Abstract
Bakgrunn
utvikling og progresjon av tykk- og endetarmskreft (CRC) innebærer en kompleks prosess av flere genetiske endringer. Tumor suppressor p53 er i stand til å bestemme skjebnen til CRC-celler. Imidlertid er rollen til en p53-induserbar modulator, ribosomalt protein S27-lignende (RPS27L), i CRC ukjent.
Metoder
Her ble differensial uttrykk for RPS27L undersøkt i avføringen og colonic vev av CRC pasienter, for å utforske dens mulig sammenheng med pasientens overlevelse og for å undersøke de cellulære mekanismene bak deres kliniske utfall. Åtti mellom-trinns CRC pasienter (42 i stadium II og 38 ved stadium III) ble delt i to grupper etter deres fecal RPS27L mRNA nivåer. De overlevelsessannsynlighet av gruppene ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Den RPS27L protein i colonic vev av stadium III pasienter med ulike prognoser ble videre undersøkt immunohistochemically. RPS27L uttrykk i LoVo celler ble manipulert til å undersøke mulige cellulære responser in vitro.
Resultater
Forhøyet RPS27L uttrykk, enten avføring eller vev, var relatert til en bedre prognose. In vitro, RPS27L-uttrykke LoVo celler opphørt DNA syntese og apoptotisk aktivitet mens uttrykk for sine DNA-reparasjon molekyler ble oppregulert.
Konklusjoner
Forhøyet RPS27L kan forbedre prognosene for visse CRC pasienter ved å styrke DNA-reparasjon kapasitet på sine colonic celler, og kan bestemmes i feces. Ved å integrere kliniske, molekylære og cellulære data, vår studie viser at avføring RPS27L kan være en nyttig indeks for å forutsi prognoser og guiding personlige terapeutiske strategier, spesielt hos pasienter med mellomtrinns CRC
Citation. Huang CJ, Yang SH, Lee CL, Cheng YC, Tai SY, Chien CC (2013) Ribosomalt Protein S27-Like i tykktarmskreft: en kandidat for å forutsi Prognoser. PLoS ONE 8 (6): e67043. doi: 10,1371 /journal.pone.0067043
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada og University of Ottawa, Canada
mottatt: 30 januar 2013; Godkjent: 13 mai 2013; Publisert: 24 juni 2013
Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NSC96-2320-B-281-001-My3 og NSC100-2320-B-281-001 fra National Science Council, og CGH-MR-9919 fra Cathay General Hospital. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utvikling og progresjon av tykktarmskreft (CRC), en av de mest vanlige dødskreftformer, innebære en kompleks prosess av flere genetiske endringer [1], [2]. Kirurgi er den optimale behandling for CRC pasienter ved trinn II og III, men adjuvant kjemoterapi har forbedret prognose for noen av disse mellomtrinns-pasienter [3]. Imidlertid, til tross for behandling, opp til 25% av pasientene i trinn II og 30-40% i trinn III utvikle en fjern metastase eller lokalt tilbakefall [4]. Molekylære markører for CRC kan brukes til å forbedre beslutninger angående adjuvant kjemoterapi hos disse pasientene [5], men er fortsatt kontroversiell [3].
Når cellene møter påkjenninger, er i stand til å bestemme sin skjebne ved tumor suppressor p53 å lette reparasjon og overlevelse av skadede celler eller ved å fjerne alvorlig skadede celler [6]. CRC tumorigenesis har lenge vært knyttet til funksjonell tap av p53 og påfølgende endringer i uttrykket av p53 responsive gener [7]. Den mest studerte av disse p53-responsive virkninger er reparasjon av skadet DNA, som antas å være en viktig bidragsyter til tumorprogresjon [8]. Påvisning av endringer i uttrykket av p53-responsive gener har blitt foreslått å tillate identifisering av pasienter med høy risiko for tilbakefall og de som bør vurderes for adjuvant kjemoterapi [9].
En gruppe av ribosomale proteiner med klinisk betydning for mange humane kreftformer har blitt identifisert, og genene som koder for de fleste av disse reagerer på p53 [10], [11]. Faktisk, i tillegg til sin rolle ved sammenstilling med rRNA for å konstruere ribosomer for ny proteinsyntese, er ribosomale proteiner kjent for å ha mange extraribosomal roller [12] – [14]. En av de ribosomale proteiner, ribosomalt protein S27-lignende (RPS27L), ble rapportert å være nedregulert i avføring og tumorvev av noen sent stadium CRC pasienter [15], [16]. Dette ribosomalt protein og dens homologe proteiner, RPS27, har vært ansett for å ha utvidet roller i cellevekstregulering og DNA-reparasjon [17], [18]. I tillegg har RPS27L blitt identifisert som en p53-induserbar modulator av celle skjebne [19], [20]. Derfor undersøkte vi den kliniske betydningen og cellulære effekter av RPS27L uttrykk og de mulige mekanismene bak sitt engasjement i de kliniske resultatene av CRC.
Vi brukte kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) for å kvantifisere heterogenitet av fekal RPS27L nivåer i mellomtrinns CRC pasienter, og differensial uttrykk for RPS27L var korrelert med deres kliniske utfall. RPS27L ekspresjon i LoVo-celler med vill-type p53 ble manipulert for å undersøke de mulige cellulære responser in vitro, ved å analysere endringer i celle faser, deres apoptotiske funksjoner, og DNA-reparasjon.
Materialer og Metoder
fecal og vevsprøver
Solide fekale prøver fra 80 sporadiske CRC pasienter (42 i stadium II og 38 ved stadium III), som oppnås ved Cathay General Hospital eller Taipei Veterans General Hospital, ble samlet inn før kirurgi eller noen kjemoterapi. Fekal total RNA ble fremstilt i henhold til vår tidligere rapportert protokoll, ved hjelp av en RNA-ekstraksjon kit (bioman Scientific, Taipei, Taiwan) med noen modifikasjoner [21] (Methods S1). Cellen faser i vevsprøver CRC (n = 68) og pasientoverlevelsesdata (n = 71) ble kjøpt fra pasienter som fecal prøvene ble analysert. Ytterligere seks stadium III CRC-vev ble oppsamlet for immunhistokjemisk farging for å bestemme ekspresjon av p53 og RPS27L proteiner. Studien ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of Cathay General Hospital. De etiske komiteer, Institutional Review Board of Cathay General Hospital, godkjent dette samtykke prosedyren. Alle deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien. Oppfølgingsdata ble innhentet prospektivt, og gjennomsnittlig oppfølgingstid var 39,0 måneder (SD 3,1, median, 28.3)
Lentivirus-baserte RNA interferens (RNAi) og Overuttrykte RPS27L
lentiviral partikler som genereres til taushet RPS27L (NM_015920) (pLK0.1-RPS27L, TRCN0000117608: GCCTAGTACAAAGTCCAAATT), for å dempe RPS27 (NM_001030) (pLK0.1-RPS27, TRCN0000117596: GAAGAGGAAACACAAGAAG), eller å overuttrykker RPS27L (pLKO AS3w. puro, inneholder RPS27L cDNA) ble hentet fra National RNAi Kjerne Facility plassert ved institutt for molekylær biologi /Genomisk Research Center, Academia Sinica, Taiwan. pLK0.1-Luc (TRCN0000072246) ble anvendt som kontroll. Forskjellige colonic cellelinjer ble infisert med lentivirus hverandre ved anvendelse av protokollen for RNAi kjernelager. I korthet, 8,5 x 10
5 colonic celler ble dyrket i en 10 cm plate i 24 timer, og deretter infisert med lentivirus ved en multiplisitet av infeksjon av 3. Stabile infiserte celler ble selektert og opprettholdt i medium inneholdende 2 ug /ml puromycin (Invitrogen, Carlsbad, California). Endringer i uttrykket av målgener ble bestemt med QRT-PCR eller immunoblotting (Metoder s1).
apoptose analysen
Etter 24 timer før VP16 (også kjent som etoposid eller VP-16 -213; en topoisomerase II-inhibitor) behandling ble cellene sådd ut i 16-brønners kammerobjektglass ved en densitet på 5 x 10
3-celler per brønn. Enten RPS27L-uttrykk (shLuc) eller RPS27L-manglende (shRPS27L) LoVo-celler ble behandlet med 10 uM VP16 i 48 timer. For å identifisere apoptose-positive celler, ble cellene farget med et annexin-V /PI dobbel farging assay, med FITC Annexin V Apoptose Detection Kit I (BD Biosciences), i henhold til produsentens protokoll, med en mindre modifikasjon. I korthet ble cellene vasket med vaskebuffer (20 mM tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM CaCl
2) etter inkubering i 15 minutter i bindingsbuffer inneholdende 5 ul av annexin V-FITC og 5 ul PI ved værelsestemperatur i mørket. Ytterligere bevis for forekomsten av apoptose ble oppnådd ved bruk av mitokondriemembranpotensialet (ΔΨ) og spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Variasjonene i ΔΨ ble avslørt via mikroskopiske fluorescens ved hjelp av en MitoLight apoptose Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) som inneholder 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC- 1), i henhold til produsentens instruksjoner, med mindre modifikasjoner. Først, 6 x 10
4 colonic celler pr brønn ble inkubert og behandlet med VP16, som beskrevet ovenfor. Etter inkubering i 24 timer med VP16, ble hver prøve som ble behandlet med fortynnet MitoLight reagens (0,2 mL av MitoLight og 180 ul avionisert vann) og 20 ul av 10 x inkuberingsbuffer i 15 minutter ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Den svært negative membranpotensialet i mitokondriene produserer orange-rød fluorescens fra JC-1, og tapet av de mitokondrielle transmembrane mulige resultater i grønn fluorescens, med tap av den røde fluorescens. Nivåene av kløyvde PARP protein ble bestemt på immunoblotter (Metoder s1).
γ-H2AX Foci Formation analysen
Etter 5 × 10
4 LoVo celler per brønn hadde blitt inkubert i 24 timer, ble DNA dobbel-strandet pauser (DSB sin) indusert i disse cellene med 10 mikrometer VP16. Cellenes evne til å reparere DSB sin ble bestemt ved farging dem med anti-γ-H2AX antistoff bruker OxiSelect DNA Double Strand Break Farging Kit (Cell Biolabs, San Diego, California), i henhold til produsentens instruksjoner, med noen mindre endringer. I korthet ble cellene tillatt å komme seg ved å fjerne DSB induktor for de angitte perioder. De DSB sin avdekket (som γ-H2AX foci) opptrådte som grønn fluorescens, og kjernene ble visualisert ved kontra dem med DAPI (4′-6-diamidino-2-fenylindol). Den grønne fluorescens indikerer γ-H2AX foci ble visualisert med Adobe Photoshop CS4 Extended (ver 11,0;. Adobe Systems, San Jose, CA) i 100-200 tilfeldig valgte celler. En terskel ble bestemt ved å måle tilsvarende nivåer av grønn farge i cellene som hadde gjenvunnet over ulike perioder (0 timer, 2 timer eller 4 timer). Resultatene er presentert som prosentandelen av celler som avgir fluorescens over terskelnivå.
Statistical Analysis
Overlevelseskurver og overlevelsessannsynlighet ble estimert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test. Variabler med
P
-verdier ≤ 0,1 i univariatanalyser ble inkludert i den multivariable modell av Cox analyse, ved hjelp av en metode for å legge inn overlevelsesanalyse. Forskjeller i genuttrykk og i numrene på γ-H2AX foci ble sammenliknet med Student t-test. Statistiske analyser ble utført med SPSS 13.0 programvare (SPSS, Somers, New York). Den MedCalc statistisk programvare pakken (MedCalc, Mariakerke, Belgia) ble brukt til å generere mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver. Dataene som vises her er representative for minst tre forsøk med lignende resultater, og
P
-verdier. 0,05 anses vesentlig
Resultater
kliniske betydningen av RPS27L i CRC
nivået av fekal RPS27L positivt korrelert med prosentandelen av CRC celler av mellomtrinns CRC pasienter i S-fasen (r
s = 0,259;
P
= 0,033, Pearson korrelasjon test). Vi utførte en ROC-kurve analyse og stratifisert pasientene i to grupper ved hjelp av fecal RPS27L nivået av 0,0014, for hvilken en sensitivitet på 0,80 (95% konfidensintervall [CI], 0,28 til 0,99) og en spesifisitet på 0,77 (95% CI, 0,66 til 0,86) ble oppnådd, å forutsi prognosen for pasienter. Arealet under ROC-kurven for fekal RPS27L var 0,733 (
P
= 0,017), med et 95% konfidensintervall fra 0,623 til 0,826 (figur 1A). Overlevelsesratene ble sammenlignet mellom RPS27L
+ (n = 51; ≥ 0,0014) og RPS27L
– grupper (n = 20; 0,0014); femårssykdomsspesifikk overlevelse (DSS) rate var høyere i RPS27L
+ gruppen (97,1% ± 2,8%) enn i RPS27L
– gruppen (69,6% ± 12,9%, P = 0,028, log -rank test). Ingen forhold var tydelig mellom RPS27L
+ gruppe og andre clinicopathological parametere (tabell 1). Men univariat og multivariat Cox analyser viste at fecal RPS27L nivå var en uavhengig prognostisk faktor (farer ratio 0,086; 95% CI, 0,009 til 0,852;
P
= 0,036) for DSS av mellomtrinns CRC pasienter (tabell 2). I tillegg er tre nonrecurrent pasienter (stadium III) med gunstige prognoser (overlevelse 8 år) viste intens immunhistokjemisk farging for p53 og RPS27L i vevssnitt (figur 1B, pasienter 1-3). Tre andre stadium III pasienter, som led tilbakefall innen ett år etter operasjonen, og døde etter første residiv (overlevelse 4 år), var også positive for p53 protein i kreftceller, men et uttrykk for RPS27L protein var svak i den tilsvarende posisjoner (figur 1B, pasienter 4-6).
(A) klinisk betydning av RPS27L mRNA i avføring. Nivåer av RPS27L mRNA ble relativt kvantifisert ved QRT-PCR. Punktene på mottakeren opererer karakteristikk (svart innfelt) representerte følsomhet og (1-spesifisitet) for DSS. Kaplan-Meier anslått av DSS avhengig RPS27L mRNA nivåer (RPS27L-, 0,0014, RPS27L +, (0,0014) i avføringen til CRC pasienter (B) Protein nivåer av p53 og RPS27L i CRC vev Hver prøve ble farget med anti-.. p53 og anti-RPS27L antistoffer fra to tilstøtende seksjoner ikke-tilbakevendende pasienter: pasienter 1 til 3, overlevelse 8 y, tilbakevendende pasienter.. pasientenes 4 til 6, overlevelse 4 y Alle lysbilder ble kontra med hematoksylin Det samme. felt av det innsatte ved lav forstørrelse (40 ×) ble vist ved høyere forstørrelse (200 ×). Arrows, tilsvarende posisjoner for hver pasient.
Translokasjon av RPS27L i tykktarms kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
for å undersøke cellulære funksjon RPS27L, infisert vi LoVo celler, en vill-type p53-uttrykkende cellelinje fra en scene på scene III CRC, ved hjelp av et lentivirus-mediert kort hårnål RNA (shRNA) til effektivt slå ned RPS27L uttrykk (shRPS27L) eller en kontroll shRNA (shLuc) (Figur S1). immunocytokjemisk farging for endogen RPS27L var positiv i cytoplasma av shLuc-infiserte LoVo celler, men var negativ i cellene infisert med shRPS27L (figur 2A) . Den cytoplasmatiske RPS27L ble translokert til kjernen av 10 pM VP16-behandlede LoVo-celler, og den intense fargingen for RPS27L protein i kjerner er vist i figur 2B. Dette VP16-indusert endring ble også observert i løpet av immundeteksjon av RPS27L i de opprinnelige LoVo celler (figur 2C).
(A) Cellular lokalisering av RPS27L. RPS27L var immun-farget i ulike LoVo celler. (B) Kjerne induksjon av RPS27L å bruke 10 (M VP16. Piler i innfellinger (a og b) er angitt kondensere atom RPS27L-flekker. (C) Immuno-påvisning av RPS27L i forskjellige nukleære ekstrakter. Det kjerneekstrakt ble fremstilt fra synkroniserte LoVo-celler med VP16 som angitt shLuc, RPS27L-uttrykke celler,… shRPS27L, RPS27L-mangler celler, overRPS27L, RPS27L-overekspresjon celler Anti-RPS27L antistoff, 1:2000
Cellular Effekter av nedregulert RPS27L i kolorektal kreft celler
Vi neste analysert cellulære virkningene av RPS27L ved overekspresjon RPS27L i LoVo celler (overRPS27L) (Figur S1). i likhet regulering cellesyklus ble observert i VP16-frie celler (uavhengig av RPS27L uttrykket) som rapportert i tidligere studier (figur 3A) [22]. Når DNA fra de synkroniserte celler ble skadet av VP16 i fullstendig medium, er antall celler i S og G
2 /M-fasene øker i henhold til ekspresjon av RPS27L (shLuc eller overRPS27L). Men en annen lignende RP,
RPS27
, endret ikke størrelsen av S-fase befolkning, uavhengig av nivået av
RPS27
uttrykk følgende VP16 behandling (Figur S2). Samtidige målinger av DNA-innhold og mengden av BrdU-merket DNA indikerte at det var færre celler med aktiv DNA-syntese blant RPS27L-manglende celler (21% i shRPS27L) etter behandling med 10 uM VP16 (figur 3B). I motsetning til dette, vil både RPS27L-uttrykkende og RPS27L-celler som overuttrykker hadde en høyere andel av celler med aktiv DNA-syntese (32% i shLuc og 37% i overRPS27L) under identiske betingelser (figur 3B).
(A ) Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP regulering. Celle faser ble bestemt etter en indikert VP16 behandling. (B) Celler med nylig syntetiserte DNA i henhold til VP16 behandling. Prosentandelen av BrdU-positive celler (blå flekker) ble bestemt etter en indikert VP16 behandling. (C) Annexin V-/PI dobbel-farging analysen. Piler indikert annexin V-FITC og PI positive celler. VL, synlig lys; PI, propidiumjodid. Grønn flekk, annexin V-FITC; rød flekk, PI. (D) Celler med JC-1 flekk. Piler indikerte den røde kornet mønster av JC-en aggregering. (E) Immuno-påvisning av PARP cleavage. Kløyvet PARP, 89 kDa; GAPDH, 36 kDa. shLuc, RPS27L-uttrykke celler; shRPS27L, RPS27L-mangler celler; overRPS27L, RPS27L-overekspresjon celler.
apoptotiske aktivitet RPS27L i LoVo celler ble vurdert. Kort, kontrollceller (shLuc) var negative for annexin V-FITC. De RPS27L-mangler celler (shRPS27L) inneholdt flere annexin-V-positive celler og vises en sen apoptotisk (eller nekrotisk) scenen når dobbelt positivt farget (annexin V og PI) (figur 3C). Dessuten, ble levende celler som uttrykker RPS27L påvist ved anvendelse av den røde granulære mønster av JC-1 aggregering i celler behandlet med 10 uM VP16 (figur 3D) og økte nivåer av spaltede PARP ble observert med økende konsentrasjoner av VP16 (figur 3E). I RPS27L-mangler celler, ble denne røde kornet mønsteret ikke eksisterer, og det høyeste nivået av spaltet PARP observert (Tall 3D og 3E).
DNA Repair Funksjon RPS27L i kolorektal kreft celler
Vi videre kvantifisert mRNA uttrykk for E2F transkripsjonsfaktor 1 (E2F1), RAD51, og protein kinase, DNA-aktivert, katalytisk polypeptid (PRKDC) for å identifisere rollen RPS27L i VP16-indusert DSB sin. I RPS27L-mangler celler, behandling med 10 mm VP16 induserte en 63,6% reduksjon (1.1- til 0.4 ganger) i E2F1 uttrykk og en 54,5% reduksjon (1.1- til 0.6 ganger) i RAD51 uttrykk (Figur 4A). Tilsvar redusert uttrykk for PRKDC (0.8- til 0.5 ganger) ble også observert under de samme behandlingsforhold. Prosentandelen av celler med intens fosforylert histon H2AX (γ-H2AX) foki ble redusert etterhvert som den reparasjonstiden øket fra 0 til 4 timer, uavhengig av om LoVo-celler uttrykte RPS27L (figur 4B). Imidlertid ble en forsinkelse i kinetikken til den avtagende intensitet av γ-H2AX foci observeres i celler som mangler ekspresjon RPS27L. Opp til 61% av RPS27L-manglende celler inneholdt en høy tetthet av γ-H2AX foci etter reparasjon i 4 timer, mens bare 17% av RPS27L-uttrykkende celler var over tettheten terskel for γ-H2AX foci på den tid (figur 4C) .
(A) i forhold uttrykk for DNA reparasjonsgener. De mRNA nivåer av
E2F1, RAD51
, og
PRKDC
ble kvantifisert ved hjelp QRT-PCR følgende celler med angitte VP16 behandling. Den relative ekspresjon av hvert gen ble beregnet ved å sammenligne den av shLuc celler uten VP16 behandling. (B) Representative bilder av celler med γ-H2AX foci. Celler ble tillatt å gjenvinne ved å fjerne DSB sin induktor for 4 h (x 100). En terskel ble bestemt ved å måle tilsvarende nivåer av grønn fluorescens (γ-H2AX brennpunkter, avdekket DSB sin) mellom shLuc og shRPS27L celler. Innfellinger (200 x): 1 og 4, γ-H2AX foci (også angitt terskelen); 2 og 5, DAPI; 3, flette av 1 og 2; 6, fusjon av 4 og 5. (C) Statistisk forskjell fra γ-H2AX foci i celler. Celler ble behandlet med 10 pM av VP16 i 1 time og gjenvinnes for angitte tid. Andel 100-200 tilfeldig valgte celler som grønn fluorescens var høyere enn terskelen ble angitt. shLuc, RPS27L-uttrykke celler; shRPS27L, RPS27L-mangler celler. Dataene er gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; **
P
0,01. To-tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Diskusjoner
Molekylære markører kan utgjøre et bedre grunnlag for å velge behandling enn kliniske og histopatologiske kriterier [23]. Carcinoembryonic antigen (CEA) og kreft antigen 19-9 (CA19-9) er de mest brukte markører for CRC [24]. Imidlertid er høye nivåer av enten serum CEA eller CA19-9 anses å indikere en ugunstig prognose i CRC pasienter med mellomliggende stadium sykdommen [25], [26].
I denne studien har vi fokusert på CRC pasienter i de mellomliggende stadier av sykdommen fordi adjuvant terapi er viktig for disse pasientene. Vi har tidligere rapportert at uttrykket av mange RPs, inkludert RPS27L, skilte seg vesentlig i avføringen til CRC pasienter; men ingen signifikant uttrykk forskjell ble funnet for RPS27, et medlem av samme familie som RPS27L [15]. Vi har nå vist at mellomtrinns-pasienter med økt avførings RPS27L ekspresjon hadde en høyere DSS hastighet og en mye lavere risiko-forhold.
For tiden overvåker vi funksjonell p53 ved bestemmelse av fekal RPS27L status av pasienter med mellomliggende stadium CRC. Den kliniske betydningen av RPS27L var ikke bare demonstrert i fekale prøver, men også i CRC vevsprøver. I mellomtrinns CRC, ble intens RPS27L farging, med en økning i p53-protein, i det CRC vev som finnes hos pasienter som viser lengre overlevelse. Men pasienter med p53 protein unnlatt å aktivere uttrykk for RPS27L hadde dårlige prognoser, med tilbakefall og kortere overlevelse. Dette innebærer at mellomtrinns CRC pasienter med høyere RPS27L nivåer, enten i avføringen eller vev, har en mer gunstig prognose, og konsistent uttrykk av p53 og RPS27L ble observert hos disse pasientene med bedre prognoser.
Dette er den første rapporten som viser at RPS27L er en potensiell prognostisk markør for CRC. I våre kliniske prøver, nivået av avføring RPS27L positivt korrelert med prosentandelen av CRC-celler i S-fasen. Disse kliniske data er i overensstemmelse med våre resultater fra synkroniserte LoVo celler som uttrykte RPS27L. RPS27L og dens homologe proteiner, RPS27, kan interagere med p53-MDM2 aksen i forskjellige celletyper [20]. I denne studien har vi brukt RNA interferens (shRPS27L) for å slå ned RPS27L uttrykk i LoVo celler. Vi fant ut at det ble oppdaget noen forskjell i RPS27 uttrykk fra cellene med eller uten RPS27L lyddemping (våre upubliserte data), og ingen konsekvent cellulær effekt ble observert i RPS27L- og RPS27-mangler LoVo celler. Videre betyr shRPS27L ikke påvirker uttrykket av andre gener, selv de (klotho, NM_004795; archaelysin familie metallopeptidase 1, NM_133463) med mRNA-sekvenser som har deler av ord til shRPS27L (Figur S3). Faktisk er klotho og archaelysin familie metallopeptidase en naturlig uttrykt i lave nivåer i vår målgruppe CRC cellelinje, LoVo (data ikke vist) [27], [28]. Totalt sett, våre resultater bekrefter at effektene av shRPS27L er bestemt. I tillegg ble det proteinsekvens av RPS27L kontrolleres mot det humane genom i UCSC genomet server [29]. Tjueni proteinsekvenser med varierende grad av identitet (61,6% -98,8%) til RPS27L ble identifisert, men ingen av disse ble kjørt ned av shRPS27L, på grunn av sin bestemt rekkefølge. Dette igjen understreker at ingen andre enn RPS27L protein kan bli slått ned av shRPS27L.
Etter bekreftelse av spesifisitet virknings shRPS27L, vi spekulert i at p53-responsive RPS27L fører til pågripelsen av cellene i S-fasen når det cellulære DNA er skadet. Etter DNA-skade og p53 ble indusert ved tilsetning av VP16, BrdU-positive celler i S-fasen akkumulert av de RPS27L-uttrykkende LoVo-celler. Disse funnene tyder på at RPS27L fører til at cellene til å arrestere i S-fasen følgende aktive DNA syntese, og tillater ikke disse cellene til å angi M fase. Observasjonen av annexin-V-positive og JC-1-aggregerte celler som sterkt tyder på at DNA-ødeleggende middel, VP16, induserer en antiapoptotic effekt på celler som uttrykker både vill-type p53 og RPS27L. Dette antiapoptotic effekten ble også reflektert i høyere nivåer av spaltet PARP i RPS27L-mangler celler. Aktivering av PARP er også viktig for reguleringen av mange cellulære prosesser, inkludert DNA-reparasjon og celledød [30].
imidlertid den aktive DNA-syntese og antiapoptotic effekt observert, selv når det cellulære DNA ble skadet, synes uforenlig med våre kliniske data, noe som indikerer at pasienter med høyere nivåer av ekspresjon RPS27L har en mer gunstig prognose. Vi hypotese at nonapoptotic celler med skadet DNA må få tilgang til en egnet metode for DNA DSB reparasjon, og at målretting DNA-reparasjon proteiner bør bli mye brukt i behandling av kreft [31]. Dette kan illustreres ved kvantifisering av to DNA DSB-reparasjonsgener, RAD51 og PRKDC [32], og et gen som koder for en komponent av reparasjons komplekser, E2F1 [33]. Deres redusert uttrykk sammenfalt med RPS27L knockdown etter behandling med lavdose VP16. Dette er i samsvar med resultatene som E2F1 spiller en funksjonell rolle i å undertrykke apoptose og fremme DNA-reparasjon in vivo etter DNA-skade [34]. Følgelig er RPS27L nødvendig for å undertrykke apoptose og for DNA DSB reparasjon i colonic celler som uttrykker villtype p53. Videre kan VP16-indusert DSB sin indusere akkumulering av RPS27L protein i kjernen av LoVo-celler. Dette tyder på at DNA DSB skade spiller en avgjørende rolle i å indusere bevegelsen av RPS27L protein fra cytoplasma til kjernen. Xiong et al. også rapporterte tilsvarende resultater i en undersøkelse av menneskelige lunge adenokarsinom epitel-celler [20]. Vi spekulerer i at translokasjon av RPS27L protein kan være avgjørende i reguleringen av noen DNA reparasjonsgener. Men videre studier er nødvendig for å avklare forholdet mellom RPS27L uttrykk og DNA DSBs reparasjonsgener.
Det avgjørende regulering av RPS27L i DNA DSB reparasjon kan også vurderes ved å måle kinetikken av endringene i antall γ -H2AX foci [35]. I kombinasjon med resultatene for BrdU innlemmelse, foreslår vi at RPS27L deltar i DNA DSB reparasjon gjennom en mekanisme av homolog rekombinasjon, fordi de fleste BrdU-positive celler ble begrenset til sent S fasen [36]. Dette svarer delvis til resultatene av Miquel et al., Som viste at en høy andel av CRC-celler er ikke i stand til å reparere DNA på grunn av endringer i en eller flere komponenter av de to hoved DNA-reparasjonsmekanismer, inkludert homolog rekombinasjon pathway [37 ].
Konklusjoner
Forhøyet p53-responsive RPS27L opphopning i kjernen kan forbedre prognosene for visse CRC pasienter, eventuelt gjennom sin effekt på DNA-reparasjon i colonic celler. RPS27L akkumulering kan observeres i avføringen. Ved å integrere kliniske, molekylære og cellulære data, har vår studie viste at avføring RPS27L kan være en indeks for prognose i CRC pasienter og kan veilede personlige terapeutiske strategier, spesielt hos pasienter med mellomtrinns CRC.
Støtte Informasjon
Figur S1.
Effektive endringer av RPS27L uttrykk ved å gjennomføre lentivirus-mediert eksperimenter LoVo celler. Stabil RPS27L-uttrykke (shLuc), RPS27L-mangler (shRPS27L), og RPS27L-overekspresjon (overRPS27L) LoVo celler ble kjøpt opp av ulike lentivirus infeksjoner. RPS27L, 9 kDa; . GAPDH, 36 kDa
doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Effekt av RPS27 uttrykk på flowcytometri. LoVo celler, som enten taushet RPS27 (shRPS27) eller infisert kontroll virus (shLuc) ble behandlet med DMSO eller 10 um av VP16. Sortering analyser av propidiumjodid (PI) -stained celler ved flow cytometri. Omtrent 104 celler i ulike faser av cellesyklusen ble bestemt med FlowJo 8.7 programvare
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067043.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
mRNA sekvenser med deler av ord til shRPS27L. shRPS27L var RNA interferens for å slå ned RPS27L uttrykk. Hvert punkt medførte identisk nukleotid med sekvensen av shRPS27L. Utvalgene av matchet sekvenser i hvert cDNA ble indikert. Ribosomalt protein S27-lignende (RPS27L): NM_015920; klotho: NM_004795; archaelysin familie metallopeptidase 1 (AMZ1). NM_133463
doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s003 plakater (TIF)
Metoder S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s004 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne ønsker å takke legene. Jen-Kou Lin og Shih-Ching Chang (begge fra Kirurgisk avdeling, Taipei-Veterans General Hospital) som informerte oss de kliniske data for noen pasienter og Dr. Yih-Yiing Wu for sin overlegne støtte i patologi. Vi takker også National RNAi Kjerne Facility ved Institutt for molekylær biologi /Genomisk Research Center, Academia Sinica å gi RNAi reagenser som ble støttet av National Research Program for Genomisk medisin Grants av NSC (NSC 97-3112-B-001-016) .
