Abstract
Vi har tidligere vist at humane prostatakreftceller er i stand til å skaffe ondartede egenskaper gjennom interaksjon med stromale celler i svulsten mikromiljøet, mens de samvirkende stromale celler kan også bli påvirket med både fenotypiske og genotypiske forandringer . Denne studien anvendes en ko-kulturmodell for å undersøke mekanismen bak den ko-utviklingen av kreft og stromale celler. Red fluorescerende androgen-avhengige LNCaP prostata kreft celler ble dyrket med et matchet par normale og kreft-assosiert prostata myofibroblast celler til å simulere kreft-stromal interaksjon, og celleforandringer i co-kulturen ble dokumentert ved å spore den røde fluorescens. Vi har funnet hyppig spontane fusjoner mellom kreft og stromale celler i hele den ko-kulturen. I kolonidannelse analyser som vurderer Skjebnen til hybridcellene, de fleste av de kreftfrem stromal-fusjons hybrider forble vekst-arrestert og til slutt forsvant. Men noen av hybridene levde til å danne kolonier fra ko-kultur med kreft-assosiert stromale celler. Disse avledede kloner viste genomiske forandringer sammen med androgen-uavhengig fenotype. Resultatene fra denne studien viser at prostatakreftceller er fusogent, og kreft-stromal interaksjon kan føre til spontan sammensmelting mellom de to celletyper. Mens en kreft-stromal fusjon strategi kan tillate stromal rommet for å utslette invadere kreftceller, kan visse kreft stromal hybrider med økt overlevelse evne unnslippe utslettelse for å danne et derivat kreftcelle befolkning med en endret genotype og økt malignitet. Kreft-stromal fusjon legger dermed et grunnlag for en uopphørlig koevolusjon mellom kreft og kreft-assosiert stromale celler i svulsten mikromiljøet
Citation. Wang R, Sun X, Wang CY, Hu P, Chu CY Liu S, et al. (2012) Spontaneous Cancer-stromal Cell Fusion som en mekanisme av prostatakreft androgen uavhengig progresjon. PLoS ONE 7 (8): e42653. doi: 10,1371 /journal.pone.0042653
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: Mai 29, 2012; Godkjent: 09.07.2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av forskningsmidler R21CA112330 og CA132388 fra NCI /NIH (National Cancer Institute of National Institutes of Health i USA.), og PC040578 fra DoD til Ruoxiang Wang; og NCI /NIH stipend CA98912-02 til Leland W. K. Chung. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft behandling blir ofte satt tilbake av androgen-uavhengig progresjon og bein metastasering. Mens primærcancer er til å begynne androgen-avhengige og kan være herdbar ved androgen deprivasjon, er androgen-uavhengighet som er felles for tilbakevendende kreft og metastase, som ofte er uhelbredelig. Sammen med progresjon fra den primære til den metastatiske tilstand, har kreftceller ervervet visse trekk gunstig for overlevelse i fravær av androgener [1], [2].
Årsaken til androgen uavhengighet gjenstår å bli belyst. Forhøyet androgenreseptoren (AR) aktivitet og forbedret overlevelse hos kreftcellene kan være medvirkende faktorer [3], [4], men stromale celler i svulsten mikromiljøet også spille en viktig rolle [5]. I normal prostata, er kjertel epitellaget strukturelt adskilt fra den omkringliggende stroma ved en laminær basalmembran. I prostata cancer, ville infiltrerende kreftceller danner direkte kontakt med de stromale celler, plassere kreft progresjon prosessen i forbindelse med en stromal mikromiljøet. Opptegning av mekanismen for kreft-stromal samhandling er en prioritet for forbedring av prostata kreft behandling.
Vi har definert en obligatorisk rolle mesenchymale stroma i prostata kreft progresjon til androgen uavhengighet ved å modellere samspillet mellom kreft og stromale celler [6], [7], [8], [9]. LNCaP humane prostatakreftceller, for eksempel, er androgen-avhengig når analysert med hensyn på tumordannelse hos kastrerte hann atymiske mus. Disse cellene, men kan danne hyppige tumorer ved samtidig inokulert med celler fra benmargen mesenchymale stromal avstamning [9], [10]. Forbløffende nok kreftceller utvinnes fra de resulterende svulstene var androgen-uavhengig, konstitutivt produsere høye nivåer av prostataspesifikt antigen (PSA), reproduserbart forming androgen-uavhengig xenografttumorer, og ofte viser metastatisk evne til bein [9], [10]. For å simulere
in vivo
kreft-stromal interaksjon, vi co-dyrket kreft og stromale celler under vanlige og 3-dimensjonale forhold. Ved direkte kontakt, kan de myofibroblast stromaceller redde LNCaP-celler fra androgen sult-indusert død [11], mens tre-dimensjonale ko-kultur resulterte i konstitutive uttrykks endringer i både kreft og stromale celler [12], [13], reflekterer co-evolusjon mellom kreft og mesenchymale stromale celler observert i prostata kreft progresjon og bein metastasering. Forbløffende nok kreftceller hentet fra co-kultur fødte permanente genomiske forandringer, oppdaget av utseendet på markør kromosomer. Genomisk endring kan være grunnlaget for Aneuploidy, den mest iøynefallende abnormitet i metastatisk kreft [14], [15]. Gransking av direkte kontakt mellom kreft og stromale celler kan avsløre den mekanismen som kreft-stromal samspill fremmer prostatakreft progresjon og bein metastasering.
I denne rapporten har vi ansatt co-kultur metoder til å undersøke årsaken til androgen uavhengighet. LNCaP-celler merket med en rød fluorescens-protein ble lagt over et monolag av prostata myofibroblast celler for å lette direkte kontakt mellom de to celletyper. Ved å spore den røde fluorescens, fant vi at kreftceller kan spontant fusjonere med stromale celler. Ved å følge skjebnen til kreft-stromal hybrider, har vi funnet at de fleste av de fusjonerte celler døde, mens noen få kunne overleve for å danne kloner. De avledede kloner utstilt kromosom tap, med akselerert vekst og forhøyet PSA produksjon i en androgen-uavhengig måte. Kreft-stromal celle fusjon er således en medvirkende mekanisme for androgen-uavhengig prostatakreft progresjon.
Metoder
Celler og celledyrkningsforhold
Opprinnelsen til LNCaP human prostatakreft cellelinje anvendt i denne studien ble tidligere rapportert [16]. Etableringen av RL-1, en LNCaP klon som uttrykker en AsRed2 fluorescens protein, sammen med isolering og karakterisering av et samsvarende par av HPS-14 normal og HPS-15 cancerassosierte humane prostata myofibroblast stromale kloner ble tidligere rapportert [11]. MRC-5 og MRC-9 føtale humane lunge stromale cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). PRSC, en primær normal human prostata stromal-cellelinje, ble kjøpt fra Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville, MD). Alle disse cellene ble holdt ved 37 ° C på T-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), ampicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml), med fuktet luft supplert med 5% CO
2. Normal menneskelig benmarg multipotente mesenchymale stromale celler transduced med lentiviral grønn fluorescens protein (HMSC-GFP) ble kjøpt fra Tulane Senter for Gene Therapy (Tulane University, New Orleans, Louisiana) og dyrket i α Minimum Essential Medium (Invitrogen) inneholder 16,5 % FBS og 2 mM L-glutamin [17].
Co-kultur
Direkte co-kultur av kreft og stromale celler ble tidligere rapportert [11]. For å danne en stromal celle monolag, 5 x 10
5 stromale celler i 2 ml medium ble sådd ut i hver brønn av en 6-brønns plate og tillatt å vokse til full konfluens. Mediet ble fjernet, og 5 x 10
5 celler av den røde fluorescerende LNCaP RL-1-klon i 4 ml friskt medium ble lagt over monolaget. Den ko-kulturmediet ble skiftet hver tredje dag.
kolonidannelse assay
Cellene blir undersøkt ble oppsamlet følgende trypsin-EDTA-behandling, og fortynnet til en lav tetthet enkeltcellesuspensjon (4 celler /ml). Til hver brønn i en 96-brønners plate, ble 100 ul av suspensjonen anvendt. Etter 24 timers inkubering ble platene undersøkt under mikroskop og brønner inneholdende en enkelt celle ble merket. Etter 8 uker med kultur, ble kolonier dannet i de merkede brønner forsterket for ytterligere karakterisering.
Androgen behandling
Protokollen for behandling av dyrkede celler med androgen ble tidligere rapportert [18]. I korthet ble et likt antall celler (5 x 10
5 /brønn) ble sådd ut på 6-brønners plater. Etter festing, ble androgen-deprivasjon utført ved dyrking av cellene med fenolrødt-fritt RPMI 1640-medium (Invitrogen) i 48 timer. Mediet ble endret til fenolrødt-fritt RPMI 1640 inneholdende 1% dextran-trekull strippet FBS. Syntetisk androgen methyltrienolone (R1881, Perkin Elmer, Waltham, MA) ble lagt til i behandlingsgruppen til 5 nM. Etter 24 timers behandling ble kulturmediet oppsamlet for PSA måling og cellene ble samlet for hele cellelysat preparat.
PSA ELISA
Celledyrkningsmedium ble anvendt for å detektere PSA-produksjon ved hjelp av vår tidligere rapportert protokollen [11]. En kommersiell PSA ELISA kit (United Biotech Inc., Mountain View, CA) ble brukt og tredoble analysene ble utført på hver prøve.
Celleproliferering analysen
Den protokollen som brukes for å analysere celleproliferasjon med MTT konvertering ble rapportert tidligere [11]. I korthet ble et likt antall celler (5 x 10
5 /ml) ble sådd ut på en 96-brønns plate. Etter androgen behandling som beskrevet ovenfor, ble cellene underkastet en proliferasjonsanalyse. Tredoble analyser ble utført på hver gruppe.
Western blotting
Protokollen for Western blotting ble rapportert tidligere [18]. I denne studien ble 20 ug av hele cellelysatet protein ble fraksjonert og blottet på nitrocellulosemembran. Membranen ble oppdaget med spesifikke antistoffer til AR (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, California). Nivået av den β-aktin ble benyttet som kontroll lasting.
PCR-analyse
Betingelsene for genomisk DNA-amplifikasjon ble rapportert tidligere [18]. I denne studien ble kjønnskromosomer oppdages med den rettsmedisinske sexing metoden [19]. Den primer-par som brukes for deteksjon av amelogenin gener var 5′- CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3 «og 5′- TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3′ [20]. Dette paret påviser både X-linked og Y-koblede amelogenin gener, som produserer et 977 basepar (bp) produkt fra intron 3 av X-linked-genet og et 788 bp produkt av den Y-koblede genet i en enkelt PCR-analyse. En primer par av 5»-ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC-3 «og 5′-CTACAGCTTTGTCCAGTGGCTGTAGCGGTC-3» ble benyttet for å detektere den kodende region (615 bp) av den Y-spesifikke SRY genet. Produktet fra reaksjonen ble fraksjonert ved 1% agarosegel-elektroforese, og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging.
fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse
Protokollen for FACS-analysen ble beskrevet tidligere [11]. I denne studien ble dyrkede celler løsnet ved trypsin-EDTA. Etter å ha blitt vasket i fosfatbufret saltløsning og fiksert i 75% etylalkohol, ble cellene farget med propidiumjodid i nærvær av RNase A i 30 minutter og underkastet FACS-analyse for cellesyklus profilering. Perifere mononukleære blodceller fra to friske menn ble anvendt som normal kontroll for genomiske innhold. Bruk av donor prøven ble godkjent av en Institutional Review Board av Emory University School of Medicine (IRB nummer 278-2006), med skriftlig informert samtykke fra deltakerne.
Fluorescensmikroskopi
Protokollen for rød fluorescens avbildning ble tidligere rapportert [11]. I denne studien, for sammenligningsformål alle de røde fluorescerende bildene ble tatt med faste innstillinger: 4,15 sekunder for bildebehandling på 40 x forstørrelse, 2,075 sekunder for bildebehandling på 100 × forstørrelse, og 1.0375 sekunder for bildebehandling på 200 × forstørrelse
Resultater
1. Karakteristika av prostatakreft og stromale celler i den ko-kultursystem
Vi brukte en rød fluorescens-protein for å spore LNCaP-celler i ko-kultur [11]. En representativ rød fluorescerende LNCaP-klon, RL-1, ble anvendt i denne studien. RL-1 celler viste vekstrater (figur 1A), PSA produksjons (figur 1B) og AR nivå (figur 1C) ligner på foreldre LNCaP celler. På det genomiske nivå, RL-1-celler inneholdt y-kromosom (figur 1D), en genomisk funksjon som ble tapt i forbindelse med androgen-uavhengig progresjon [21]. Både RL-1 og foreldre LNCaP-celler viste en identisk nær-tetraploid genomiske innhold (figur 1E), noe som indikerer en xxyy karyotype [21]. Når analysert for xenograft tumordannelse, gjorde RL-1 celler danner ikke subkutane svulster i atymiske mus, og dermed beholde den ikke-tumorigen tilhører foreldre LNCaP cellene.
A, Differensial vekst respons på androgen. De opprinnelige LNCaP-celler og den røde fluorescerende RL-1-klon, sammen med et tilpasset par av prostata stromale celler, HPS-14 (normal) og HPS-15 (cancer-assosiert), ble sammenlignet for spredning ved MTT-konvertering. Etter 48-timers serum sult, ble cellene behandlet på vanlig dyrkingsmedium (Control), androgen deprivasjon medium (deprivation), og androgen deprivasjon medium som inneholder 5 nM syntetisk androgen R1881 (R1881). MTT-analyser ble foretatt 48 timer senere. Data representerer gjennomsnittet ± SD av en triplikat assay. B, Differensial PSA produksjon. Det ble oppdaget kulturmedium fra de behandlede celler for PSA konsentrasjon med ELISA. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av triplikate bestemmelser. C, Differensial AR uttrykk. Celler ble underkastet Western blotting for AR ekspresjon. Den normale humane stromal PRSC cellelinje ble benyttet i sammenligningen. Nivået av β-aktin-ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. Resultatet var representative for to separate eksperimenter. D, Differensial karyotype. Genomisk DNA PCR ble brukt til å oppdage kjønnskromosomer med en rettsmedisinsk sexing metode [20]. MRC-5 og MRC-9-celler ble for å fremstille hann og hunn genomisk DNA, respektivt. I det øvre felt (Amelogenin), ble kromosom detektert som det øvre bånd, mens y-kromosom ble detektert som den nedre bånd. I det nedre panel (SRY), ble kromosom-spesifikke SRY locus som brukes for å bekrefte tilstedeværelse av y-kromosom. E, Differensial genomiske innholdet. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra en frisk mann ble brukt til å vise normal diploid genomiske innhold som målt ved FACS. RL-1-celler hadde en nær-tetraploid genomiske innhold lik foreldre LNCaP-celler [21]. HPS-14 og HPS-15 celler viste genomiske innholdet ligner på normal PBMC.
Vi har tidligere karakterisert matchet par vanlige HPS-14 og kreft-assosiert HPS-15 menneskelige prostata stromal kloner [11] , som var store og saktevoksende myofibroblasts (figur 1A) ikke uttrykker PSA (figur 1B). Interessant nok, ingen av stromale kloner uttrykte detekterbare nivåer av AR ved hjelp av Western blotting (figur 1C) eller ved hjelp av RT-PCR (data ikke vist). HPS-14 cellene inneholdt Y-kromosom, som ble tapt i kreft-assosiert motstykke (figur 1D). Flowcytometri avslørte at både HPS-14 og HPS-15 opprettholdt et genomisk innhold nær det normale humane perifere mononukleære blodceller (figur 1E).
2. Spontan fusjon av kreft og stromale celler
For å undersøke kreft stromal samhandling i co-kultur, RL-1 celler ble lagt over en konfluent monolag av HPS-14 eller HPS-15 celler, slik at kreft celler var i direkte kontakt med stromale celler. RL-1-celler viste en størrelse på ca. 15 um x 50 um (figur 2A), mens det stromale celler var i mye større og mer utvidet form, men uten noen rød fluorescens (figur 2B).
RL-1 celler (A) og HPS-15-celler (B) er vist i en separat kultur. Etter 7 dager etter ko-kultur, kan spontan fusjon bli sett (C). Ved høyere forstørrelse, inneholdt de sammensmeltede celle to kjerner, en fluorescens-rød og den andre fluorescensmerket blek (D). Cancer-stromal fusjon ble ofte sett i områder hvor RL-1 og HPS-15 dannet nær kontakt (E). I enkelte tilfeller kan cellene i midten av et fusjons bli sett (F). De to kjerner kan ses i nærheten av hverandre (G) eller separert (H). For hver visning, er en fase kontrast bilde (øverst) og rød fluorescens bilde (nederst) vises. Pilene brukes for å indikere kjerner.
Daglig inspeksjon avdekket at cellene i stromal mono kunne slå fluorescerende rødt under co-kultur (Tall 2C og 2D). At de røde fluorescerende stromale celler resulterte fra fusjon med RL-1 kreftceller ble bestemt basert på følgende observasjoner. Først ble fluorescently røde stromale celler finnes hovedsakelig i tilknytning til kreftceller (figur 2E). For det andre, selv om sanntids-teknologien ikke hadde blitt brukt til å registrere den dynamiske prosessen av fusjons, var det ikke vanskelig å finne tilfeller der en kreftcelle ble halvveis smeltet sammen med en stromal celle (figur 2F). For det tredje er mange av disse stromale celler inneholdt to kjerner, en fluorescens-rød indikerer dens avledning fra en kreftcelle, og den andre fluorescensmerket blek antyde dens stromal opprinnelse (figurene 2C til 2 H). De røde cellene i stromal monolag med en stromal utseende var cytoplasmatiske fusion hybrider mellom kreft og stromale celler.
Flere stromale celler co-kultivert å observere kreft-stromal fusjon. En av studiene ble en ko-kultur av RL-1-celler med HMSC-GFP, normale humane benmarg mesenchymal stromale celler som uttrykker en grønn fluorescens protein [17]. Den co-kulturen ble sett på 4 uker med anslagsvis 25% befolkningen som dually fluorescerende celler, grønne fluorescerende celler med distinkte stromal morfologi utslipp rød fluorescens, de fleste med en ekstra rød fluorescerende kjernen (figur 3). Alle disse studiene bekreftet at at de røde fluorescerende LNCaP prostatakreftceller var fusogene. En gang i direkte kontakt, kan RL-1 celler smelter sammen til stromale celler.
Representative kreftfrem stromal celle fusion hendelser fra co-kulturen i RL-1 celler med HMSC-GFP celler er vist. A, er en enkelt fusjon arrangement på dagen syv vist i sterkt felt, grønn fluorescens, og rød fluorescens. De grønne og røde fluorescens bilder flettes (sammenslåtte fluorescens) for å vise de to kjerner av ulik fluorescens. B, Sammenslåtte fluorescens bilder for 4 ekstra fusjonsbegivenheter vises, med arrangementer 1 og 2 er spilt inn på dag 7, og 3 og 4 på dag 14. Pilene brukes til å indikere kjerner. Alle bildene er vist 200 × forstørrelse.
3. Karakteristika for den kreftfrem stromal cellefusjon
Siden det stromale celleparet er saktevoksende og er inhibering av veksten av RL-1-celler [11], et ko-kultur kan bli opprettholdt i 8 uker for periodisk dokumentasjon i 4 gjentatte forsøk. Liten celle fusjon ble sett i de første 48 timene av co-kultur. Røde fluorescerende celler i stromallaget begynte å vises etterpå med daglig økende tall til et platå omkring 4 uker, ved hvilket tidspunkt et maksimum på 20% av stromal populasjonen var involvert i fusjonen (figur 4). Kreft-stromal fusjon var således en spontan og en kronisk prosess.
co-kulturer av RL-1 og HPS-15-celler ble observert ukentlig for frekvensen av cellefusjon. For hver visning, er en fase kontrast bilde (øverst) og rød fluorescens bilde (nederst) vises. Pilene brukes til å indikere kreft-stromal cellefusjonsbegivenheter. Alle bildene er vist ved 40 × forstørrelse.
Kreft-stromal fusjon fant sted bare når levedyktige kreftceller ble brukt. Co-kultur med døde RL-1 celler, drept av androgen deprivasjon, bakteriedrepende ultrafiolett stråling, snap frysing, eller vakuum uttørking, var ikke i stand til å gjøre de stromale celler fluorescerende røde i 8 uker. Videre inkubasjon med renset genomisk DNA fra RL-1-celler (10 ug /ml) eller pAsRed2 plasmid-DNA (10 ug /ml) førte ikke til rød fluorescens i stromale celler. Den spontane kreft-stromal fusjon virket en aktiv prosess, som krever deltakelse av både kreft og stromale celler.
I de 4 separate co-kultur eksperimenter, vi fant ikke forskjell mellom de vanlige HPS-14 og kreft-assosiert HPS-15 stromale celler i forhold til deres hyppighet av fusjon med kreftceller. RL-1 kan også smelte sammen med andre tilpassede par av humane prostata stromale celler etablert i vårt laboratorium [11] og med stromale celler avledet fra andre vev, inkludert benmarg-mesenchymale stromale celler (figur 3). De fusogene kreftceller syntes å ha potensial til å fusjonere med et bredt utvalg av andre celler.
I co-kultur med prostata stromale celler, la vi merke til at hybridceller sjelden ga progenies som beholdt den stromal morfologi. Ved å følge 32 hybrid celler fra dag 7 til dag 28 i en co-kultur, for eksempel, vi fant ikke noen av hybrider dele inn klonale klynger med stromal morfologi, heller ikke fra co-kulturen med HMSC-GFP celler (Figur 3). Hybrider syntes å ha en interessant skjebne: de enten hadde problemer med å initiere celledeling, eller deres avkom hadde fått divergerende morfologi
4.. Fate av kreft-stromal hybrider
Cell fusjon er en biologisk prosess som serverer viktige funksjoner [22], [23], [24], [25]. Mens cytoplasma fusjon
per se
er en mekanisme for synergi, gir det også en mulighet for kjernefysisk fusjon, som fører til produksjon av dattercellene heterogene fra begge foreldrene. Vi sporet skjebnen til kreft-stromal hybridceller for å vurdere den patologiske betydning. RL-1-celler ble ko-dyrket med HPS-14 og HPS-15-celler i 4 uker, og ble deretter behandlet med G418 (200 ug /ml) i 7 dager for å fjerne stromale celler som ikke er involvert i fusjonen. RL-1 celler som knytter seg til disse stromale celler ble fjernet samtidig. De anrikede hybridceller ble samlet opp i enkeltcellesuspensjon, belagt ved begrensende fortynning, og utsatt for kolonidannelse i ytterligere 8 uker.
hybrider delte morfologiske og adferdsmessige funksjoner i løpet av kolonidannelse analysen. I begynnelsen, singulære hybrider oppviste dramatisk utvidet størrelse, de som inneholder to kjerner, som begge viser lignende rød fluorescens (figur 5A). En hybrid kunne overleve i mer enn 4 uker under analysebetingelsene, enige med merket overlevelsespotensial av foreldre stromale celler [11]. Bemerkelsesverdig, hybridceller dukket hvilende, siden ingen celledeling ble sett i løpet av de første 4 ukene av kolonidannelse. Til sammenligning foreldre RL-1 og stromale celler ved denne tiden dannet store kolonier i store størrelser i parallelle kontrollanalysene. Etter 4 uker med kolonidannelse, har mange av hybridcellene vedtatte atypiske morfologier og akkumulerte flere kjerner (figur 5B). Den manglende evne til å dele ut til å være på grunn av mangler i cytokinese snarere enn i DNA-replikasjon.
Representative morfologier av hybridcellene i løpet av kolonidannelse er vist. En, to uker inn i kulturen, de fleste av de hybrider inneholdt to kjerner av tilsvarende fluorescens. Ingen celledeling ble observert. B, Fire uker inn i ko-kulturen, hybridceller innført atypisk morfologi med flere kjerner. Ingen celledeling ble observert. C, Seks uker i kultur, de resterende hybridcellene ble tynn eller smal, med flere kjerner i segmenter av cellen. D, åtte uker inn i kulturen, ble celledeling utbredt. Den celledeling var unormal fordi det produseres datterceller i forskjellige former og med redusert levedyktighet. For hver visning, er en fase kontrast bilde (øverst) og rød fluorescens bilde (nederst) vises. Når det er nødvendig, blir piler brukt for å indikere kjerner. Alle bildene er vist 200 × forstørrelse.
Om lag halvparten av de hybrider omkom 6 uker i kolonidannelse. Selv om årsaken til celledød har ennå ikke definert, er det kjent at fusjon mellom celler med differensialhastigheter på spredning fører til mitotiske katastrofe [26], [27]. Inne i en kreft-stromal hybrid, kan den motstridende kontroll av mitosen av de to kjerner asynchronized resultere enten i en svikt i initiering av celledeling, eller i en unormal mitose og asymmetrisk fordeling. En celle i mitotisk katastrofe dør gjennom genetisk programmert mekanismer [28]. Årsaken til hybrid celledød var sannsynligvis mitotisk katastrofe.
De gjenværende cellene på denne tiden ble krympet, viser en langstrakt form, inneholder flere kjerner i ulike segmenter av cellen (figur 5C). Ingen av disse cellene overlevde til å vokse til kolonier. Spesielt, celledeling synes å bli igangsatt i løpet av mindre enn 5% av de gjenværende hybrider, fordi flertalls cellene begynte å dukke opp i løpet av få kulturbrønner.
celledeling bare ble synlig etter 8 uker. Gitt at bare en liten brøkdel av hybrider levde til denne tid, celledeling var utbredt. Divisjonen er imidlertid først på unormal fordi dattercellene viste innbyrdes avvikende morfologi (figur 5D), og de døde etter hvert. Basert på disse observasjonene og ved å spore 2800 hybrider i 4 gjentatte studier (tabell 1), konkluderte vi med at rektor skjebnen til kreft-stromal hybrider var død. Prostata stromale celler, etter å ha blitt smeltet sammen med kreftceller, kunne fungere som en barriere mot overlevelse av kreftceller.
Sammenlignet med normal motstykke, barrierefunksjonen i kreft-assosiert HPS-15 stromaceller kan være mangelfull, fordi noen hybrider fra fusjon med HPS-15 overlevde og vokste i kolonier. Fra 4 studier av RL-en og HPS-15 co-kultur, var vi i stand til å etablere 9, 6, 12 og 14 kloner fra hver studie (Tabell 1). Den morfologi og vekst av den deriverte celler endret langs kloning prosessen. Generelt celler med flertall kjerner ville forsvinne, de med atypisk morfologi ville omkomme, ville cellestørrelser reduseres, og vekstraten vil øke. Ved tiden klonene vokste inn i en 1 x 10
6 befolkning, som tok 20 seksjoner, vil cellene i et derivat klon vises i en uniform morfologi som var nesten umulig å skille fra de parenkreftceller (figur 6). Det virket som den umiddelbare avkom av kreft-stromal hybrider var ustabil. Den ustabilitet ble imidlertid gradvis tapt under spredning prosessen.
Morfologien av et derivat koloni ble fulgt under kloningsprosessen, som vokser fra en enkelt brønn av en 96-brønners plate til en enkelt brønn i 24- brønners plate, til en enkelt brønn i en 6-brønns plate, og til en 10 cm plate. For hver visning, er en fase kontrast bilde (øverst) og rød fluorescens bilde (nederst) vises. Alle bildene er vist ved 100 × forstørrelse.
5. Androgen uavhengighet avledede kloner fra kreft-stromal fusjon
Vi preget de første 9 avledede kloner hentet fra RL-en fusjon med HPS-15 celler (tabell 1), som ble oppkalt fra RLH15-1 til RLH15 -9. På genomisk nivå, alle kloner mistet helt Y-kromosomer (figur 7A). I stedet for den xxyy karyotype kjent for foreldre RL-1-celler, disse kloner bar en XX karyotype lik den av androgen-uavhengig c4-2 avledede celler i LNCaP avstamning [21]. Selv om disse klonene uttrykte tilsvarende nivåer av AR-protein til foreldre RL-1-celler, noen få (
ie
, klon 1, 6, 8 og 9) som vist påført AR nivåer under androgen deprivasjon (figur 7B), tyde på androgen insensitivitet. Viktigere, alle disse klonene uttrykte markert forhøyede nivåer av PSA, hvorav de fleste var knapt redusert ved androgen deprivasjon (figur 7C), angis androgen uavhengighet. I celle spredning analyser viste alle klonene betydelig økt vekstrater i forhold til foreldre RL-1 celler, mens androgen deprivasjon bare delvis hemmet veksten av disse kloner (figur 7D). Økt AR nivå, PSA produksjon og spredning rate, sammen med ufølsomhet til androgen deprivasjon er vanligvis forbundet med ondartet status. Det virket som de avledede kloner hadde kjøpt flere ondartede egenskaper.
Genotype- og fenotypiske parametere av de første 9 kloner av de RL-1 og HPS-15 fusion hybrider ble sammenlignet med de av de første 12 kloner fra kontroll kloning . Sammenlignet med RL-1 kloner, alle avledede kloner mistet Y-kromosomer (A eller B). Påvist ved Western blotting, noen av de avledede kloner viste vedvarende AR uttrykk selv under androgen-deprivaton (C kontra D). I disse studiene ble cellene dyrket i 48 timer i vanlig dyrkningsmedium (C), androgen deprivasjon medium (-), og androgen deprivasjon medium inneholdende 5 nM R1881 (+). De avledede kloner ble oppdaget å uttrykke økte nivåer av PSA, selv under androgen-deprivasjon (E versus F). Når veksten ble analysert ved MTT konvertering, vises kloner avledet fra kreft-stromal fusjon akselerert vekst i androgen-uavhengig måte (G versus H). Data representerer gjennomsnittet av triplikate bestemmelser. For alle datapunktene, standardavvik var mindre enn 5% av den midlere og er ikke vist.
En lignende studie ble utført med den encellede RL-1-kloner isolert fra en parallell styre koloni -analysen (tabell 1). De første 12 kloner ble undersøkt. Ingen av disse klonene tapt Y kromosomer (figur 7E), og ingen vedvarende AR nivået ble oppdaget ved androgen deprivasjon (figur 7F). Alle disse klonene vises androgen-avhengige PSA produksjon (figur 7G) og vekst (figur 7 H). Resultatene fra denne kontrollen studien antydet at utviklingen av androgen uavhengighet i avledede kloner fra kreft stromal hybrider var et resultat av kreft-stromal fusion, snarere enn klonal avvik i RL-1 celler
per se
.
Diskusjoner
Denne studien utsatt spontan fusjon mellom prostatakreft og stromale celler (figur 1, 2, og 3), og avdekket fusogenecity og dets spontanitet som iboende egenskaper kreftcellene. Mens denne rapporten beskriver spontan fusjon mellom en enkelt RL-en klone og ett par av prostata stromale celler, har vi observert hyppig kreft-stromal fusjon fra co-kulturen i ytterligere 5 røde fluorescerende LNCaP kloner med 3 matchet par av prostata stromal celle linjer som ble etablert og preget tidligere [11];
