Abstract
Bakgrunn
collagen11A1 (COL11A1) genet er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft. Uttrykket av COL11A1 protein kan være involvert i desmoplastic hendelser i kreft i bukspyttkjertelen, men et antistoff som spesifikt flekker på COL11A1 protein er ikke tilgjengelig for øyeblikket.
Metoder og funn
Det er totalt 54 pancreatic ductal adenokarsinomer (PDAC), 23 kronisk pankreatitt (CP) prøver og kultivert peritumoral stromale celler av PDAC (passasjer 3-6) ble studert. Normale menneskelige bukspyttkjertel vevsprøver ble oppnådd gjennom en avdød organdonasjon program.
1) Validering av COL11A1 genet overekspresjon av q-RT-PCR. Funn:. Uttrykk for COL11A1 genet er betydelig økt i PDAC prøver vs. normale og CP prøver
2) Analyse av COL11A1 ved immunhistokjemi hjelp av svært spesifikke anti-proCOL11A1 antistoffer. Funn:. Anti-proCOL11A1 flekker stromal celler /kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) av PDAC men det betyr ikke flekke kronisk godartet tilstand (kronisk pankreatitt) stromale celler, epitelceller, eller normale fibroblaster
3) Evaluering av diskrimineringen evnen til antistoffet. Funn:. Anti-proCOL11A1 farging nøyaktig diskriminerer mellom PDAC og CP (AUC 0,936, 95% KI 0,851, 0,981)
4) Fenotypisk karakterisering av proCOL11A1 + stromale celler co-farging med mesenchymale, epiteliale og stelcellemarkører på bukspyttkjertelen vevsprøver og kultur peritumoral bukspyttkjertelkreft stromale celler. Funn: ProCOL11A1 + celler til stede samtidig farging med mesenchymale, stel og epiteliale markører (EMT fenotype) i forskjellige forhold
Konklusjon /Betydning
Påvisning av proCOL11A1 gjennom farging med denne nyutviklede antistoff tillater. for en svært nøyaktig skille mellom PDAC og CP. I motsetning til andre tilgjengelige antistoffer som vanligvis brukes til å påvise kafeer, er anti-proCOL11A1 negativ i stromale celler i normale bukspyttkjertelen og nesten fraværende i godartet betennelse. Disse resultatene sterkt at proCOL11A1 er en spesifikk markør for kafeer, og dermed er anti-proCOL11A1 et kraftig nytt verktøy for kreftforskning og klinisk diagnostikk
Citation. García-Pravia C, Galván JA, Gutiérrez-Corral N, Solar-García L, García-Pérez E, García-Ocaña M, et al. (2013) Overuttrykte COL11A1 av kreft-assosiert fibroblaster: kliniske relevansen av en stromal Marker i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (10): e78327. doi: 10,1371 /journal.pone.0078327
Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spania
mottatt: 28 april 2013; Godkjent: 11 september 2013; Publisert: 23 oktober 2013
Copyright: © 2013 García-Pravia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen har vært co-finansiert av ERDF Midler fra EuropeanUnion; av INNPACTO-ONCOPAN IPT-010000-2010-31 prosjekt; av Fiss-09- PS09 /01 911 Project, departementet for vitenskap og innovasjon, Spania; FC-11-PC10-23 Project, FICYT, Axe en av 2007-2013 ERDF Operational rammeprogram av Asturias, Spania; og ved Progenika Biopharma, S.A. og Oncomatrix, S.L. Derio, Spania. Den proCOL11A1 mAb er patentert av Oncomatrix, S.L. (PCT /ES2012 /070616, WO 2013/021088 A2). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Antistoffet beskrevet i denne studien er under en patent arkivert av legene. Luis Barneo, Carmen García-Pravia, Juan R. de los Toyos, Marcos García-Ocaña, Jokin Del Amo-Iribarren, Laureano Simón-Buela og andre med tittelen: metoder og produkter for in vitro diagnose, In vitro prognose og utvikling av legemidler mot invasiv karsinom (PCT /ES2012 /070616, WO 2013/021088 A2). Jokin Del Amo-Iribarren fungerer for Progenika Biopharma, S.A. og Laureano Simón-Buela fungerer for Oncomatrix, S.L. Denne studien ble delvis finansiert av Progenika Biopharma, S.A. og Oncomatrix, S.L. Det er ingen andre patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) representerer den fjerde største dødsårsaken av kreft hos menn og kvinner. Den 5-års overlevelse er mindre enn 5% og gjennomsnittlig overlevelse er 6 måneder etter den første diagnosen. Selv hos pasienter som gjennomgår reseksjon, langsiktige overlevelse forbli ekstremt dårlig [1]. På det nåværende tidspunkt finnes det ingen tidlig diagnose-metoder eller effektive terapier for anvendelse mot denne type tumor. Til tross for fremskritt har blitt gjort i sin diagnose og behandling fortsetter kreft i bukspyttkjertelen for å ha den verste prognose av alle faste ondartede tumorer. Kreft i bukspyttkjertelen er paradigmet av avansert neoplastisk sykdom: uavhengig av TNM stadium, de fleste pasientene stede med disseminert sykdom i de tidlige fasene [2]. Videre er kreft i bukspyttkjertelen motstandsdyktig mot kjemoterapi og strålebehandling [3].
Bukspyttkjertel carcinoma er preget av en desmoplastic reaksjon som involverer cellulære og acellulære komponenter, for eksempel fibroblaster (aktivert eller hvile), myofibroblasts, pericytes, bukspyttkjertel stel celler, immunceller, blodårer, den ekstracellulære matriks, og oppløselige proteiner slik som cytokiner og vekstfaktorer [4,5]. Denne heterogene stroma påvirker flere aspekter av PDAC og ser ut til å fremme tumorvekst, invasjon, og motstand mot kjemoterapi [6-9].
Kronisk pankreatitt er en betennelsessykdom preget av irreversible og progressive ødeleggelse av orgelet, som resulterer i eksokrin og endokrin insuffisiens. Den tapte parenkymet erstattes av tett bindevev med infiltrere leukocytter og ductular hyperplasia. Kronisk pankreatitt øker risikoen for å utvikle kreft i bukspyttkjertelen [10-12], noe som tyder på at kronisk betennelse i bukspyttkjertelen kan være en predisponerende faktor for utvikling av kreft betydelig. Den utløsende sammenheng mellom kronisk betennelse og kreft ble beskrevet to århundrer siden av Marjolin [13], men de inflammatoriske mediatorer som fører til utvikling av kreft forblir udefinert.
Blant de tumorassosierte matrise kollagen, fibrillar kollagen er det mest iøynefallende. Kollagen syntetiseres som prokollagener av fibroblaster. Disse prokollagener har en hoved sentral trippel-heliks domene, betegnet som α1, α2, og α3, og kodet av spesifikke gensekvenser. Når utskilt til det ekstracellulære miljø, er disse prokollagener spaltes, og deretter de modne kollagenmolekylene montere ekstracellulært i fibriller. I normalt vev, kollagen type I, II og III er de viktigste store fibrillære kollagener, mens kollagener V og XI er mindre tallrike små fibrillære kollagener [14]. Kollagener V og XI deler en 75% homologi i deres aminosyresekvens nivå. Prokollagener α1 av typene V og XI er kodet av COL5A1 og COL11A1 gener, respektivt.
Studier av fibroblaster i nærheten av tumoren, de såkalte kreft-assosiert fibroblaster (CAF) har demonstrert deres rolle i å stimulere tumorprogresjon [15-20]. Egenskapene til kafeer har blitt undersøkt i dybden, som viser at deres genotypisk uttrykk, vekstmønster, vandringsadferd og utskillelsen av vekstfaktorer skiller seg fra normale fibroblaster [15,21]. Men ikke forskerne ikke har konkrete verktøy for å differensiere kafeer fra inflammatoriske fibroblaster. Vimentin (VIM) og alfa-glatt muskel aktin (αSMA) blir ofte brukt for å identifisere kafeer, men disse bio-markører er ikke bestemt, siden de flekker inflammatoriske fibroblaster og andre celler i tillegg. Vi har tidligere identifisert 116 gener som ble overuttrykt i PDAC bruk av DNA-mikromatriser [22] (se Fil S2). Vi har funnet gener av den ekstracellulære matriks hvis ekspresjon ble øket sammenlignet med normal og kronisk pankreatitt (CP) vev. En av de mest betydelig og konsekvent overuttrykt gener var COL11A1 (tabell S1 i File S1). På grunn av mangelen på en pålitelig kommersiell antistoff, genererte vi et polyklonalt kaninantiserum til en meget spesifikk aminosyre strekning av humant proCOL11A1 for å vurdere proteinnivået uttrykt i bukspyttkjertelkreft [23]. Deretter utviklet vi et monoklonalt antistoff [24], svært spesifikk for human proCOL11A1, som tydelig markerer disse peritumoral stromale celler.
I denne studien har vi forsøkt å bekrefte overekspresjon av COL11A1 genet i PDAC. I tillegg har vi vurdert den kliniske nytten av immundeteksjon av proCOL11A1 i PDAC og CP vev. Til slutt, vi utforsket de fenotypiske egenskapene til COL11A1-uttrykke celler i bukspyttkjertelen stroma.
Materialer og metoder
Pasient egenskaper og vevsprøver
immunhistokjemi studier med anti-proCOL11A1 pAb ble utført på 54 PDAC og 23 CP (20 alkoholiker, 2 autoimmun, en galle) historiske parafininnstøpte eksempler hentet fra kirurgiske prøver fra pasienter som gjennomgikk kirurgi på sykehuset Universitario Central de Asturias, Oviedo, Spania. Gjennomsnittsalderen til pasientene med PDAC var 65 ± 9 år (46-81 år) og, 56 ± 12 år (25-73 år) av pasienter med CP. Kjønns ratio (M /F) var 37/17 for PDAC pasienter, mens mannlig dominans var enda høyere i CP pasienter (22/1). (.. AJCC Cancer Staging Manuell syvende ed 2010) Fordelingen av PDAC tumorstadium i henhold til TNM klassifikasjon var: IA, 13%; IB, 17%; IIA, 19%; IIB, 37%; III, 6%; IV, 9%. Den neoplastisk gradering var: G1, 20%; G2, 66%; G3, 12%; G4, 2%. Den anti-proCOL11A1 mAb ble påført 69 (51 PDAC og 18 KB) av de foregående tilfellene. Ferskt fjernet PDAC, CP og prøvene normal pankreas vev ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen i operasjonsrommet og lagret ved -80 ° C inntil behandling. Den normale menneskelige bukspyttkjertelen vevsprøver ble oppnådd gjennom en avdød organdonasjon program (6 tilfeller, alle 41-76 år gamle menn) og ble brukt for q-RT-PCR. Friske prøver ble brukt til å isolere og kultur fibroblastene. Q-RT-PCR studier ble brukt til frosne PDAC og CP prøver. Denne studien er i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Hospital Universitario Central de Asturias etisk komité (Prosjekt n ° 42/12). Alle pasienter signerte samtykkeerklæringer som indikerer deres villighet til å delta og deres forståelse av prosedyren og generelle Målet med studien.
Kvantitativ RT-PCR av COL11A1
Total RNA ble isolert fra bukspyttkjertelen biopsier ved hjelp TRIzol reagens (Life Technologies) og cDNA ble syntetisert med revers transkriptase enzym Super II RNase (Life Technologies). Alle PCR-reaksjoner ble kjørt i duplikat på en LightCycler 2.0 (Roche) ved bruk av DNA Faststart hoved SYBR grønn I-sett (Roche). Primersekvensene var som følger: COL11A1 (målgenet): forover 5 «TGGTGAT CAGAATCAGAAGTTCG 3′, revers 5»-AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC 3 «; Ribosomalt protein L10 (referanse genet): forover 5 «TGCGATGGCTGCACACA 3», reversere 5 «TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC 3». Effektiviteten av PCR-reaksjonene ble beregnet ved bruk av referansekurver med seriefortynninger av cDNA. Forholdene mellom normaliserte genuttrykk verdier ble bestemt ved bruk av relativ kvantifisering ligningen som korrigerer for forskjeller i PCR effektivitet [25]. Til slutt ble genekspresjonsdata forhold mellom svulst og kontrollprøver med Mann-Whitney U-test.
Rabbit polyklonale antiserum til det variable området av menneskelig prokollagen 11A1 (anti-proCOL11A1 pAb)
har tidligere beskrevet genereringen av denne antiserum [23]. I korthet, når det rekombinante COL11A1-TGST-fusjonsprotein ble konstruert, uttrykt og renset, ble en hvit New Zealand kanin injisert intramuskulært ved 2 ukers mellomrom med 2 ml immunogen emulsjon av det rensede COL11A1-T-GST-fusjonsprotein (se Arkiv S2). Residuet oppnådd ved hjertepunktering antiserum ble utarmet for den anti_GST reaktivitet. IgG-fraksjonen ble renset ved hjelp av protein A-Sepharose.
Mus monoklonalt antistoff mot humant prokollagen 11A1 (anti-proCOL11A1 mAb)
Metodikken for generering av anti-human proCOL11A1 monoklonalt antistoff og for karakterisering av disse har blitt publisert [24]. Oppsummert ble renset COL11A1-T-GST-fusjonsprotein som brukes til å hyperimmunize BALB /c-mus. Ved hjelp av Sp2 /0-myelomceller som fusjonspartner, B-celle-hybridomer ble samlet ved standardmetoder. Antistoffet, DMTX1, ble levert av Oncomatrix, SL, Derio, Spania (Ref # P0002, vare # 200212).
Etablering av cellekulturer
Prøver ble hentet fra tumorområdet, peritumoral område og normal området ved hjelp av ulike kirurgiske kniver for å unngå forurensning. Representative prøver ble histologisk undersøkt. Prøvene ble transportert i RPMI-1640-medium (Gibco, Invitrogen) supplert med amikacin og vankomycin (Normon Laboratories, Madrid, Spania, begge ved 40 ug /ml) til kulturen laboratoriet hvor de ble skåret opp i mindre fragmenter ved hjelp av kirurgiske sakser. De oppnådde fragmenter ble enzymatisk spaltet med kollagenase (type I 2 mg /ml, Sigma) i 1-2 timer. Etter fordøyelse, ble de kollagenaseoppløsning sentrifugert ved 400 g i 10 minutter. Pelleten ble resuspendert i en fibroblast kulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco, Invitrogen) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, Gibco, Invitrogen), amikacin og vankomycin (begge ved 40 ug /ml). De vevfragmenter som ikke var blitt spaltet med kollagenase gikk en andre fordøying med 0,05% trypsin og 0,02% EDTA (T /E, Gibco, Invitrogen, Barcelona, Spania) i 30-60 minutter. Den fjernede T /E ble inaktivert med serumholdig dyrkningsmedium (DMEM + 10% FCS) og sentrifugert ved 400 g i 10 minutter. pelleten ble resuspendert i fibroblast kulturmediet. Celler erholdt fra kollagenase fordøyelse og trypsin fordøyelse ble sådd ut i seks-brønns plater ved hjelp av fibroblast kulturmedium og holdt ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. mediet ble skiftet hver 3. dag. Når den primære kultur ble sammenflytende, ble cellene vasket to ganger med PBS og behandles med T /E inntil de ble løsnet. Deretter ble T /E ble nøytralisert med kulturen medium og sentrifugert ved 400 g i 10 minutter for å gjenvinne cellene. Alle stromale celler ble anvendt ved tidlige passasjer (passasjer 3-6). Cellen renhet stromale celler ble vurdert av morfologi og etter farging for vimentin.
Immunohistochemistry og dobbel farging i bukspyttkjertelen vev reseksjon
hentet fra bukspyttkjertelen vevsprøver ble fiksert i en 10% formaldehyd løsning, parafin innebygd, skåret tre mikrometer tykk og farget med H E for histologisk undersøkelse. Antigen gjenfinning ble utført ved å varme opp prøvene i
PTLink plakater (DakoCytomation, Danmark) i bufferoppløsning ved høy pH-verdi i 20 minutter. Endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert med
Peroxidase Blokkering Reagens plakater (DakoCytomation, Danmark) i 5 minutter. Prøvene ble inkubert ved 37 ° C med de primære antistoffer som er beskrevet i tabell 1, inkubert med HRP EnVision Flexsystem (DakoCytomation, Danmark) i 30 minutter ved romtemperatur og farget med DAB (3-3′-Diaminobenzidin) (DakoCytomation, Danmark) i 10 minutter. Til slutt, de ble kontra i 10 minutter med hematoksylin (DakoCytomation, dehydrert og montert i Entellan® (Merck, Tyskland) AntiproCOl11A1 pAb ble analysert ved 1:.. 2000 i buffer S2022 (Dako)
primære antistoffer (arter)
Clone
Commercial henvisning
fortynning
Inkubasjonstiden (min)
ProCOL11A1 (mAb) 1E8.33 (DMTX1) Oncomatrix1: 40030ProCOL11A1 (pAB) Oncomatrix1.200030Alpha-glatt muskulatur aktin (mAB) 1A4Dako, DenmarkR-t-U20Desmin (mAB) D33Dako, DenmarkR-t-U20GFAP (mAb) GA-5Biogenex, The Netherlands1: 20020Citokeratin 7 (mAb) OV-TL 12 /30Dako, DenmarkR-t-U20Vimentin (pAB) C-20Santa Cruz Biotech , Germany1. 60010Table 1. Antistoffer brukes i immunhistokjemisk analyse
(pAB) Polyclonal Rabbit, (mAb) Monoclonal Mouse, RTU klar til bruk CSV ned CSV
for å vurdere koekspresjon av Pro-Col11A1 med mesenchymale (αSMA og VIM), epitel (CK7), og bukspyttkjertelen stel celle (desmin, Glial Fibrillary Surt Protein-GFAP-) markører, dobbel farging ble utført ved hjelp av ultra-visning Universal alkalisk fosfatase Red deteksjon kit (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) som red kromogen og DAB som brun kromogen. Tidligere prøvene var blitt inkubert ved 37 ° C med de primære antistoffer som er beskrevet i tabell 1.
Immunocytofluorescence av dyrkede stromale celler og Konfokalmikroskopi
Celler ble fiksert i aceton (-20 ° C ) i 10 minutter i kammeret lysbildet. Cellene ble tørket ved romtemperatur og deretter ble innført i vaskebuffer (Dako) i 30 minutter. Prøvene ble inkubert med anti-proCOl11A1 mAb (DMTX1, Oncomatrix) med Cytokeratin 7 (CK7) antistoff og VIM antistoff, til romtemperatur, på de vilkår som er angitt i tabell 1. De sekundære antistoffer som brukes ble grønn anti-kanin Alexa- 488 (1: 500, Invitrogen) og rød-anti-kanin Alexa-546 (1: 500, Invitrogen), i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble de seksjoner montert sammen med monteringsmedium inneholdende DAPI (Vector Labs).
colocalization (proCOL11A1 vs. VIM, proCOL11A1 vs. Ck7, proCOL11A1 vs. αSMA og VIM vs. CK7) ble visualisert og fotografert ved hjelp av en Leica TCS SP2 konfokalmikroskop med 63x og 100X olje nedsenking mål, ved hjelp av følgende kilder til belysning for hvert fluorokrom eksitasjon. Argon /Krypton laser (488 nm), Helium /Neon laser (546 nm) og blå-fiolett Diode (405 nm)
PDAC vs. CP immunhistokjemi vurdering
Assessment ble utført i fire regioner som er valgt som de beste representantene for desmoplastic reaksjon. Saker som presenteres 4 positive felt gjennom 10X objektiv ble tildelt maksimal poengsum på 4, mens negative feltene ble tildelt minimum score på 0. For fargingen vurdering, en 20X-feltet i det største området med den mest intense flekker ( «hot spot «) ble valgt. Saker med mindre enn 1% positive celler i forhold til stromal overflaten ble tildelt en score fra 0, tilfeller med mellom 1 og 10% ble tildelt en score på 1, saker med mellom 10% og 50% ble tildelt en score på 2, og tilfeller med mer enn 50% positive celler ble tildelt en poengsum på 3. totalt variasjon i farging ble definert ved å multiplisere antall positive felter (0-4) av feltets fargeintensitet (0-3), noe som gir en total poengsum på 0-12. Den farging var dobbelt-blind scoret av to patologer (CGP og JGG). En serie på 24 PDAC og 16 CP immunostained lysbilder ble også kvantifisert ved hjelp av QWin bildeanalyseprogram (Leica) for å sammenligne dem med patologenes score. Bilder av det største området med den mest intense farging ble tatt gjennom den 20X objektiv av et Olympus mikroskop BX61 og registrert på et Olympus DP70 kamera.
Statistiske data analyse
Under forutsetning av ulik varians, søkte vi Welch test for å fastslå betydningen av forskjellene i bildedataene mellom PDAC og kronisk pankreatitt prøver. ANOVA-test ble også anvendt. Korrelasjonen mellom ulike bildeparametere ble vurdert ved hjelp av Spearman Rank korrelasjonstest. Sensitiviteten og spesifisiteten av proCOL11A1 ble avbildet som en mottaker bruksegenskap (ROC) analyse. Den nøyaktighet (dvs. korrekt klassifisert tilfeller) ble beregnet. Plasseringen av cut-off i kurven vil avgjøre antall sanne positive, sanne negative, falske positive og falske negative. Kriteriet verdi er cut-off som svarer til den høyeste nøyaktighet (minimal falske negative og falske positive resultater). Utvalgsstørrelsen som brukes i vår immunhistokjemisk studie (n = 77) mulig for oss å oppnå statistisk signifikans (alfa = 0,05) for en AUC = 0.9 under nullhypotesen av en AUC = 0,5, med en statistisk styrke på 90%. Alle analysene ble gjennomført ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap (SPSS 13) eller MedCalc v9.4.1.0.
Resultater
Q-RT-PCR av COL11A1 og immunhistokjemi av bukspyttkjertelen vev med anti-proCOL11A1
kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker høye nivåer av COL11A1 mRNA, som vist ved kvantitativ RT-PCR (figur 1). Resultatene bekreftet en betydelig økt uttrykk av COL11A1 genet i PDAC prøver vs. normale og CP prøver (endring: 174; SLR: 7)
Alle PDAC prøvene testet med anti-proCOL11A1 mAb og. med antiproCOL11A1 pAb viste sterk intracytoplasmatic merking av tumor rundt desmoplastic stromal kafeer (figur 2E Figur S1D i File S1). Fargingen var ikke utbredt, men heller lokalisert i bundne peritumoral områder, også der kreftceller ikke ble sett. De morfologiske trekk ved disse fibroblast-lignende stromale celler var kompatibel med de av myofibroblasts (figur SLE, F i File S1). Ekstracellulære farging ble aldri observert. I motsetning til ekspresjonen av proCOL11A1 i kronisk pankreatitt prøvene var enten fraværende (figur 2A, Figur S1B i File S1) eller meget lav og begrenset til noen få stromale celler. CP stroma viste fibrotiske og inflammatoriske forandringer uten bemerkelsesverdig myofibroblastic befolkningen. Normale bukspyttkjertel og epiteliale kreftceller, på den annen side, ikke viste noen farging i det hele tatt med anti-proCol11A1 (figur S2 i File S1). Normale bukspyttkjertel viste farging med VIM og αSMA, men ikke flekken med GFAP. Flertallet av CP (Tall 2C, D) og PDAC (Tall 2G, H) stromale celler viste sterk intracellulær farging med VIM og αSMA. Den farging med desmin var intens i PDAC (figur 2F) prøver, men ikke-eksisterende i CP (figur 2B) prøver. Figur S3 i File S1 viser positiv farging med anti-proCOL11A1 mAb (skår 4) og desmin i en sak av autoimmun pankreatitt; i tillegg er intens positivitet med VIM og αSMA, og negativitet med GFAP observert.
stromale celler i CP var negative for anti-proCOL11A1 mAb (A) og desmin (B), mens et betydelig antall av stromale celler av PDAC uttrykte anti-proCOL11A1 mAb (E) og desmin (F). I CP og PDAC flekken av stromale celler for αSMA (C og G, respektivt) og VIM (D og henholdsvis H,) var diffuse og ikke-selektive. Anti-proCOL11A1 mAb (A og E), desmin (B og F), αSMA (C og G) og VIM (D og H) (alle photomicrographs på × 400, Scale bar 50 mikrometer).
Karakterisering av pankreas kafeer
for å karakterisere kafeer, bukspyttkjertelen vevssnitt var dobbelt farget for proCOL11A1 /desmin, proCOL11A1 /αSMA, proCOL11A1 /VIM, proCOL11A1 /GFAP, proCOL11A1 /CK7 og CK7 /VIM (figur 3 ). Et svært høyt antall mesenchymalceller var sterkt merket for VIM og αSMA. Farging med GFAP var negativ. Som en andel et lite antall celler ble proCOL11A1 + og desmin +. Co-farging av VIM eller CK7 med proCOL11A1 identifisert en undergruppe av kafeer med mesenchymale fenotype (proCOL11A1 + /VIM +) og svært få celler med epitelial fenotype (proCOL11A1 + /CK7 +) (figur 3 og E, henholdsvis). Noen desmin eller αSMA celler co-farget med proCOL11A1 (figur 3 A og henholdsvis B,). Men visste CP stroma prøvene ikke viser farging med proCOL11A1, desmin eller GFAP, og det var ingen co-farging (figur 4).
A, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. desmin (magenta); B, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. GFAP (ikke flekker); E, anti-proCOL11A1 (brun) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (epitelial tumorceller:
brun
) vs. VIM (magenta) (alle photomicrographs på × 200, Scale bar 200 mikrometer, innfelt X1000).
A, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. desmin (magenta); B, Anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (brun)
vs
. GFAP (ikke flekker); E, anti-proCOL11A1 (brun) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (epitelial tumorceller:
brun
) vs. VIM (magenta) (alle photomicrographs på × 200, Scale bar 200 mikrometer).. .
Celle fordeling av kultur kafeer ble analysert ved colocalization med immunocytofluorescence. De resulterende data er vist i tabell 2 (figur 5). Tolkningen av tabellen er som følger: når en dobbel farging ble påført på de dyrkede pankreatiske kafeer, for eksempel proCOL11A1 og CK7, totalt 188 celler ble farget; Av disse ble 82 cellene merket med anti-proCOL11A1, 60-celler ble CK7 positive, og 46 cellene ble farget med begge antistoffene. Den samme logikken gjelder for resten av stainings. Ifølge data vist i Tabell 2, blant proCOL11A1 celler, 36% er CK7 +, 49% er VIM + og 48% er αSMA +; blant celler med VIM fenotype, 21% er proCOL11A1 + og bare 8% er CK7 +; 33% av αSMA celler har proCOL11A1 fenotype; og til slutt 45% av cellene har CK7 VIM + fenotype og 43% har den proCOL11A1 fenotype. Fordelingen av proCOL11A1, CK7 og desmin fenotyper i vevsprøver er vist i tabell S2 i File S1. Det var ikke mulig å analysere de områdene hvor cellene er VIM + og αSMA + på grunn av det høye antallet fargede celler, noe som gjør det vanskelig å individualisere og telle dem. Ifølge data vist i Tabell S2 i File S1, 18% av proCOl11A1 cellene er CK7 +, og 21% er desmin +; 45% av disse cellene flekker med desmin har proCOL11A1 fenotype, og 50% av CK7 cellene er proCOL11A1.
ProCOL11A1 /CK7 (DI)
proCOL11A1 /VIM (DI)
proCOL11A1 /αSMA (DI)
VIM /CK7 (DI)
proCOL11A1 + bare 82 (43%) proCOL11A1 + bare 106 (18%) proCOL11A1 + bare 73 (23%) VIM + bare 364 (85%) CK7 + bare 60 (32%) VIM + bare 370 ( 64%) αSMA + bare 138 (50%) CK7 + kun 36 (8%) proCOL11A1 + /CK7 + 46 (25%) proCOL11A1 + /VIM + 101 (18%) proCOL11A1 + /αSMA + 67 (24%) VIM + /CK7 + 30 (7%) Totalt 188 (100%) Totalt 577 (100%) Totalt 278 (100%) Totalt 430 (100%) Tabell 2. Kvantitativ analyse av cellefordeling i dyrkede peritumoral kreft i bukspyttkjertelen fibroblaster (passasje 3)
*. *
en pasientprøve, verdivurdering på fem felt for hver dobbel farging (DI) eksperiment. Celler farget med både Ab i fet. CSV Last ned CSV
Double fluorescens flekken viser tilstedeværelse av celler proCOL11A1 + /CK7 +, proCOL11A1 + /αSMA + og proCOL11A1 + /VIM +.
Red
: proCOL11A1;
grønn
: CK7, αSMA og VIM, henholdsvis;
Blå
: kjerner. Innfellinger: tilfeldig tatt høy effekt innen kultur. Scale bar 100 mikrometer (X200) og 20 mikrometer (X630).
PDAC vs. CP
Egenskapene til hver pasient og hans /hennes patolog er proCOL11A1 farging poengsum er vist i tabell S3 i File S1. Det var en statistisk signifikant forskjell mellom PDAC og kronisk pankreatitt i mAb score (gjennomsnitt ± SD: 7,33 ± 4,04 vs. 0,61 ± 1,33; P 0,0001). Dataene er vist i figur 6. Det AUC av ROC-kurver PDAC lignet med CP var 0,936 (0,851 til 0,981), P 0,0001 (figur 7). Den farging viste en sensitivitet på 92% og en spesifisitet på 83% i diskriminerende PDAC fra CP, med en nøyaktighet på 90%. Bruken av pAb viste et lignende resultat diskriminerende PDAC fra CP (tabell S4 i File S1). Observasjons samsvar mellom patologer var 90%. Farging poengsum korrelerte ikke til pasientens alder, kjønn, tumorstadium eller klasse. Foreningen med pasienten total overlevelse ble ikke undersøkt fordi antall PDAC pasienter med lav poengsum var svært lav (4/51 tilfeller)
Barer:.. ± 1 SD
μ angir skjæringspunktet med den beste separasjon (minimal falske negative og falske positive resultater) mellom de to gruppene.
Farging ble også vurdert ved hjelp av QWin bildeanalyse programvare. Resultatene er vist i tabell S5 i File S1. Det er en statistisk forskjell mellom PDAC og CP i antallet positive celler i den beisede overflate og i det referanseområde. Innenfor den samme serie, var det en høy samsvar mellom patologen skår, og QWin data som overflatearealet av de fargede celler og antallet positive celler (Spearmans rang korrelasjonskoeffisient = 0,825 og 0,825, respektivt). ROC kurven AUC-data ble oppnådd for de seks bildeanalyseparametere (tabell S6 i File S1). Alle parametre tillate forskjellsbehandling mellom PDAC og kronisk pankreatitt. De mest relevante parametre var antallet positive celler og overflatearealet av de fargede cellene.
diskusjon
DNA mikromatriser tillate samtidig analyse av ekspresjonsnivået av tusener av gener og kunne klargjøre mekanismene av bukspyttkjertelkreft [26-31]. Den første studien å bruke denne teknikken til kreft i bukspyttkjertelen vellykket identifisert et sett av gener som er forskjellig uttrykt i bukspyttkjertelkreft [32]. Andre studier har ført til identifisering av begge de tidligere beskrevne og nye kandidatgener [33-39,50]. De fleste av de genene som er identifisert kan ikke valideres av andre mer nøyaktige teknikker på enten mRNA eller protein nivå. Vi har fokusert våre studier på disse genene med potensiell interesse som markører og /eller terapeutiske mål [23], hvorav den ene er COL11A1.
I denne rapporten bekrefter vi immunhistokjemisk uttrykk for COL11A1 i PDAC. Tidligere observasjoner på uttrykk for COL11A1 i andre kreftformer [40-44] var begrenset til differensial genuttrykk analyser validert av kvantitative RT-PCR, Northern blot og /eller in situ mRNA hybridisering. Nylig har uttrykket av kollagen XI i både normal og ondartet menneskelig kolon vev er vurdert av immunhistokjemi [45].
En matematisk analyse av genuttrykk i flere kreft [46] viser at overekspresjon av COL11A1 og andre gener er en høy spesifisitet biomarkør for kreftinvasjon og forutsier respons på neoadjuvant terapi. Den nedregulering av COL11A1 i in vitro-ko-kulturer av kreft i bukspyttkjertelen og stromale celler [47] er blitt rapportert. Disse in vitro observasjonene støttes ikke av ex vivo data; den kunstige in vitro forholdene ikke oppfylte alle krav og heller ikke råd til alle de lokale faktorer som bidrar til høy COL11A1 uttrykk.
Så vidt vi vet, har ingen spesifikk markør for kafeer blitt rapportert. Konvensjonell farging viste ikke forskjeller mellom kafeer og normale fibroblaster.
