Abstract
Aberrant DNA metylering har blitt observert i livmorhalskreft; Imidlertid har de fleste studier brukt ikke-kvantitative tilnærminger for å måle DNA metylering. Målet med denne studien var å kvantifisere metylering innenfor en utvalgt panel av gener som tidligere er identifisert som mål for epigenetisk stanse i livmorhalskreft, og for å identifisere gener med forhøyet metylering som kan skille kreft fra normale cervical vev. Vi identifiserte 49 kvinner med invasiv plateepitelkreft i livmorhalsen og 22 kvinner med normal cytologi prøver. Bisulfite-modifisert genomisk DNA ble forsterket og kvantitativ pyrosekvensering gjennomført i 10 gener (
APC
,
CCNA
,
CDH1
,
CDH13
,
WIF1
,
TIMP3
,
DAPK1
,
R R
,
FHIT
, og
SLIT2
). En Metylering indeksen ble beregnet som gjennomsnittet prosent metylering tvers av alle CpG sider analysert per genet (~ 4-9 CpG stedet) per sekvens. En binær cut-point ble definert ved 15% metylering. Følsomhet, spesifisitet og arealet under ROC-kurven (AUC) av metylering i enkeltgener eller et panel ble undersøkt. Median Metyleringen Indeksen var betydelig høyere i de tilfeller sammenlignet med kontroller i 8 gener, mens det ikke var noen forskjell i median-metylering for 2 gener. Sammenlignet med HPV og alder, kombinasjonen av DNA metylering nivå av
DAPK1
,
SLIT2
,
WIF1 Hotell og
R R
med HPV og alder betydelig forbedret AUC 0,79 til 0,99 (95% KI: 0,97 til 1,00,
p-verdi
= 0,003). Pyrosekvensering analyse bekreftet at flere gener er felles mål for avvikende metylering i livmorhalskreft og DNA metylering nivå på fire genene synes å øke spesifisiteten til å identifisere kreft i forhold til HPV deteksjon alene. Endringer i DNA metylering av spesifikke gener i livmorhalskreft, som for eksempel
DAPK1
,
R R
,
WIF1
, og
SLIT2
, kan også forekomme tidlig livmorhalskreftutvikling og bør evalueres
Citation. Siegel EM, Riggs BM, Delmas AL, Koch A, Hakam A, Brown KD (2015) Kvantitativ DNA Metylering Analyse av kandidatgener i livmorhalskreft. PLoS ONE 10 (3): e0122495. doi: 10,1371 /journal.pone.0122495
Academic Redaktør: Osman El-Maarri, Universitetet i Bonn, Institut for eksperimentell hematologi og transfusjonsmedisin, TYSKLAND
mottatt: 26 juni 2014; Godkjent: 22 februar 2015; Publisert: 31 mars 2015
Copyright: © 2015 Siegel et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Dataene som ligger til grunn funnene i denne studien vil være tilgjengelig på forespørsel og ikke gjort fritt tilgjengelig i et offentlig register. Dataene kan ikke gjøres offentlig tilgjengelig på grunn av begrensninger av vår IRB godkjennelse, inkludert den lille størrelsen på utvalget som kan redusere pasientens anonymitet og inkludering av PHI innenfor datasettet i evalueringen av pasientens utfall. De endelige datasettet og rå pyrograms er tilgjengelig på forespørsel til følgende: Moffitt Cancer Center Informasjon Shared Services Department ([email protected]) eller følgende studie Principal Investigators: Erin M. Siegel (hjelperen Medlem Department of Cancer Epidemiology Moffitt kreftsenter 12902 Magnolia Drive, Tampa, FL 33612) E-post: [email protected], Kevin D. Brown (Førsteamanuensis Institutt for biokjemi og molekylærbiologi University of Florida College of Medicine Gainesville, FL 32610) E-post: [email protected] ( 352) 273-5458
Finansiering:. Støtte for denne studien ble gitt av en University of Florida-Moffitt Collaborative Grant (UF09060) og National Cancer Institute 1RO3 CA143980-01 tilskudd til EMS og KDB. Dette arbeidet ble støttet delvis av vevet Kjerne Facility og the Collaborative Data Services Kjerne Facility på H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, en NCI utpekt Comprehensive Cancer Center under stipend antall P30-CA76292. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetisk genet Slå via tett DNA metylering innen CpG øyer har vist seg å forekomme i mange tumortyper, inkludert humant papillomavirus (HPV) -associated livmorhalskreft [1]. Tumorsuppressorgener (TSGs) som er av klar betydning i patogenesen av kreft i livmorhalsen er vanlig mål for genet Slå i denne sykdommen [2,3]. Identifiseringen av et panel av abnorme metylerte TSGs som representerer et bredt spekter av svulst undertrykkende funksjoner (
i
.
e
., Cellesignalering, gentranskripsjon, cellesyklus, apoptose, og celle adhesjon ) har store løftet for å gi et kraftig sett med DNA metylering biomarkører for bruk i sykdom diagnose og /eller prognose [4].
gener som koder for flere viktige regulatorer av onkogene Wnt /β-catenin veien, for eksempel
CDH1 product: (E-cadherin),
APC
, og
WIF1
, blir ofte brakt til taushet gjennom tett metylering av sine promoter regioner i livmorhalskreft [5]. For eksempel
CDH1
genet hypermethylation har blitt observert i de fleste primære livmorsvulster og et betydelig antall høygradig cervikal intraepitelial neoplasi-3 (CIN3), noe som tyder på at epigenetisk status for dette genet har en potensiell programmet som en biomarkør for livmorhalskreft [6]. Andre gener velig hypermethylated i livmorhalskreft med liten eller ingen metylering i normale eller lavgradige CINS inkluderer
DAPK1 product: [7,8],
R R product: [8,9],
TIMP3 product: [10], CCNA [11] og
FHIT product: [7]. Men det har vært uoverensstemmelser i den rapporterte forekomsten av DNA hypermethylation av flere TSG innenfor livmorhalskreft [2,12], som kan skyldes bruk av ikke-kvantitative metoder for å oppdage metylering.
Til dags dato, flertallet av studier som undersøker epigenetiske Silencing hendelser i livmorhalskreft har stolt på semi-kvantitative eller kvalitative metoder å score genet metylering [2], som metylering spesifikk PCR (MSP) eller semi-kvantitativ MSP (QMSP) [13]. Imidlertid har disse analysene er rapportert å overvurdere forekomsten av avvikende metylering av en eller annen markør loci, spesielt i heterogene populasjoner av DNA [4]. Innenfor det siste tiåret, har sulfitt pyrosekvensering dukket opp som en kvantitativ metode for måling av DNA metylering ved enkelte CpG steder innenfor en populasjon av DNA-molekyler [14,15]. Pyrosekvensering kan brukes med en rekke biologiske prøver (
i
.
e
. Formalinfiksert parafin-embedded (FFPE), fryste, vev skraper,
etc
. ), noe som gjør denne tilnærmingen mottagelig for bruk i klinisk setting [4]. Hittil har det vært svært få undersøkelser av DNA-metylering i livmorhalskreft ved hjelp av denne svært nøyaktig, kvantitativ analyse [16].
For denne studien valgte vi et sett med 10 TSGs (
APC
,
CCNA
,
CDH1
,
CDH13
,
DAPK1
,
FHIT
,
R R
,
SLIT2
,
TIMP3
,
og WIF1
) som, basert på en undersøkelse av litteraturen, hadde tidligere vist seg å være mål for avvikende DNA metylering i livmorhalskreft, men ikke grundig testet ved hjelp av kvantitative metoder. Videre genproduktene fungere på tvers av ulike biologiske reaksjonsveier, som hver for seg har vist seg å påvirke HPV-assosiert cervikal karsinogenese [2]. Disse genene ble utsatt for pyrosekvensering analyse i prøver av plateepitelkarsinom (SCC) i livmorhalsen og normale i livmorhalsen. Målet med denne studien var å identifisere genet metylering hendelser for å skille kreft fra normale i livmorhalsen som kan til slutt bli lagt til standard diagnostiske tester for livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Pasientvalg og data
Ved hjelp av en case-control design, identifiserte vi 49 kvinner med invasiv SCC kreft som ble frekvensen matchet på alder og etnisitet til kvinner med normal cytologi prøver (kontroller). Tilfeller ble inkludert hvis de hadde (1) et kirurgisk inngrep mellom 1991 og 2006 på Moffitt Cancer Center, (2) arkivert FFPE- tumorvev, og (3) ingen strålebehandling før operasjonen. For kontroller, samlet vi normale livmorhalsen fra kvinner med normal cytologi og en høy sannsynlighet for å være HPV positive. I korte trekk, væske basert cytologi (LBC) prøver (N = 22) ble samlet inn fra kvinner som samtykket til å delta i vår studie under en klinikk besøk på enten en høy-risiko seksuelt overført sykdom klinikk på Hillsborough County Health Department eller en kolposkopi klinikk på Tampa General Hospital, Tampa, Fl. Vi har også undersøkt et sett med normal cervical formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) kvartaler fra kvinner arkivert fra kvinner som ble diagnostisert med enten godartet bløtvev livmor leiomyoma (N = 15) for å undersøke metylering nivåer over av vev konserveringsmetoder (LBC vs. FFPE). Alle vev ble patologisk eller cytologisk omgås og eventuelt tumorstadium, klasse, og histologisk diagnose bekreftet. Clinicopathological og resultatdata ble innhentet fra Moffitt Kreftregisteret.
Etikk erklæringen
Alle studieaktiviteter og samtykkeprosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board ved University of South Florida (IRB # 102998) . FFPE- vevsblokker fra saker og kontroller ble samlet inn som en del av klinisk arbeid. En frafallelse av informert samtykke ble godkjent for bruk av avidentifiserte arkivert vev fra kvinner som ikke gir samtykke ved University of South Florida IRB. Det var ikke mulig å innhente samtykke til å utnytte de gjenværende eksemplarer identifisert for denne studien, som var alle minst 5 år gammel da oppnådd. Kvinner gitt skriftlig informert samtykke på IRB samtykkeskjema som er godkjent for innsamling av væskebasert cytologi prøver (N = 22).
DNA Isolering og Utvinning
FFPE- vev ble macrodissected fra tre 10 mm tykke seksjoner og DNA hentet ved hjelp av Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Valencia, CA) i henhold til produsentens protokoll. For LBC prøver, en delmengde av 1-4 ml av PreservCyt ble sentrifugert og DNA ekstrahert fra pelleterte cellene ved hjelp av Qiagen QIAmp DNA Mini Kit (Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en NanoDrop1000 spektrofotometer (Wilmington, DE).
HPV DNA Detection og Typing
INNO-Lipa HPV Genotyping Extra AMP (Innogenetics, Belgia) ble utført for å forsterke en 65 -bp fragment med SPF
10 PCR primer angitt i henhold til produsentens instruksjoner. SFP
10 amplimers fra HPV-positive prøvene ble deretter analysert ved revers hybridisering på HPV reversere hybridisering linjen probe assay (LIPA). LIPA analysen oppdager 13 kreftfremkallende (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, og -68), 3 sannsynligvis kreftfremkallende (HPV-53, -66, og -70) og 9 ikke-kreftfremkallende HPV-typer (HPV-6, -11, -34, -40, -42, -43, -44, -54, og -74) [17]. Positive og negative kontroller inkludert DNA fra HeLa cellelinjer, vann og den positive kontrollutvalget følger med i pakken.
pyrosekvensering
Natriumbisulfitt konvertering av genomisk DNA (10 ug) ble utført ved hjelp av EZ DNA Metylering -Direkte kit (Zymo Research, Orange, CA) i henhold til produsentens anbefalinger. Kvantitativ DNA-metylering analyse ble gjennomført ved pyrosekvensering som tidligere beskrevet [18]. Segmenter av genene ble amplifisert fra bisulfitt-omdannet DNA ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere som er angitt i tabell S1. For isolasjon av enkeltkjedet fragment, ble den reverse primeren anvendt i alle PCR-reaksjonene syntetisert med et biotin rest ved 5′-terminus. I korte trekk, ble PCR utført i et 30 mL reaksjon volum, som inneholdt 1 mL av sulfitt-modifiserte DNA mal, PyroMark PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), Coral Load konsentrat, 25 mM MgCl
2 ( for SLIT2), 10 pM av hver av genspesifikke forover og revers primer. Termocykling ble utført ved å bruke de følgende generelle betingelser: 95 ° C i 15 minutter, etterfulgt av 50 sykluser ved 95 ° C i 30 sek, 47-55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 minutt og endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. Etter forsterkning, 5-20μl av PCR-produktet ble blandet med streptavidin-konjugert sepharosekuler (GE Healthcare) i bindingsbuffer (Qiagen, Germantown, MD) og fortynnet til 60-80μl totale volumet med dH
2o. Kulene ble deretter oppsamlet ved anvendelse av en vakuum preparat arbeidsstasjon, sekvenseringsprimeren (S1 tabell) tilsatt og oppvarmet til 80 ° C i 2 min. Sekvensering primer hybridisert til biotinylerte DNA-tråden som ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur. Prøvene ble pyrosequenced bruker en PyroMark MD system og CpG metylering målt ved hjelp PyroMark CpG programvare. All pyrosekvensering ble utført i gjennomsnitt på to uavhengige PCR reaksjoner. Kontroller inkluderes pyrosekvensering analyse av universelt metylert humant genomisk DNA (CpGenome DNA, Millipore, Billerica, Massachusetts), unmethylated humant genomisk DNA (human sperm-DNA), og ingen DNA-templatet tilsettes til pyrosekvensering reaksjonen.
Statistisk analyse
Forskjeller mellom case og kontroll egenskaper ble testet ved hjelp av Pearsons Chi
2, Fishers «Exact eller Students» T-test. En Metylering Indeks (MI) ble beregnet som den gjennomsnittlige prosentvise metylering på tvers av alle CpG sider analysert pr gensekvens (~ 4-9 CpG området). Spearmen rang korrelasjonskoeffisient med Bonferoni korrigert
p-verdi
ble brukt til å avgjøre om MI ble korrelert mellom gener. Forskjeller i MI mellom saker og kontroller, generelle og stratifisert etter alder (. 44 år vs. ≥ 44 år) og HPV status (positiv vs negativ), ble bestemt med Mann-Whitney test. Følsomhet, spesifisitet og nøyaktighet [arealet under kurven (AUC)] av MI for å differensiere tilfeller og kontroller ble undersøkt. Vi evaluerte den inkrementelle verdiskaping av DNA metylering nivå til prediksjonsmodeller som inkluderte kjente risikofaktorer for livmorhalskreft, alder (kontinuerlig) og HPV positivitet (alle typer vs. ingen) benytter metoden Janes
et al
. [19]. Først ble logistisk regresjonsanalyse passe med og uten metylering variablene; tilhørende predikerte verdier for alle fag innenfor datasettet er beregnet fra hver modell og plottet. Vi testet likestilling av to ROC kurver ved hjelp av Stata roccomp kommandoen (Stata v12.0) [20]. Binære cut-poeng for å klassifisere et gen som metylert ble definert ved hjelp av en
a priori
cut-point of MI 15%. Kriterier for inkludering i DNA metylering gen panel var: (1) signifikante MI forskjeller mellom saker og kontroller; (2) MI ble ikke signifikant korrelert på tvers av gener (Rho 0,65); hvis Rho≥0.65, var bare ett gen inkludert; og (3) AUC 0,60 for MI . 15% for å skille saker fra kontrollene
Blant tilfellene vurderte vi sammenhengen mellom metylering (gener eller genet panel) og sykdomsfri (DFS) og total overlevelse ( OS). DFS ble definert som tiden fra diagnose til første tilbakefall, andre svulst eller død på grunn av livmorhalskreft og OS som tiden fra diagnose til dato for død. Kaplan-Meier overlevelsesestimater og multivariable Cox regresjonsmodeller undersøkt forbindelse med DFS og OS, kontrollerende for kjente prognostiske faktorer (f.eks lokalt avansert stadium (≥Stage IIB2), klasse, alder, behandling og HPV). En p-verdi på 0,05 (to-sidig) ble betraktet som signifikant. Alle analyser ble utført ved bruk av Stata /MP Versjon 12.1 (StataCorp LP, College Station, TX, USA).
Resultater
Kjennetegn på saker (N = 49) og kontroller (N = 22) er presentert i Tabell 1. gjennomsnitts~~POS=TRUNC alderen~~POS=HEADCOMP av tilfellene var litt høyere enn kontrollene (47 ± 15 år
vs
43 ± 16 år, henholdsvis.); men dette var ikke en signifikant forskjell (
p-verdi
= 0,32). HPV DNA ble påvist hos 96% (47/49) av tilfellene og 55% (11/22) av kontroller (
p-verdi
0,0001). Blant tilfeller er 88% av tumorene ble HPV-16 eller -18 positive sammenlignet med 14% av kontrollene. Femtien prosent av tilfellene hadde et tidlig stadium diagnose (Stage IA1 /1B1), mens 41% hadde lokalavansert sykdom (stadium 1B2 eller høyere).
Kvantitativ DNA Metylering analyse
DNA metylering i
APC
,
CCNA
,
CDH1
,
CDH13
,
DAPK1
,
FHIT
,
R R
,
SLIT2
,
TIMP3
,
og WIF1
gener, som hver har tidligere vist seg å være et mål for avvikende DNA metylering i livmorhalskreft [2], ble kvantifisert ved pyrosekvensering. Denne metodikken kvantifiserer, på en målrettet genomisk region av 30-50bp, prosent metylering ved enkelte CpG steder innenfor en populasjon av DNA-molekyler. Tett cytosin metylering innenfor CpG øyer, og mer spesifikt i umiddelbar nærhet av transkripsjonsstartsetet (TSS), er forbundet med hindret montering av basaltranskripsjonelle maskiner inne i kjernen promoter som resulterer i blokkerte transkripsjonsstart og genet Slå [21]. Således ble pyrosekvensering analyser utviklet av vår gruppe konstruert for å måle cytosin metylering ved, eller nær, den TSS (figur 1). Begrensninger som nukleotidsekvensen av det område som skal analyseres og tekniske aspekter av analysen (
i
.
e
., Forsterkning /sekvenseringsprimere må ikke inneholde CpG-dinukleotider, effektive og spesifikke PCR forsterkning,
etc
.) til slutt påvirket regionen analysert for hvert gen i vårt panel. Alle analyser pyrosekvensering brukt i denne studien ble utviklet av vår gruppe, og har ikke tidligere blitt beskrevet med unntak av en kommersielt tilgjengelig assay for
DAPK1
. Figur 1 illustrerer genet arkitektur (
i
.
e
., Plassering og størrelse av CpG island, region og antall CpG dinukleotider analysert) og gir et representativt pyrogram for hvert gen indikerer prosent metylering av hver CpG dinucleotide undersøkt. DNA metylering indeks (MI) ble beregnet som gjennomsnittet metylering tvers av alle CpG områder innen regionen sekvensert ved pyrosekvensering.
Illustrated er genomisk arkitektur hvert locus undersøkt i denne studien. Inkludert er den relative plasseringen av exon 1, transkripsjonsstartsetet (TSS), assosiert CpG island, og regionen analysert for metylering av pyrosekvensering. Det er også vist en representant pyrogram og målt cytosin metylering ved hver CpG dinucleotide analysert i designet pyrosekvensering analysen. Gener analyseres er
APC product: (A),
CDH1 plakater (B),
CCNA product: (C),
CDH13 product: (D),
FHIT product: (E);
R R product: (F);
SLIT2 product: (G);
TIMP3 product: (H);
WIF1 product: (I) og
DAPK1 product: (J).
Generelt fant vi alle pyrosekvensering analyser for å gjøre det bra, med lave analysefeilrater, høy intra-klasse korrelasjonskoeffisienter (ICC), og gjennomgående høye metylering nivåer for positive kontroller. Vi observerte svært lav feilfrekvens (≤1%) for analyser med PCR amplikonene 190 bps i størrelse. Unntaket ble designet
TIMP3
analyse der vi fant en ~ 6% strykprosent for å forsterke den målrettede regionen og en ~ 8% strykprosent for å oppnå pyrosekvensering data av tilstrekkelig kvalitet. APC, som hadde et amplikon størrelse på 194 bps, hadde også en feilrate for å forsterke den målrettede delen av ~ 6%; men alle amplikonene generert høy kvalitet pyrosekvensering av data. Vi har innhentet data av høy kvalitet fra ≥90% av pasientprøver, med bare ett eksempel på ekskludert på grunn av mangelfull DNA for forsterkning. ICC for pyrosekvensering analysene var 0,94 for alle gener unntatt FHIT (ICC = 0,69) som hadde lavt innenfor og mellom-person variasjon (1,41 og 2,11, henholdsvis). Til slutt, den positive kontroll for fullt metylert DNA ble metylert gjennomgående på tvers av alle pyrosekvensering analyser og partier (gjennomsnitt ± SD = 90 ± 6%). I tilfelle av
CCNA
, vår studie omfatter analyse av 20 tilfeller og 22 kontroller (tabell 2), på grunn av utilstrekkelige mengder av DNA for å fullføre undersøkelsen av dette genet på alle prøver.
metylering nivåer over CpG områder innen et gen var relativt stabil som vist i S1 figur for
DAPK1
,
R R
,
og SLIT2
. Figur 2 viser fordelingen av MI (
i
.
e
., Median og interkvartilt område) for hvert gen undersøkt av pyrosekvensering. Median MI var signifikant høyere i DNA høstet fra SCC eksemplarer sammenlignet med DNA fra normal cytologi prøver i 8 av de 10 gener ble undersøkt (
DAPK1
,
R R
,
CCNA
,
SLIT2
,
WIF1
,
APC
,
CDH1
, og
FHIT
). Omvendt,
CDH13
, og
TIMP3
viste ingen signifikant forskjell i median MI mellom saker og kontroller. Tabell 2 viser en detaljert oversikt over MI for alle gener ved saksstatus. Blant kontroller, median MI var mindre enn 5% for alle gener unntatt
TIMP3 plakater (12,4%) og
SLIT2 plakater (7,1%) og metylering nivåer over 15% ble bare observert for to gener (
TIMP3 og CDH13)
. Blant saker, median MI var 10% for
DAPK1
,
CCNA
,
SLIT2
,
WIF1
,
og TIMP3
(tabell 2). Understreker den heterogene natur DNA metylering i kreftceller, målte vi et bredt spekter i MI for flere gener på tvers av alle tilfeller analysert. For eksempel, median
DAPK1
MI var 12% med en rekkevidde fra 1% til 96%. Vi testet for en potensiell sammenheng i metylering mellom gener og bare
SLIT2 Hotell og
CCNA
viste en signifikant korrelasjon (Rho = 0,68;
p-verdi
0,001).
Gener er pålagt av Mann-Whitney
p-verdi (
** p-verdi 0,0001 og * p-verdi 0,05). Metylering indeks (MI) til hvert gen er presentert for normal cervical prøve (N) og kreft (T) som en boksplott. Linjene til boxplot markere 5
th og 95
th persentiler, markerer boksen 25
th (lav grense på boks), median, og 75. (øvre grense av boksen) percentil, og ekstreme verdier (●).
Vi utforsket hvis DNA metylering nivåene varierte på bakgrunn av alder og HPV status. Overall, median
R R
,
CDH1
,
og CDH13
metylering var høyere blant kontroll kvinner ≥ 44 år (
p-verdi
= 0,02
p-verdi
= 0,01, og
p-verdi
= 0,04, henholdsvis). De betydelige forskjeller i median metylering mellom saker og kontroller ble opprettholdt da stratifisert etter alder ( 44 år eller ≥44 år) for
DAPK1
,
R R
,
CCNA og WIF; mens SLIT2
,
APC
,
CHD1 og FHIT var bare signifikant forskjellig blant yngre tilfeller og kontroller
(data ikke vist). Blant kontroller, DNA MI var lik blant HPV positive og HPV-negative kvinner. Videre, når begrense til HPV-positive saker og kontroller, fant vi svært like resultater for median forskjeller i metylering og sensitivitet /spesifisitet (data ikke vist).
metylering Levels Skille Saker fra Controls
Ved hjelp av en konservativ
a priori
terskel for MI 15% for å definere et gen som metylert,
DAPK1
genet ble klassifisert som metylert i 44% av tilfellene, og 0% i kontrollgruppen.
SLIT2 Hotell og
R R
ble metylert over 15% i 61% og 23% av tilfellene, henholdsvis, og ingen av kontrollene. Ved hjelp av MI 15%,
DAPK1
og
SLIT2
hadde 100% spesifisitet og 43% og 61% sensitivitet, henholdsvis (tabell 3). Alle bortsett fra to genene hadde høy spesifisitet (100%) med ingen kontroller klassifisert som metylert over 15% (
i
.
e
., Ingen falske positiver). Deretter undersøkte vi hvorvidt DNA MI målt i løpet av en kombinasjon av gener forbedret separasjon av gruppene. Panelet av gener ble valgt ved hjelp av
a priori
kriterier (se Materialer og metoder). Av de 8 gener med vesentlig høyere MI i tilfeller (1)
CCNA
ble ekskludert på grunn av signifikant korrelasjon med
SLIT2 Hotell og (2)
APC
,
CDH1 Hotell og
FHIT
ble ekskludert på grunn av lav AUC ( 0,60). De resterende gener (
DAPK1
,
R R
,
SLIT2 Hotell og
WIF1
) ble evaluert for sin evne til å identifisere livmorhalskrefttilfeller i forhold til HPV infeksjon og alder. Vi evaluerte den trinnvise verdien av å legge til DNA-metylering nivåer for å prediksjonsmodeller som inkluderte kjente risikofaktorer for livmorhalskreft, alder (kontinuerlig) og HPV status (positiv vs negativ) å benytte en metode Janes
et al
. [19,20]. ROC-modellen med noen HPV-infeksjon (ja vs. nei) og alder (kontinuerlig) hadde en anslått AUC på 0,79. Ved å bruke denne som en referanse, vi statistisk sammenlignet med den forutsagte AUC fra modellene som er lagt DNA MI for de fire genene, i alle kombinasjoner. Kombinasjonen av
DAPK1
,
SLIT2
,
WIF1 Hotell og
R R plakater (kontinuerlig) betydelig forbedret predikert AUC 0,79 til 0,98 (95% KI : 0,97 til 1,00,
p-verdi
= 0,002) (fig 3) for å identifisere tilfeller vs kontroller. Når du definerer positiv metylering som en MI 15%, kombinasjonen av
DAPK1
,
SLIT2
,
WIF1 Hotell og
R R plakater (ingen
vs
1-4 gener 15% denaturert) hadde høyest sensitivitet (90%) og spesifisitet (100%), med AUC på 0,95 (95% KI: 0,91 til 0,99)
ROC av forventet sensitivitet og 1-spesifisitet når DNA MI for
DAPK1
,
R R
,
SLIT2 Hotell og
WIF1
gener ble satt til en modell med HPV status og alder. Testen av likestilling mellom AUC for HPV og alder (AUC = 79%, stiplet linje) sammenlignet med metylering indeks for
DAPK1
,
R R
,
SLIT2 Hotell og
WIF1
, HPV, og alder (AUC = 98%, heltrukket linje),
p-verdi
= 0,0002.
Gene metylering, tumor Kjennetegn og pasient Survival
livmorhalskreft tilfeller ble diagnostisert mellom 1993 og 2001 med en median oppfølgingstid på 5 år (2,4 mnd-17 år).
TIMP3
ble klassifisert som abnormt metylert ( 15%) oftere i dårlig differensiert svulster sammenlignet med de godt til moderat differensiert (63% vs. 8%;
p-verdi
= 0.004).
DAPK1
ble oftere metylert (MI 15) i lokalavansert tumor (stadium 2B2) (65% vs. 22%,
p-verdi
= 0,007). Det var en trend for høyere
DAPK1
metylering i svulster som dukket distalt (median MI = 36%) sammenlignet med de som aldri dukket opp igjen (median MI = 13%) eller dukket opp igjen lokalt (median MI = 5%) (
p-verdi
= 0,08). Median DFS og OS var 10,3 år og 8 år, henholdsvis. Det var ingen signifikant sammenheng mellom de enkelte genet metylering eller definert panel av gener (
DAPK1
,
SLIT2
,
WIF1 Hotell og
R R
) og DFS eller OS (data ikke vist).
Diskusjoner
Denne studien brukte kvantitative pyrosekvensering for å måle nivået av DNA metylering innen 10 TSG i normale livmorhals og livmorhalskreft prøver. Siden introduksjonen, har denne teknikken stadig fått favør som en foretrukket verktøy for å måle DNA metylering [14]. Flere studier har evaluert både nøyaktighet og presisjon av pyrosekvensering for analyse av DNA-metylering i heterogene blandinger av DNA. Ved hjelp av definerte prosenter av denaturert og unmethylated DNA, Murphy
et al
. [22] målt jevnt høye Pearson korrelasjonskoeffisienter (R
2 0,99) når korrelasjon målt
vs
. beregnet DNA-metylering innenfor et panel av gener. Fra disse og andre lignende studier [23,24], har pyrosekvensering konsekvent vist seg å måle CpG metylering innen heterogene blandinger av DNA. Reed
et al
. [23] iakttatt at når man måler DNA-metylering i blandinger inneholdende lav ( 10%) CpG metylering, pyrosekvensering vanligvis litt overvurdert DNA-metylering, som er i overensstemmelse med resultatene oppnådd av andre grupper [22,24]. For eksempel, vi målte metylering verdier fra 0 til 4% CpG metylering når unmethylated kontroll DNA-prøver (menneskelig sæd genomisk DNA) ble analysert for
APC
genet metylering (data ikke vist). Denne variasjonen i analysen av lave nivåer av DNA metylering, som er lik Kombinert Bisulfite restriksjonsanalyse (COBRA), bedt Colella
et al
. [14] for å foreslå minst en 10% metylering terskel bli anvendt for å erklære et gen som metylert. På grunn av denne bekymringen, benyttet vi en
a priori
nivå av . 15% for å klassifisere gener som metylert
Bruk av kvantitative metoder for å bestemme DNA-metylering nivåer er avgjørende for nøyaktig klassifisere metylering status. Ikke-og semi-kvantitative metoder som brukes for å vurdere DNA metylering tendens til å overvurdere metylering utbredelsen fører til et høyt antall falske positiver (
i
.
e
. Lav spesifisitet). Dette overestimering er tydelig ved det faktum at gener som tidligere er rapportert som metylert i livmorhalskreft ved bruk av ikke- eller semi-kvantitativ metode hadde svært lave nivåer av metylering, målt i pyrosekvensering assays som brukes i denne undersøkelsen (
i
.
e
. 10% metylering). For eksempel den gjennomsnittlige metylering frekvens rapportert for
CDH1 plakater (58%, range: 0-91%) [2] er høyere enn observert i denne studien, der ingen svulster ble metylert høyere enn 10%. Blant studiene som brukte semi-kvantitative metoder [6,10,25], Wisman
et al
. også rapportert ingen metylering av
CDH1
i SCC [25]. Shivapurkar
et al
. rapporterte en median prosent metylering som 3,65 (Range 0-53%); Men da de søkte felles QMSP cut-punkt når klassifisere et gen som metylert (PFM 0), 89% av svulster ble klassifisert som har
CDH1
metylert [6]. Dette understreker potensialet overvurdering av
CDH1
metylering frekvens i livmorhalskreft. Vi har observert at bare 7% tilfeller, og ingen av kontrollene hadde
APC
MI 15%, som er lik to studier som brukes til å måle QMSP
APC
metylering [25,26] og skiller seg fra Yang
et al
. som rapporterte at 63% av livmorhalskreft ble metylert [9]. Hyppigheten av DNA metylering rapportert for
FHIT
hjelp MSP var 39% (Range 8% -80%) [7,27-29]; Men i likhet med våre funn, Wisman
et al
. rapporterte et fravær av
FHIT
metylering i SCC hjelp QMSP [25].
CDH13
metylering av QMSP har blitt rapportert å forekomme i 40% og 82% av svulster [2], som skiller seg fra våre funn av 6% av svulster med MI over 15%.
pyrosekvensering analyse bekreftet tidligere studier som indikerer at
DAPK1
,
SLIT2
,
WIF1 Hotell og
R R
gener er felles mål for avvikende metylering i livmorhalskreft [8, 9,25,27-32].
DAPK1
genet koder for et calmodulin-avhengige serin-treonin kinase som er en positiv formidler av gamma-interferon indusert celledød [33] og
DAPK1
lyddemping er tenkt å produsere en apoptose-resistente /pro-overlevelse fenotype [34]. Interessant, fant vi at
DAPK1
metylering var en av de beste samlede prediktorer for livmorhalskreft.
