadde tilpasset til HT miljø. Cellene ble så analysert for cellesyklusfordeling. Fordi dataene varierte sterkt mellom forskjellige eksperimenter, ble analysen gjentatt mange ganger med de data som er vist i figur 9. En større fraksjon G1 og gjensidig mindre S og G2-M-fraksjoner ved 39 ° C, sammenlignet med deres 37 ° C motstykker, ble stadig observert, noe som bekrefter at 39 ° C kultur fører til G1 arrest (fig 9). Langsiktige dyrkede HCT116-celler ble også analysert, men som kontrollene for cisplatin behandling, og resultatene viste også en G1 arrest ved 39 ° C (figur 10).
Data er presentert som gjennomsnitt av triplet retter i hvert eksperiment, pluss eller mindreårige standard avvik (SD). I noen eksperimenter, ett eller alle gruppene inneholde bare en enkelt rett og dermed dataene mangler SD. «Synkronisert» betyr at cellene ble fratatt fra serum i 24 eller 48 timer, og deretter etterfylt med serum i angitt tid før bestemmelse av cellesyklusfordelingen. «Exp»: antall eksperimenter utført. «Temp»: kultur temperatur.
en
: signifikant forskjellig fra 39 ° C motstykke (p 0,05, Wilcoxon rank sum test av tre ganger i forsøket).
b
: signifikant forskjellig fra 39 ° C motstykke (p 0,05, Wilcoxon rank sum test av triplet retter innenfor samme eksperiment).
c
. Signifikant forskjellig fra serum-fylles gruppe ved samme temperatur 4 timer senere (p 0,05, Wilcoxon rank sum test av triplet retter innenfor samme eksperiment)
Exp: antall eksperimenter utført. Unn: behandling. Temp: temperatur. Con: ubehandlet kontroll. CDDP: cisplatin. S /G2 /M er summen av S og G2-M-fraksjoner som avviker fra G1-celler ved deres dobbelt DNA-innhold.
en
: signifikant forskjellig fra de ubehandlede celler ved 39 ° C og fra CDDP-behandlede celler ved 37 ° C (p 0,05).
b
: Signifikant forskjellig fra CDDP-behandlede celler ved 37 ° C (p 0,05).
c
: signifikant forskjellig fra ubehandlede celler ved 39 ° C. Wilcoxon rank sum test ble brukt.
For å avgjøre om cellene ved 39 ° C viser en endret respons på serum avledet vekststimuli, trakk vi Hela og A549 celler fra serum i 24 timer, noe som utvidet forskjellen i G1 fraksjonen mellom 37 ° C og 39 ° C (figur 9). Som forventet, fire timer etter serum fylling, noe G1-arrestert HeLa-celler reentered cellesyklus, manifestert som redusert G1 fraksjon og økt S og G2-M-fraksjoner, sammenlignet med serum-belastede motstykker. Siden det er vel kjent, i henhold til vår erfaring og som av mange andre, at synkroniseringen av HeLa-celler ved G1 krever en lengre serum sult, vi også berøvet cellene fra serum i 48 timer, noe som faktisk ytterligere utvidet forskjellen i G1 fraksjonen mellom sultet og etterfylles celler som forventet (fig 9). Forskjellen mellom serum-sult og -replenishment ble også utvidet ved 39 ° C, noe som indikerer at effektene av serum sult og en høyere temperatur er additive på arrestere cellene ved G1.
deprivasjon av A549-celler fra serum også forårsaket G1 arrest. Imidlertid overraskende fire eller til og med ti timer etter serum etterfylling, G1 fraksjon av A549-celler viste bare en liten nedgang ved 37 ° C, selv om dette liten reduksjon fremdeles utvidet forskjellen mellom serum sult og etterfylling og mellom 37 ° C og 39 ° C (figur 9). Mer overraskende, ved 39 ° C, selv 10 timer etter serum fylling, A549-celler var fremdeles ikke frigjort fra G1, noe som indikerer at G1 arrest av A549-celler ved 39 ° C ikke kan overvinnes ved vekst stimuli av serum.
39 ° C og cisplatin endre cellesyklusfordelingen i en celle-linje spesifikk måte
som forventet, Hela, A549 og HCT116-celler behandlet med kun oppløsningsmidlet vist G1 rest ved 39 ° C, manifestert som økt G1 fraksjon og redusert S og G2-M fraksjoner sammenlignet med sine 37 ° C kolleger (uthevet i figur 10). Imidlertid, når de ble behandlet med en lav konsentrasjon (1 uM) av cisplatin, disse cellelinjene oppviste forskjellige profiler av cellesyklusfordeling. HeLa-celler som manifesterer en typisk G2-M rest, det vil si en økning i G2-M-fraksjon og en tilsvarende reduksjon i G1 fraksjon, ved både 37 ° C og 39 ° C, sammenlignet med de ubehandlede motparter (Fig 10). Cisplatin behandlet A549 celler stadig manifestert en G2-M arrest ved 39 ° C, men ofte manifestert G1 arrest ved 37 ° C. Ganske annerledes, har cisplatin-behandlede HCT116-celler ikke viser noen kontinuerlig mønster av endringer i cellesyklusfordeling, enten ved 37 ° C eller ved 39 ° C, sannsynligvis fordi i fravær av cisplatin ved begge temperaturer, HCT116-celler hadde allerede en forholdsvis høy summen av S /G2-M-celler som skiller seg fra G1 celler ved deres doblet DNA-innhold (fig 10).
Diskusjoner
Det har vært rikelig studier publisert på HT terapi av kreft, men de fleste av dem bestemme bare virkningene av en kort varighet av HT, så kort som minutter eller timer [45-48]. Få studier har blitt utført på cellekultur på en moderat febrilsk temperatur for en lengre periode enn en runde av cellesyklus, som er en dag eller lenger for de fleste kreftcellelinjer. Av denne grunn er lite informasjon tilgjengelig for evaluering av kroniske HT virkning på cellevekst og cellesyklusfordeling. Så vidt vi vet, ble den lengste perioden med HT studie i cellekultur utført av Heng laboratorium, som viser at ved en 42 ° C kultur i to påfølgende uker, Colo-357 humane kreft i bukspyttkjertelen celler manifestere en innledende veksthemming, men senere gjenopptas vekst, med økt celledød i forhold til kolleger ved 37 ° C kultur [28]. Vi studerer kronisk påvirkning av 39 ° C på cellevekst og på effektene av flere kjemoterapeutiske midler, som har klinisk betydning basert på to begrunnelser: For det første, feber ved denne temperaturen forekommer ofte i kreft og ikke-kreftpasienter og kan vare i flere dager. For det andre, historisk, leger indusert lang varighet av feber hos pasienter å behandle sine kreft. For eksempel, ble noen av Coleys pasienter gjentatte ganger overtalt til å utvikle feber i år [18].
I gjennomføring av denne studien, vi innser at en høyere temperatur kan øke aktivitetene til MTT-reduserende enzymer, noe som vil resultere i en høyere absorpsjon av reduserte MTT og således en uønsket cellelevedyktighet. Egentlig er vi en gang falt i denne fallgruven fordi det ikke hadde blitt godt omtalt i publiserte studier av HT. Siden noen kjemikalier kan endre aktiviteten av MTT-reduserende enzymer [40], er det mulig at noen terapeutisk kjemikalier kan resultere i tilsvarende kunstgjenstander i MTT-analyser også. Videre tilbyr vi også innse at vi ikke bare mangler en mulig teknikk for å kvantifisere effekten av HT på cellevekst i kultur retter, men mangler også gode dyremodeller for å studere in vivo effekter av HT. Store begrensninger på dyrestudie, i tillegg til mulige etisk anliggende på dyret protokollen, er det in vivo-effekter i stor grad involverer medfødt immunitet og således utelukke bruken av immundefekte mus, og at vi mangler gode pyrogener for å indusere feber siden som vanligvis anvendes pyrogener seg selv, f.eks som endotoksiner [49,50], kan ha kreft effekter.
Det har vært kjent i lang tid som vanligvis cellene trenger for å bli sådd ut ved en terskel tall eller tetthet i en dyrkningsskål, ellers vil ikke vokse . Forklaringen på dette fenomen er at cellene trenger for å samarbeide med hverandre for å kunne overleve og formere seg, noe som er ansett som de cellekultur versjon av Allee virkning [32,33]. En av våre nye funn er at noen chemo stoffer som for eksempel cisplatin og 5-FU påvirke denne terskelen, fordi når cellene blir sådd ut i en lav tetthet, f.eks 1000-2000 celler pr 35 mm skål, forskjellen i kolonien tall mellom chemo medikament behandlede og ubehandlede retter er mye større sammenlignet med den situasjon hvor mer enn 20.000 celler ble sådd i fatet. En høyere temperatur som en form for behandling påvirker også denne terskel ved potensiering virkningene av cisplatin og 5-FU i celle-celle-samarbeid.
