Abstract
Begrunnelsen
Nye måter å definere faktorer som ligger til grunn immunpatogenese av lungesykdommer inkludert sarkoidose og tuberkulose nødvendig å utvikle nye behandlinger og biomarkører. Sammenligning av blod transcriptional responsen av tuberkulose til andre lignende lungesykdommer vil fremme kunnskap om sykdoms stier og å skille sykdommer med lignende kliniske presentasjoner.
Mål
For å finne ut hvilke faktorer som ligger til grunn immunpatogenese av granulomatøs sykdommer, sarkoidose og tuberkulose, ved å sammenligne blod transkripsjons svar på disse og andre lungesykdommer.
Metoder
Vi sammenlignet fullblod genom-wide transkripsjons profiler i pulmonal sarkoidose, lungetuberkulose, til fellesskapet lungebetennelse og primær lungekreft og friske kontroller, før og etter behandling, og i renset leukocytt populasjoner.
Målinger og hovedresultater
En Interferon-induserbar nøytrofile drevet blod transkripsjonen signatur var til stede i både sarkoidose og tuberkulose, med en høyere overflod og uttrykk i tuberkulose. Heterogenitet av sarkoidose signatur korrelerte signifikant med sykdomsaktivitet. Transkripsjons profiler i lungebetennelse og lungekreft avdekket en over-overflod av inflammatoriske transkripsjoner. Etter vellykket behandling transkripsjonen aktivitet i tuberkulose og lungebetennelse pasienter ble betydelig redusert. Men glukokortikoid-responsive Sarkoidose pasientene viste en signifikant økning i transkripsjonen aktivitet. 144-blod transkripsjoner var i stand til å skille tuberkulose fra andre lungesykdommer og kontroller.
Konklusjoner
tuberkulose og sarkoidose avslørt lignende blodtranskripsjons profiler, dominert av interferon-induserbar transkripsjoner, mens lungebetennelse og lungekreft viste tydelige signatur, dominert av inflammatoriske gener. Det var også betydelige forskjeller mellom tuberkulose og Sarkoidose i graden av deres transkripsjonen aktivitet, heterogeniteten av sine profiler og deres transkripsjonen respons på behandling
Citation. Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Rozakeas F, Redford PS, Wang Y, et al. (2013) Transkripsjonell Blood Signaturer Skille lungetuberkulose, Lunge Sarkoidose, lungebetennelse og lungekreft. PLoS ONE åtte (8): e70630. doi: 10,1371 /journal.pone.0070630
Redaktør: Jyothi Rengarajan, Emory University School of Medicine, USA
mottatt: 23. mars 2013, Godkjent: 20 juni 2013; Publisert: 05.08.2013
Copyright: © 2013 Bloom et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AOG, CMG, PSR, Medical Research Council (U117565642), FR Forbruksvarer, Institute Merieux, SILA, CIB støttet av Medical Research Council Clinical Research Training Fellowship; RJW KAW, MRC U1175.02.002.00014.01, Wellcome Trust 084 323 og 088 316, EDCTP (IP.07.32080.0002) og Den europeiske union (FP7 IRSES295214). Rekruttering av pasienter i: Paris (DV, GG, MM og DB) med støtte fra en AP-HP stipend (PHRC AOR-09-085); Lyon, Lyon Network (Handlinger Incitatives Hospices Civils de Lyon). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Robert Wilkinson er PLoS ONE Editorial Styremedlem men dette endrer ikke det forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Ellers alle andre forfattere har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Om lag ni millioner nye tilfeller av aktiv tuberkulose (TB), og 1,4 millioner dødsfall fra TB, er anslått å oppstå globalt hvert år [1]. Rask diagnostisering er avgjørende for å unngå behandling forsinkelse, således evnen til å diskriminere TB fra annen lungesykdom som kan presentere samme måte som TB, slik som sarkoidose, eller ha en akutt (smittsom lungebetennelse) eller kronisk (primær lungekreft) presentasjon er viktig.
TB og sarkoidose er utbredt multisystem sykdommer som fortrinnsvis involverer lunge og ofte til stede i en lignende kliniske, radiologiske og histologiske måte. Skille disse sykdommene kan derfor kreve en invasiv biopsi. Dannelse av arrvev er grunnleggende for begge forholdene, og selv om patogen
Mycobacterium tuberculosis
er anerkjent som etiologisk årsak til tuberkulose, hva ligger til grunn sarkoidose er ukjent [2]. Som er involvert i inflammasjon granulomatøs veier er også dårlig forstått, og det er liten forståelse av sykdomsspesifikke forskjeller. TB og sarkoidose kan også vise en lignende presentasjon til akutt lunge smittsomme sykdommer som smittsom lungebetennelse og kronisk lungesykdom som primær lungekreft.
Gitt kompleksiteten av disse sykdommene en systembiologi tilnærming kan bidra til å løse hoved vertens immunresponser. Perifert blod har kapasitet til å reflektere patologiske og immunologiske endringer andre steder i kroppen, og identifisering av sykdom forbundet endringer kan bestemmes ved et blod transkripsjonen signatur [3]. Til støtte for dette konseptet, har vi nylig demonstrert et interferon (IFN) -inducible blod signatur hos pasienter med lungetuberkulose fra London og Sør-Afrika [4], som nå har blitt validert i tre uavhengige studier i Afrika [5], [6] og Indonesia [7]. Blod genekspresjon profilering er også blitt brukt til andre infeksjonssykdommer og inflammatoriske sykdommer, så som systemisk lupus erythematosus (SLE), for å bidra til å forstå sykdomsmekanismene og forbedre diagnose og behandling [3]. To nyere studier har brukt blod transkripsjonen profilering for sammenligning av lungetuberkulose og sarkoidose; begge studiene fant de sykdommene hadde lignende transkripsjons svar, som er involvert overekspresjon av IFN-induserbare gener [8], [9]. Men disse studiene ikke undersøke andre lignende lungesykdommer å reise spørsmålet om hvorvidt disse transkripsjons signaturer speiles også andre lungesykdommer.
Hovedmålet med studien var å forbedre vår forståelse av immunpatogenese underliggende sarkoidose og tuberkulose ved å sammenligne blod transkripsjons responser i lungetuberkulose pasienter til det som finnes i lunge sarkoidose lungebetennelse og lungekreftpasienter. Vi har også sammenlignet blodtranskripsjonelle responser før og etter behandlingen i hvert sykdom, og undersøkt transkripsjonelle responser som ses i de forskjellige leukocytt-populasjoner av de granulomatøse sykdommer. I tillegg undersøkte vi foreningen i sarkoidose mellom klinisk virksomhet og den observerte blod transkripsjonen heterogenitet.
Metoder
studiepopulasjonen og inklusjonskriterier
De fleste av de tuberkuløse ble rekruttert fra Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, London. De Sarkoidose Pasientene ble rekruttert fra Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, St Marys Hospital Imperial College NHS Trust, Barnet og Chase Farm NHS Trust i London, Oxford Sarkoidose Clinic, Churchill Hospital i Oxford, og Avicenne Hospital i Paris. De lungebetennelse pasienter ble rekruttert fra Royal Free Hospital, London. De lungekreftpasienter og fem av de tuberkuløse i testsettet ble rekruttert av Lyon Collaborative Network, Frankrike. Alle pasienter ble rekruttert fortløpende over tid slik at Training Set ble rekruttert først etterfulgt av Test Set, validering Set og til slutt pasientenes prøvene som ble brukt i cellen rensing. Tilleggs blod genuttrykk data ble hentet fra lunge og latente TB pasienter rekruttert og analysert i vår tidligere studie som ble deretter re-analysert i denne studien når man sammenligner svarene før og etter behandling av tuberkulose [10].
inklusjonskriterier var spesifikke for hver sykdom. Lungetuberkulose pasienter: kultur bekreftet
Mycobacterium tuberculosis
i enten sputum eller bronchoalveolar lavage; pulmonal sarkoidose: diagnose laget av en sarkoidose spesialist, granulomer er på biopsi, kompatible kliniske og radiologiske funn (innen 6 måneder rekruttering) i henhold til retningslinjene WASOG [11]; smittsom lungebetennelse pasienter: oppfylt British Thoracic Society retningslinjer for diagnostisering [12]; lungekreftpasienter: diagnose av en lungekreft spesialist, histologiske og radiologiske funksjoner i samsvar med primær lungekreft; friske kontroller: kjønn, etnisitet og alder var lik pasientene, negativ QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT) (Cellestis) test. Eksklusjonskriteriene for alle pasienter og friske kontroller inkludert betydelige andre medisinske historie (inkludert eventuelle immunsuppresjon som HIV-infeksjon), i alderen under 18 år gravid. Pasientene ble rekruttert mellom september 2009 og mars 2012. Pasientene ble rekruttert før oppstart av behandling med mindre annet er oppgitt.
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av det sentrale London tre forskningsetiske komité (09 /H0716 /41) og CPP Sud-Est IV, Frankrike, CCPPRB, La Salpêtrière, Paris. Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke.
IFNy Slipp analysen Testing
QFT-analysen (Cellestis) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
Gene Expression Profiling
3 ml fullblod ble samlet i Tempus rør (Applied Biosystems /Ambion) ved standard blodprøvetaking, kraftig blandet umiddelbart etter innsamling og lagring mellom -20 og -80 ° C før RNA-ekstrahering. RNA ble isolert ved anvendelse av 1,5 ml helblod og den MagMAX-96 Blood RNA Isolation Kit (Applied Biosystems /Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. 250 ug av isolert total RNA ble globin redusert ved hjelp av GLOBINclear 96-brønners format kit (Applied Biosystems /Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. Total og globin-redusert RNA integritet ble vurdert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA utbyttet ble vurdert ved hjelp av en NanoDrop8000 spektrofotometer (Nanodrop Produkter, Thermo Fisher Scientific). Biotinylated, forsterket antisense komplementær RNA (Crna) målene ble så fremstilt fra 200-250ng av globin-redusert RNA ved hjelp av Illumina CustomPrep RNA forsterkning kit (Applied Biosystems /Ambion). 750 ng av merket cRNA ble hybridisert over natten for å Illumina Menneskelig HT-12 V4 BeadChip arrays (Illumina), som inneholdt mer enn 47.000 prober. Arrays ble vasket, blokkert, farget og skannes på en Illumina iscan, i henhold til produsentens anvisninger. GenomeStudio (Illumina) ble deretter brukt til å utføre kvalitetskontroll og generere signalintensitetsverdier.
Cell Rensing og RNA Processing for Microarray
Fullblod ble oppsamlet i natriumheparin. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble separert fra granulocytter /erytrocyttene ved hjelp av en Lymphoprep ™ (Axis-Shield) tetthetsgradient. Monocytter (CD14 +), ble CD4 + T-celler (CD4 +) og CD8 + T-celler (CD8 +) isoleres i rekkefølge fra PBMC ved hjelp av magnetiske antistoff-koplet (MACS) i fullblod kuler (Miltenyi Biotec, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Nøytrofiler ble isolert fra granulocytt /erytrocytt lag etter røde blodcellelyse etterfulgt av CD15 + MACS kuler (Miltenyi Biotec, Tyskland). RNA ble ekstrahert fra fullblod (5 «Prime PerfectPure Kit) eller separerte celle populasjoner (Qiagen RNeasy Mini Kit). Total RNA integritet og utbyttet ble bestemt som beskrevet ovenfor. Biotinylated, forsterket antisense komplementær RNA (Crna) målene ble så fremstilt fra 50 ng av total RNA ved hjelp av Nugen WT-Ovation ™ RNA forsterkning og Encore BiotinIL Module (Nugen Technologies, Inc). Amplifed RNA ble renset ved anvendelse av Qiagen MinElute PCR-rensesett (Qiagen, Tyskland). cRNA ble deretter behandlet som beskrevet ovenfor.
Rådata Processing
Rådata ble behandlet ved hjelp GeneSpring GX versjon 11.5 (Agilent Technologies) og følgende ble brukt til alle analyser. Etter bakgrunn subtraksjon hver sonde ble tilskrevet et flagg å betegne sin signalintensitet deteksjon
p
-verdi. Flagg ble brukt til å filtrere ut probe sett som ikke resulterte i en «til stede» ringe i minst 10% av prøvene, der «nåværende» lavere avskåret = 0,99. Signalverdier ble deretter satt til et terskelnivå på 10, log2 forvandlet, og per-chip normalisert ved hjelp av 75
th persentil skift algoritmen. Neste per-genet normalisering ble påført ved å dividere hver budbringer-RNA transkript av median intensiteten av alle prøvene. Alle statistiske analyser ble utført etter dette trinnet. Raw microarray data er deponert hos GEO (Tiltredelse antall GSE42834). Alle data som samles og analyseres i forsøkene følge den Minimal informasjon om en microarray Experiment (MIAME) retningslinjer.
Data Analysis
GeneSpring 11.5 ble brukt til å velge utskrifter som viste uttrykk variasjon fra medianen av alle vitnemål (uten tilsyn analyse). Et filter ble satt til å inkludere bare transkripsjoner som hadde minst To gangers endringer fra median og til stede i ≥10% av prøvene. Unsupervised analyse ble brukt til å utlede 3422-transkripsjoner. Bruk av en ikke-parametrisk statistisk filter (Kruskal Wallis test med en FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01), etter den uten tilsyn analyse, genererte 1446-transkripsjon og 1396-transkripsjon signaturer. De to signaturer skilte seg bare i hvilke grupper den statistiske filteret ble påtrykket over; 1446, fem grupper (TB, sarkoidose, lungebetennelse, lungekreft og kontroller) og 1396, seks grupper (TB, aktiv sarkoidose ikke-aktiv sarkoidose, lungebetennelse, lungekreft og kontroller).
Forskjellig uttrykte gener for hver sykdom ble utledet ved å sammenligne hver sykdom til et sett av kontroller passet for etnisk og kjønn løpet av en 10% forskjell. GeneSpring 11,5 ble anvendt for å velge transkripter som var ≥1.5 fold forskjellig i uttrykk fra gjennomsnittet av kontrollene og statistisk signifikant (Mann Whitney uparede FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01). Sammenligning oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) (oppfinnsomhet Systems, Inc., Redwood, CA) ble anvendt for å bestemme de mest betydningsfulle kanoniske baner er forbundet med de differensielt uttrykte gener for hver sykdom i forhold til de andre sykdommer (Fishers eksakte FDR (Benjamini Hochberg) = 0,05). Den nederste x-aksen og barer av hver sammenligning IPA graf angitt log (p-verdi) og den øverste x-aksen og linjen indikerte prosentandelen av gener som er tilstede i reaksjonsveien.
Molecular avstand til helse (MDTH ) ble bestemt som tidligere beskrevet [13], og deretter påført på forskjellige transkripsjonelle signaturer. Transkripsjonen modulære analyse ble påført som tidligere beskrevet [14]. Den rå uttrykket nivåer av alle utskrifter vesentlig oppdaget fra bakgrunnen hybridisering ble sammenlignet mellom hver prøve, og alle kontrollene som finnes i det datasettet. Prosentandelen av betydelig uttrykte gener i hver modul ble representert av fargeintensiteten (Student t-test,
p
0,05), rødt indikerer overekspresjon og blått indikerer underexpression. Den midlere prosentandel av gener og den midlere ganger endring av disse genene i forhold til kontrollene i spesifiserte moduler ble også vist i grafisk form. MDTH og modulær analyse ble beregnet i Microsoft Excel 2010. GraphPad Prism versjon 5 for Windows ble brukt til å generere grafer.
Forskjellig uttrykte gener mellom Training Set tuberkulosepasienter og aktive Sarkoidose pasienter ble utledet ved hjelp Betydningen Analyse av Mikromatriser (SAM) (
q
0,05) og ≥1.5 fold uttrykk endring [15]. SAM ble anvendt på grunn av den økte sensitiviteten av denne ikke-parametrisk test sammenlignet med Mann-Whitney slik at mer differensielt uttrykte transkripter bli identifisert mellom TB og aktiv sarkoidose. Klasse prediksjon ble utført innen GeneSpring 11.5 bruker maskinen lært algoritmen støtte vektor maskiner (SVM). Modellen ble bygget ved hjelp av prøve classifiers «TB» eller «ikke TB». Den SVM modellen skal bygges i en studie kohort og kjøre i en uavhengig kohort å hindre over sittende prediktiv signatur. Dette var mulig for alle kohortene fra vår studie. Der studiekohorter brukte en annen microarray plattform SVM modellen måtte være re-bygget i det kullet. For å redusere virkningene av oversittende de samme SVM parametrene ble alltid anvendt. Kjernen type som brukes var lineære, maksimum gjentakelser 100.000, kostet 100, ratio 1 og validering typen N-fold der N = 3 med 10 repetisjoner. Mottakeren driftskurve (ROC) og areal under kurven (AUC) ble beregnet ved hjelp av Microsoft Excel 2010.
Univariat og multivariat regresjonsanalyse ble beregnet ved hjelp av Stata 9 (StataCorp 2005. Stata Statistiske Programvare: Slipp 9. College Station, TX, StataCorp LP). I multivariat regresjonsanalyse hvor det var mangler datapunkter (serum ACE og HRCT sykdomsaktivitet) for å forhindre liste messig sletting dummy variabel justering ble brukt.
Strøm Beregningene ble utført ved hjelp av strøm Analyse og Sample Size programvare (PASS) 2008.
Resultater
Blodtranskripsjon profiler er lik i de Lunge Granulomatøse sykdommer, tuberkulose og sarkoidose men forskjell fra lungebetennelse og lungekreft
årskull av TB og sarkoidose kjøpte samfunnet lungebetennelse og lungekreft pasienter og friske kontroller er vist i tabell 1 og figur S1-S3, og hensiktsmessig matchet demografisk og klinisk (Tabell S1-2). Studien makt ble beregnet for et treningssett (standardavvik = 0,4, 3000 sonder virkelig uttrykt forskjellig, brett endring av ≥1.5, to utvalgs t-test med FDR på 0,05). Åtte til 40 pasienter per gruppe gir en kraft som er større enn 0,85 for hver sonde (beregnet ved hjelp av PASS 2008) med minimal nytte av å øke størrelsen på utvalget.
Objektiv analyse viste at TB og sarkoidose blod transkripsjonen profiler gruppert sammen men utpreget av lungebetennelse og kreft, som selv gruppert sammen (Training Set, 3422 transkripsjoner, figur S4A). Statistiske filtrering generert 1446 forskjellig uttrykt transkripsjoner (Training Set, figur S4B). Dette clustering mønsteret ble bekreftet i en uavhengig kohort (Test Set, figur 1), og ble ikke påvirket av etnisitet eller kjønn (data ikke vist). Pathway analyse (IPA) viste at TB og Sarkoidose prøver ble forbundet med over-overflod av interferon (IFN) signal- og immunrespons trasé (figur 2). Lungebetennelse og lungecancer prøver ble forbundet med over-overflod av reaksjonsveier forbundet med betennelse. Alle sykdommer viste en under-overflod av T- og B-celle veier.
1446-transkripsjoner ble uttrykt forskjellig i fullblod av treningssettet friske kontroller, lungetuberkulosepasienter, lunge Sarkoidose pasienter, lungebetennelse pasienter og lungekreft pasienter. Clustering av 1446-transkripsjoner ble testet i et uavhengig kohort som de ikke var avledet fra, testsettet. Heatmap viser utskrifter og testsett pasientenes profiler som arrangeres av objektiv algoritme av unsupervised hierarkisk clustering. En stiplet linje er lagt til heatmap for å visualiseringen av de viktigste klyngene som genereres av clustering algoritmen. Avskrift av intensitetsverdiene er normalisert til medianen av alle utskrifter. Røde transkripsjoner er relativt over rikelig og blå transkripsjoner under rikelig. Den fargede bar nederst heatmap indikerer hvilken gruppe profilen tilhører.
Hver av de tre dominerende klynger av vitnemål er forbundet med ulike studiegrupper i Training Set. Den øverste transkripsjon klyngen er over rikelig i lungebetennelse og kreftpasienter og signifikant assosiert med IPA trasé knyttet til inflammasjon (Fishers eksakte med Benjamini Hochberg FDR = 0,05). Den midterste transkripsjon klyngen er over rikelig i TB og Sarkoidose pasienter og signifikant assosiert med IFN signalisering og andre immunrespons IPA baner (Fishers eksakte med Benjamini Hochberg FDR = 0,05). Bunnen transkripsjon klyngen er under rikelig i alle pasienter og signifikant assosiert med T- og B-celle IPA baner (Fishers eksakte Benjamini Hochberg FDR = 0,05).
heterogenitet av Transkripsjon Profiles i Sarkoidose Pasienter korrelerer med kliniske Phenotype
Transkripsjon profiler av de Sarkoidose pasienter gruppert enten med tuberkulosepasienter eller med friske kontroller (1446 transkripsjoner, figur 1). Pasientene ble således bedømt for sykdomsaktivitet (merket som enten aktivt eller ikke-aktivt) ved en forhåndsdefinert beslutningstre av en kompositt av kliniske parametere som reflekterer et bilde profil av sykdomsaktivitet på det tidspunktet punktet (figur S5; Tabell S3). 1396-transkripsjoner ble funnet å være forskjellig uttrykt ved hjelp av denne sarkoidose klassifisering. Igjen aktive Sarkoidose pasienter gruppert med tuberkulosepasienter, mens ikke-aktive Sarkoidose pasienter gruppert med kontrollene (1396 transkripsjoner, figur 3A). Dette ble validert i den uavhengige kohorter Test og validering Stiller (figur S6a B; Tabell S4A, S4B).
1396-transkripsjoner er uttrykt forskjellig i hele blod Training Set etter påføring av analysen over seks grupper for å inkludere de to fenotyper på sarkoidose pasienter. (A) De 1396 utskrifter og Training Set pasientenes profiler er organisert av unsupervised hierarkisk clustering. En stiplet linje er lagt til heatmap for å klargjøre de viktigste klyngene som genereres av clustering algoritmen. Avskrift av intensitetsverdiene er normalisert til medianen av alle utskrifter. (B) Molekylær avstand til helsen til 1396 transkripsjoner i opplæring og testsett viser kvantifisering av transkripsjonen endring i forhold til kontrollene. Middelverdien, SEM og
p-
verdier vises (ANOVA med Tukey multippel sammenligningstest).
Bruk av Molecular avstand til helse (MDTH) algoritme [13] til alle sykdommen grupper viste at det ikke-aktive sarkoidose MDTH resultatet var ikke kvantitativt signifikant forskjellig fra kontrollene, mens den aktive sarkoidose MDTH stillingen (figur 3B). TB score var betydelig høyere enn de aktive Sarkoidose score, og lungebetennelse score var betydelig høyere enn lungekreft score, med lungebetennelse og tuberkulose har de høyeste MDTH score. Samlet tyder dette på en kvantitativ og kvalitativ forskjell i blodtranskripsjons signaturer.
Tre Data Mining Strategier Vis at TB og Active Sarkoidose er dominert av IFN-induserbare gener, mens lungebetennelse og lungekreft er dominert av inflammatoriske gener
Vi videre undersøkt de biologiske veier knyttet til hver sykdomsgruppe, ved hjelp av modulære analyse, [14], IPA, og annotering av topp differensielt uttrykte gener for hver sykdomsgruppe. Modular analyse, som tar hensyn til alle genene forskjellig uttrykt mot kontroller, bekreftet at TB og aktiv sarkoidose viste signifikant overekspresjon av IFN-moduler i forhold til de andre lungesykdomsgrupper (figur 4A, Training Set Figur S7, Test Set), mens lungebetennelse og kreftpasienter viste signifikant overekspresjon av betennelsesmodulene (figur 2). TB-pasienter viste en betydelig kvantitativ økning i antall av IFN-induserbare gener og deres grad av ekspresjon, sammenlignet med de aktive Sarkoidose pasienter (figurene 4b, 4c). Lungebetennelse og lungecancer viste en signifikant økning i antall gener som er tilstede i betennelses modulene og deres grad av ekspresjon, i forhold til TB og aktiv sarkoidose (figurene 4D, 4E). Lungebetennelse pasientene viste en økning i antall gener som finnes i nøytrofile modulen (figur S8), korrelere med blod nøytrofiltall (Spearmans korrelasjon, r = 0,42,
p
0,0001).
( A) genuttrykk nivåer av alle utskrifter som ble betydelig oppdaget i forhold til bakgrunnen hybridisering (15212 transkripsjoner,
p
0,01) ble sammenlignet i Training Set mellom hver pasientgruppe: TB, aktiv sarkoidose, ikke-aktive sarkoidose, lungebetennelse, lungecancer, for å friske kontroller. Hver modul tilsvarer et sett av co-regulert gener som ble tildelt biologiske funksjoner av objektiv litteratur profilering. En rød prikk indikerer betydelig over-overflod av vitnemål og en blå prikk indikerer betydelig under overflod (p 0,05). Fargeintensiteten korrelerer med prosentandelen av gener i den modul som er betydelig forskjellig uttrykt. Den modulære analyse kan også være representert grafisk som vist i (B) – (E), inkludert både trening og testsett prøver. Middelverdien, SEM og
p-
verdier vises (ANOVA med Tukey multiple sammenligningstest). (B) Den prosentandelen av gener betydelig overuttrykt i de 3 IFN moduler for hver sykdom. (C) Et ganger endring av ekspresjonen av genene som er tilstede i de IFN-modulene i forhold til kontrollene. (D) Prosentandelen av gener betydelig overuttrykt i de 5 inflammasjons moduler for hver sykdom. (E) Den ganger endring av ekspresjonen av genene som er tilstede i inflammasjons modulene i forhold til kontrollene.
Sammenligning IPA, ved hjelp av gener som er differensielt uttrykte mellom hver sykdomsgruppen og et samsvarende sett med kontroller , avslørte de mest betydningsfulle veier når en sammenligner på tvers av sykdommer (≥1.5 ganger endring fra kontrollene, Mann Whitney Benjamini Hochberg
p
0,01; TB = 2524, aktiv sarkoidose = 1391, lungebetennelse = 2801 og lungekreft = 1626 transkripsjoner). De fire beste betydelige trasé var knyttet til proteinsyntese (EIF2 signalering), immunrespons, IFN signalering, mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner bakterier og virus, og antigen presentasjon (figur 5A og tabell S11). Under-overflod av EIF2 signalveien ble drevet av lungebetennelse pasienter. Andre gener knyttet til proteinsyntese (ribosomale proteiner og andre eukaryote initiering faktorer) og utfoldet protein respons (en stressrespons til overdreven protein syntese), var også betydelig under rikelig i lungebetennelse pasienter f.eks Ekstra fordel, CHOP, ABCE1 (data ikke vist). Den statistiske signifikans (nederst x-aksen, søylediagram, figur 5A) og andel av gener (top x-aksen, linjediagram, figur 5A) av de tre immunrespons trasé ble drevet hovedsakelig av TB og aktiv Sarkoidose pasienter, som igjen viser likheten av de biologiske trasé bak disse sykdommene. Men IFN-signalveien var mer signifikant (figur 5A) og inneholdt et høyere antall gener i TB enn aktiv sarkoidose (figur 5B).
differensielt uttrykte gener ble avledet fra treningssettet ved å sammenligne hver sykdom til friske kontroller matchet for etnisitet og kjønn: TB = 2524, aktiv sarkoidose = 1391, lungebetennelse = 2801 og lungekreft = 1626 transkripsjoner (≥1.5 ganger endring fra gjennomsnittet av kontrollene, Mann Whitney med Benjamini Hochberg FDR = 0,01). (A) IPA kanoniske trasé ble anvendt for å fast de mest betydningsfulle baner (i-iv) som er tilknyttet hver enkelt sykdom i forhold til de andre sykdommer (Fishers eksakte med Benjamini Hochberg FDR = 0,05). Den nederste x-aksen og barer av hver kurve som viser log (p-verdi) og den øverste x-aksen og linjen angir prosentandelen av gener som er tilstede i reaksjonsveien. Genene i EIF2 signalveien er hovedsakelig under-rik gener imidlertid genene i de andre tre banene er hovedsakelig over rikelig i forhold til kontrollene. Ovennevnte risiko den blå stiplede linjen er signifikant (p 0,05). (B) Den IFN signale IPA veien er lagt over hver sykdomsgruppe. Fargede gener er uttrykt forskjellig i at sykdomsgruppe i forhold til sine matchede kontroller (Fishers eksakte FDR = 0,05). Røde gener representerer over-overflod og grønt under-overflod. Den veien for TB er vist forstørret så detalj av genene kan sees, er det også vist igjen på en mye mindre skala i tillegg til de andre sykdommer, slik som en visuell sammenligning kan gjøres lettere.
de top 50 over-rike forskjellig uttrykt transkripsjoner for hver sykdom korrelert med funnene fra den modulære og IPA analyse hvor TB og aktiv sarkoidose ble dominert av IFN-induserbare gener f.eks IFITM3, IFIT3, GBP1, GBP6, CXCL10, OAS1, STAT1, IFI44L, FCGR1B (tabell S5). Igjen disse var større i antall i TB enn sarkoidose. Topp 50 over-overflod transkripsjoner i lungebetennelse ble dominert av antimikrobielle nøytrofile relaterte gener f.eks Elane, DEFA1B, MMP8, CAMP, DEFA3, DEFA4, MPO, LTF. Genene FCGR1A, B og C var over rikelig i de 50 beste transkripsjoner av alle fire lungesykdommer. En 4-set Venn-diagram av de forskjellig uttrykte gener demonstrert unike gener for hver sykdomsgruppe (figur S9 og tabell S6), med over tre ganger så mange unike TB gener enn unike aktive Sarkoidose gener. TB unike gener består immunresponser gener signifikant assosiert med IFN-signalveien og antigen presentasjon. De unike pneumoni genene var forbundet med en under-overflod av veier relatert til proteinsyntesen. De unike lungekreftgener var forbundet med over-overflod av inflammasjonsrelaterte trasé og under-overflod av T-celle-reaksjonsveier. Overlappende gener som er felles for alle fire sykdomsgrupper var signifikant assosiert med under-overflod av T- og B-celle veier.
TB og lungebetennelse etter behandling viste en forringelse av Transkripsjon Profiles Mens Sarkoidose pasienter som responderte på Glukokortikoider viste en betydelig økning i transkripsjonen aktivitet
Vi neste undersøkt transkripsjons respons på behandling. Lungebetennelse pasienter, fulgt opp i minst 6 uker etter utskrivning fra sykehuset, viste en god klinisk respons på standard antibiotikabehandling (tabell S7A) og en forringelse i sine transkripsjons profiler til nivået av kontroller ved modul analyse (alle påvisbare transkripsjoner) og MDTH (1446-transkripsjoner) (Figur 6A 6B). Den MDTH av 1446-transkripsjoner utledet i denne studien av ulike lungesykdommer, ble også redusert i blodet av sørafrikanske tuberkulosepasienter ved gjennomføring av behandling, gå tilbake til undertegning av latent TB-kontroller (figur 6C) og støtte vår forrige rapport [10].
(A) Modular analyse.
