Abstract
Termisk sjokk beslektet protein 70 (Hsc70) virker som en molekylær anstand for opprettholdelse av intracellulære proteiner, noe som gjør det mulig for kreftceller for å overleve under proteotoxic stress. Vi forsøkte å bruke Hsc70 å identifisere viktige molekyler i kreft celle overlevelse. Her utførte vi massespektrometri-baserte proteomikk analyse utnytte affinitet rensing med anti-Hsc70 antistoffer; som en følge av dette ble 83 differensielt uttrykte proteiner identifisert i henhold til stressbetingelser. Dette resultatet innebærer at det var en forandring i proteinene som Hsc70 interaksjon som respons på stress. Blant de proteiner identifisert i både serum-utarmet og 5-FU-behandlede betingelser ble Rab1A identifisert som et viktig molekyl for kreftcelleoverlevelse. Hsc70 samhandlet med Rab1A i en anstand avhengig måte. I tillegg vil redusert Hsc70 knockdown nivået av Rab1A og økt nivå av sin ubiquitinering henhold stressbetingelser, noe som tyder på at Hsc70 hindret nedbrytningen av Rab1A denaturert ved belastning eksponering. Vi har også funnet at Rab1A knockdown indusert celledød ved inhibering av autophagosome formasjonen. Rab1A kan derfor bidra til å overvinne proteotoxic fornærmelser, noe som gjør at kreftceller til å overleve under stress forhold. Analyse av Hsc70 interactors gitt innsikt i endringer av intracellulær status. Vi forventer videre studier av Hsc70 interactome å gi en mer helhetlig forståelse av kreft cellefysiologi
Citation. Tanaka M, Mun S, Harada A, Ohkawa Y, Inagaki A, Sano S, et al. (2014) Hsc70 Bidrar til Cancer Cell Survival av Forhindrer Rab1A Nedbrytning under stress betingelser. PLoS ONE 9 (5): e96785. doi: 10,1371 /journal.pone.0096785
Redaktør: Ram Nagaraj, Case Western Reserve University, USA
mottatt: 8 oktober 2013; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 06.05.2014
Copyright: © 2014 Tanaka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet, helt eller delvis, av JSP KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) Grant Numbers 24650637 (Masayuki Shiota) og 23650617 (Hiroshi Iwao), og Grant-in- Støtte til JSP Fellows (24-2543 for Masako Tanaka). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
varmesjokkprotein 70 familien (Hsp70s) er en velkjent gruppe av molekylære anstand som støtter proteinsyntesen
in vivo
, bistå ved sammenfolding av begynnende polypeptider, og hindre dannelsen av tilslag ved å stoppe ikke-spesifikke interaksjoner [1], [2]. I nærvær av misfoldede og denaturerte proteiner, Hsp70s også lette deres refolding eller, i tilfelle av uopprettelig svekket proteiner, deres fjerning av proteinnedbrytingen maskineri i cellen [3] – [5]. Hsp70s uttrykkes på et høyt nivå i kreftceller og spiller en rolle i opprettholdelsen av protein homeostase, som fremmer kreftcellevekst og overlevelse [6], [7]. Hsp70s er også kjent for å være involvert i tumorutvikling, inkludert metastase, invasjon, og medikamentresistens [8] – [11]; som sådan, flere hemmere rettet mot Hsp70s har blitt utviklet som anti-kreft agenter [12] – [15]
Hsc70 er et konstitutivt uttrykt molekylære anstand som tilhører Hsp70 familien.. Det har noen strukturelle og funksjonelle likheter til HSP72. Imidlertid Hsc70, som ikke er indusert ved varmesjokk eller andre påkjenninger, opprett protein homeostase i henhold til både normale og spenningstilstander, mens spennings induserbar HSP72 er viktig for å tillate cellene å takle akutt stress. Hsc70 er rapportert å være involvert i en rekke rengjørings chaperoning funksjoner, inkludert folding av begynnende polypeptider, proteintranslokasjon over membraner, anstand-mediert autophagy, forebygging av proteinaggregering henhold stressbetingelser, og demontering av klatrin-belagte vesikler [16 ]. Derfor kan Hsc70 knockout mus ikke opprettes på grunn av den avgjørende rollen dette proteinet i celleoverlevelse [17].
Kreftceller oppleve flere microenvironmental påkjenninger, som for eksempel hypoksi, næringsmangel, og eksponering for kjemoterapeutiske midler [18 ] – [21]. I tillegg ondartede celler lider av indre spenninger, slik som akkumulering av muterte og ukorrekt foldede proteiner og upassende aktiviteten av deregulerte signalveier, noe som også truer deres overlevelse [22]. Derfor kreftceller trenger for å overvinne proteotoxic stress som oppstår av den intracellulære akkumuleringen av misfoldede proteiner. I likhet med HSP72, er uttrykk for Hsc70 høyere i enkelte kreftcellelinjer enn i normale [23]. Selv Hsc70 er overuttrykt i kreftceller, er lite kjent om hvordan Hsc70 bidrar til kreft celle overlevelse sammenlignet med HSP72. Under normale vekstbetingelser, kan cytoplasmisk Hsc70 bevege seg inn og ut av kjernen. Det er imidlertid konsentrert i kjernen når cellene utsettes for belastninger som varmesjokk. Denne kjernefysisk Hsc70 deretter flytter til cytoplasma under utvinning [24], [25]. Varmen ble også vist å fremkalle hurtig Hsc70 binding til uoppløselige cytoplasmiske strukturer som er distinkt fra cytoskjelettet og indre cellemembranen [26]. Hsc70 fungerer derfor raskt i respons til stress, men er konstitutivt uttrykt. Det er også en forandring i de proteiner som Hsc70 kommuniserer når det utsettes for belastning. Under proteotoxic betingelser, hvis funksjon Hsc70 i å bistå cotranslational folding blir avbrutt, og dette molekylet i stedet letter reparasjon av misfoldede proteiner [27]. Derfor Hsc70 klient proteiner er viktig for cellulær homeostase og er viktige molekyler i stressresponser. Siden Hsc70 er nødvendig for folding av klient proteiner, dets klient-proteiner i henhold til belastningsforholdene er potensielt viktige molekyler for overlevelse av kreftceller.
I denne studien vi utførte masse-spektrometri-baserte proteomforskning analyse benytter affinitetsrensing med anti-Hsc70 antistoffer for Hsc70 interactome profilering av den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HT29. Ved å sammenligne profiler av Hsc70 klient proteiner mellom normale og stress forhold, identifiserte vi molekyler som er potensielt avgjørende for kreft celle overlevelse.
Materialer og Metoder
primære antistoffer og kjemikalier
Antistoffer mot Rab1A, ubiquitin, HSP72, og p62 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer mot alle former av poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) og spaltede former av caspase-3 ble ervervet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot β-aktin og LC3B antistoff ble levert fra Sigma (St. Louis, MO). Anti-Rab1B antistoff ble kjøpt fra Abgen (San Diego, California). HRP-konjugerte sekundære antistoffer ble kjøpt fra GE Healthcare Bio-Science (Lille Chalfont, Bucks, UK). To forskjellige anti-Hsc70 antistoffer anvendt i affinitetsrensing ble fremstilt i vårt laboratorium [25], og anti-Hsc70 antistoff som brukes i de andre forsøkene ble kjøpt fra Enzo (Farmingdale, New York). MG132 ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). 5-fluorouracil (5-FU), og Brefeldin A (BFA) ble oppnådd fra Wako (Osaka, Japan), fortynnet i dimetylsulfoksid (DMSO) og lagret ved -20 ° C.
Cell Culture and eksperimentelle behandlinger
human kolon adenokarsinom-cellelinje HT29 ble innkjøpt fra DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) og opprettholdt i McCoys 5A medium (Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C. Celler ble passert hver syvende dag når du nærmer samløpet. Celler ble behandlet med 3,2 pM (IC
50 ved 48 h) 5-FU eller uten FBS (serum depletion) i seks timer. For masse-spektrometri-baserte proteomforskning ble 10 uM 5-FU benyttes. Alle behandlinger ble utført ved en sluttkonsentrasjon på 0,1% DMSO.
immunblotting og Immunoutfelling
Cellene ble lysert i RIPA-buffer, og proteiner ble isolert fra cellelysater ved immunoutfelling som tidligere beskrevet [28] . For immunoblotting ble proteinene separert på SDS-polyakrylamidgeler under reduserende betingelser, etterfulgt av elektroforetisk overføring til PVDF-membraner som tidligere beskrevet [29]. Membranene ble oppdaget med LAS-4000 Lumino-bilde analysator system (GE Healthcare Bio-Science) ved hjelp av forbedret chemiluminescence teknikk (Immobilon Western HRP Substrate Millipore).
Isolering og proteomikk analyse av Hsc70 Client Proteiner
for massespektrometri-analyse ble cellene vasket med PBS og fiksert med 1% paraformaldehyd ved romtemperatur i 20 minutter, fulgt av bråkjøling med 125 mM glycin. Fikserte celler ble lysert i RIPA-buffer bestående av 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 mM NaF, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,2 mM DTT, og proteasehemmer cocktail. Cellelysater (1 mg protein) ble precleaned med inaktiverte NHS-Sepharose-kuler (GE Healthcare Bio-Science) i en time ved romtemperatur og immunopresipitert med to typer in-house antistoff som er spesifikt for HSC70 immobilisert på NHS-aktivert sefarose ved værelses temperatur i to timer. Immunopresipitatene ble deretter vasket tre ganger med RIPA-buffer, og underkastet avsalting og konsentrering ved hjelp av SDS-PAGE på en 5-20% polyakrylamid gradientgel (Wako), etterfulgt av farging med Quick-CBB (Wako). Gelen ble skåret på skiver av ~ 1 mm tykkelse per kjørefelt. Gelstykkene ble avfarget i 25 mM NH
4HCO
3 og 50% acetonitril, etterfulgt av ytterligere avfarging i 25 mM NH
4HCO
3, 30% acetonitril, og reduksjon i 25 mM NH
4HCO
3 inneholdende 10 mM DTT ved 56 ° C i en time. De reduserte cysteinrester ble deretter alkyleres i 55 mM jodacetamid på 25 mM NH
4HCO
3 og gelbitene ble deretter vasket i acetonitril og tørket. De tørkede gel stykkene ble behandlet med 10 ug /ml trypsin (Trypsin gull, Promega, Madison, WI) i 50 mM NH
4HCO
3 på is i 30 minutter, ble overskuddet fjernet, og fullstendig fordøyelse ble tillatt for å forekomme ved 37 ° C i 18 timer i 50 mM NH
4HCO
3. Prøvene ble avsaltet ved Zip Tips C18 (Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner. Trifluoreddiksyre ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1% og anvendt for nano-væskekromatografi elektrospray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS /MS analyse).
Nanoelectrospray LC-MS /MS analyse og protein Identifikasjon
LC-MS /MS-analyser ble utført på en Dina-AI nano LC system (KYA Technology, Tokyo, Japan) koblet til en QSTAR Elite hybrid massespektrometer (AB Sciex, Concord, Ontario, Canada) gjennom et nanospray ione kilde (AB Sciex). Detaljene i denne analysen er beskrevet andre steder [30]. Datainnsamlingen ble utført ved hjelp Analytiker QS Software 2.0 (AB Sciex) i positiv-ion-modus. Begge datasettene ble behandlet av ProteinPilot hjelp av Paragon ™ søkealgoritmen (AB Sciex). MS /MS-data ble brukt som et søk i NCBI databasen (RefSeq frigjøre 55, september 2012, ftp://ftp.hgc.jp/pub/mirror/ncbi/refseq/) ved å bruke
Homo sapiens
taksonomi filter. Minstekravet for protein identifikasjon ble satt på et protein score på 0,47, tilsvarende et sikkerhetsnivå som er større enn 66% og en falsk funnrate på 1%.
iTRAQ Merking og kvantifisering av protein uttrykk
proteinene fra kontroll eller Rab1A-forstummet celler ble hentet som beskrevet for immunoblotting. Cellelysater ble konsentrert og oppløsningsbuffer (100 mM trietyl-ammonium-bikarbonat, pH 8,0) ble erstattet med mikrokon sentrifugal-filtere med en 3 K molekylvektgrense ultrafiltreringsmembran nominell, etterfulgt av fordøyelse og merking med 4-plex iTRAQ reagenser i henhold standardprosedyrer [31]. Prøvene ble merket som følger: 114, kontroll knockdown; og 115, Rab1A knockdown. Hver prøve inneholdt 100 ug protein. Protein konsentrasjoner ble målt ved BCA proteinanalyse.
RNA interferens
Alle sirnas mot menneskehandel
Hsc70 product: (
HSPA8
),
Rab1A
og
Ran
, og lyddemper negativ kontroll nummer 1 siRNA (Control) ble oppnådd fra Invitrogen. Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ble brukt til å reversere-transfektere sirnas inn celler (sluttkonsentrasjon, 30 nm eller 10 nm) i henhold til produsentens instruksjoner.
MTS Analyser
siRNA-transfekterte celler sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 eller 1 x 10
5-celler per brønn. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene dyrket med serum-utarmet medium eller med 5-FU (3,2 pM) i 24 timer. Levedyktigheten ble bestemt ved å analysere med Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). Absorbans ble målt ved 450 nm med en mikroplateleser.
Apoptose-analysen
siRNA-transfekterte celler ble sådd i 24-brønns plater ved en densitet på 5 x 10
4 celler pr brønn . Etter 48 timer med transfeksjon ble cellene underkastet serum uttømming eller 5-FU behandling i 24 timer. Apoptotiske celler ble identifisert ved nukleær farging med Hoechst 33258 etter fiksering med 0,5% glutaraldehyd i fem minutter ved romtemperatur. Dekk ble montert med Fluorescence Mounting Medium (Dako, Glostrup, Danmark). Fargede celler ble visualisert ved hjelp av en fluorescens mikroskop. (Biozero; Keyence, Osaka, Japan) med en 20 × tørr objektiv
RNA Forberedelse og Real-time revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon Analyse
Total RNA ble isolert fra Hsc70- eller Rab1A-knockdown eller kontrollknockdown celler ved anvendelse av ISOGEN (Nippon Gene reagens, Tokyo, Japan). Revers transkripsjon ble deretter utført ved hjelp av en mikrogram av RNA og en ReverTra Ace qPCR RT Master Mix med gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japan). Real-time PCR-analyse ble utført ved hjelp av en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California) med LightCycler-Faststart DNA Master SYBR Grønn Jeg kit (Roche, Penzberg, Tyskland). RNA nivå ble normalisert ved hjelp av
GAPDH
. Alle data ble analysert ved komparativ C
T ved hjelp av 7500-programvare ver. 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, California).
IncuCyte cellevekst Måling Analyse
Førti-åtte timer etter siRNA transfeksjon, totalt 5 × 10
4 HT29 celler ble sådd ut i 24-brønners plater. Ikke-transfekterte celler ble behandlet med 5 pg /ml BFA eller DMSO ved begynnelsen av målingen. Platen ble inkubert i en IncuCyte kinetisk avbildningssystem (Essen BioScience, Ann Arbor, MI) i en cellekulturinkubator. Bilder ble tatt til fange i fire felt per brønn hver tredje time for å overvåke spredning.
Statistical Analysis
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. Sammenligninger mellom grupper ble gjort ved enveis variansanalyse. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
p
. 0,05
Resultater
Hsc70 er kritisk for Cancer Cell Survival
For å undersøke bidraget av Hsc70 til HT29 celleoverlevelse, utførte vi MTS analysen på Hsc70 knockdown celler (fig. 1a). Sammenlignet med kontrollgruppen, nedsatt Hsc70 knockdown celleviabilitet, som var uavhengig av belastning intensitet. Selv HT29 celler var spesielt motstandsdyktig mot serum sult, Hsc70 knockdown økt følsomhet for serum sult og førte til celledød (Fig. 1B og S1 fig.). Til tross for den påfølgende induksjon av HSP72 som en adaptiv stressrespons (fig. 1C), gjorde HSP72 ikke forhindre celledød indusert av Hsc70 knockdown. Derfor er Hsc70 avgjørende for celleoverlevelse og HSP72 kan ikke helt kompensere for sine tap.
(A) knockdown av Hsc70 redusert kreftcelle levedyktighet. HT29 celler ble transfektert med siRNA for
Hsc70
eller rykke kontroll. Ved 48 timer etter transfeksjon av siRNA, ble cellene underkastet serum sult eller ble behandlet med 5-FU ved den angitte konsentrasjon i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analyse. Datapunkter representerer gjennomsnittet ± S.D. (N = 5). (B) Effekt av Hsc70 knockdown på mobilnettet morfologi. Hsc70 eller kontrollknockdown celler ble behandlet på samme måte som i
A
. Fase kontrast av cellene under serum-matet eller serumfrie forhold 24 timer etter behandling. Scale bar, 200 mikrometer. (C) Hsc70 knockdown indusert kompenserende ekspresjon av HSP72. Ved 48 timer etter transfeksjon av siRNA, ble Hsc70 knockdown eller kontrollcellene utsettes for serum uttømming til 6, 12 eller 24 timer. Etter cellelyse, ble Hsc70 og HSP72 oppdaget av immunblot. SD, serum uttømming.
Analyser av Hsc70 Interactors Identifiserte i Serum-utarmet og 5-FU-behandlede HT29 celler
Som en rekke spenninger indusere intracellulær akkumulering av misfolded og denaturert proteiner, Hsc70 binder seg til og refolder disse skadede proteiner. Denne funksjonen Hsc70 tillater celler for å overleve under proteotoxic påkjenninger. Dermed forsøkte vi å analysere Hsc70 interactors under stress forhold for å identifisere viktige molekyler for kreft celle overlevelse. Et flytdiagram av identifikasjonen av Hsc70 interactors er vist i fig. 2A. HT29-celler ble eksponert for serum uttømming eller 5-FU, og også behandlet med DMSO som vehikkelkontroll i 6 timer. Profilering av Hsc70 interactors i kreftceller ble utført ved hjelp av isolasjon Hsc70 affinitet kuler, etterfulgt av massespektrometri basert identifikasjon. Totalt 124 unike proteiner ble identifisert på 95% konfidensintervall (Fig. 2B og tabell S1). Av disse ble 41 proteiner som er unike for bilen kontroll involvert i normale homeostatiske prosesser. Gene ontologi (GO) analyse viste at disse proteinene var involvert i mitokondrie energiproduksjon, cytoskjelettet, og proteinsyntesen. Blant de gjenværende proteiner, 30 proteinene er unike for serum uttømming var spesielt involvert i protein transport, proteinsyntese, og cellesyklusen, mens 29 proteinene er unike for 5-FU behandling ble ofte assosiert med glukosemetabolisme. Disse resultatene indikerer at det var en forandring i proteinene som Hsc70 interaksjon som respons på forskjellige typer stress. Derfor reflekterer Hsc70 interactome stimuleringsavhengige endringer i respons på stress, og kan brukes til å overvåke de fysiologiske forandringer i cellene. Vår analyse også identifisert et begrenset antall proteiner som var vanlig i både stressbetingelser, som var involvert i mitokondriene, cytoskjelettet, og protein transport. Av disse fokuserte vi på Rab1A i Ras-superfamilien, som uttrykkes på et høyt nivå i kreftceller. Dette molekylet regulerer viktige cellulære prosesser som signaloverføring, celleformering, og vesikkeltransport (Fig. 2B og Tabell S2).
(A) Et skjematisk riss av identifikasjon av Hsc70 interactors. Celler ble eksponert for serum uttømming (SD), 5-FU, eller DMSO i 6 timer. Hsc70 interactors ble isolert med anti-Hsc70 antistoffer fra celleekstrakt, og ble identifisert ved etterfølgende analyse ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS /MS). (B) Identifisering og funksjonell klassifisering av Hsc70 interactors som var knyttet til endringer i stressrespons. En Venn-diagram som viser Hsc70 interactors som ble identifisert i 95% konfidensintervall score (1,3 ProtScore) med ProteinPilot 2.0-programvaren. Kolonne grafer viser antall og funksjonalitet identifiserte proteiner.
Rab1A knockdown forverret Stress Skader ved Serum Nedbryting og 5-FU behandling
For å utvide våre proteomikk funn, vurderte vi neste bidraget av Rab1A til kreft celle overlevelse. Sammenlignet med kontroll transfeksjon, Hsc70 knockdown redusert koloni størrelse, uten noen endring av cellulær morfologi (fig. 3A). Imidlertid Rab1A knockdown skyldes dempningen av celle-celle adhesjon og markant redusert cellenummer, som ble forsterket av serum uttømming. For å kvantifisere effekten av Rab1A knockdown, utførte vi MTS analysen (fig. 3B). Celler ble sådd ut ved 1 x 10
5 per brønn i 96-brønners plater for å eliminere påvirkningen av celleproliferasjon. Både serum uttømming og 5-FU-behandling hadde liten virkning på levedyktigheten til kontrollcellene, hvilket indikerer at disse behandlingene bare utgjøres mild spenning for cellene. Sammenlignet med kontrollceller, Hsc70 knockdown betydelig redusert celleviabilitet (
p
0,01) til tross for mild stresset eksponering. Dette viser at Hsc70 knockdown-indusert celledød i henhold til stressbetingelser, som også antydet i fig. 1A og B. Men Rab1A knockdown betydelig redusert celleviabilitet (
p
0,05) uten belastning eksponering, videre indikerer at Rab1A knockdown alene indusert celledød under normale forhold. Videre, til tross for mild karakter av disse spenninger, serum uttømming og 5-FU-behandling ytterligere redusert levedyktighet Rab1A knockdown celler. Disse resultatene indikerer at Rab1A bidrar til celle overlevelse og er svært viktig under stress forhold som er utenfor evne Hsc70 å sikre celle overlevelse.
HT29 celler transfektert med
Hsc70
,
Rab1A
, eller
kontroll
siRNA ble utsatt for serum uttømming, 5-FU, eller kjøretøy behandling i 24 timer. (A) Effekter av undertrykkelse av Hsc70 og dens interactors på cellulær morfologi. Representative fase kontrast av celler. Scale bar, 100 mikrometer. (B) Rab1A knockdown redusert celle levedyktighet. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analyse. Stjerner indikerer statistisk signifikans. **,
p
0,01, *,
p
0,05 vs. kjøretøy;
†
p
0,05 vs. kontroll knockdown av to-veis ANOVA etterfulgt av Tukey-Kramer post hoc test; Verdiene er gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 7). Veh, kjøretøy. SD, serum uttømming. FU, 5-fluorouracil.
Hsc70 Forhindret Rab1A Nedbrytning
For å undersøke effekten av Hsc70 på Rab1A under stress forhold, vi fokusert på samspillet mellom disse to molekyler. Vi bekreftet den fysiske interaksjonen mellom endogen Hsc70 og Rab1A av co-immunoutfellingsstudier analyser med kommersielle antistoffer (fig. 4A). Dette bekreftet resultatene av massespektrometrisk analyse som Hsc70 interaksjon med Rab1A under serum utarmet betingelser. Vi videre bekreftet at Hsc70 samhandlet med Rab1A i en anstand avhengig måte fordi Hsc70 og Rab1A ble disassociated fra hverandre av ATP. Vi fant også at Hsc70 dannet homodimerer, men Rab1A ikke. Sekundær eluering i SDS prøvebuffer for de resterende proteinene er bundet til agarosekuler ble utført for å påvise de agn proteinene fordi ATP ikke interfererer med antigen-antistoff-interaksjonen. Deretter evalueres vi Rab1A nivå når Hsc70 ble undertrykt; Det viste en nedgang i henhold til stressbetingelser til tross for en kompenserende økning av HSP72-nivå (Fig. 4B). Imidlertid Hsc70 knockdown hadde ingen effekt på Rab1A nivå under kontrollbetingelsene. Denne nedregulering av Rab1A henhold spenningsforhold ble observert på proteinnivået, men ikke på mRNA-nivå (fig. 4C). Hsc70 ble derfor vist seg å ikke regulere Rab1A syntese, minst. Vi fant at ved Hsc70 undertrykkelse økt nivå av ubiquitinmolekyler Rab1A under serum utarmet betingelser (Fig. 4D). Videre ble Rab1A nedbrytning som ble indusert ved Hsc70 knockdown etter stressbetingelser hemmet av proteasominhibitor MG132 (fig. 4E). Til sammen tyder disse resultater på at Hsc70 forhindrer nedbrytningen av Rab1A som har blitt misfoldede henhold stressbetingelser.
(A) Hsc70-Rab1A interaksjon gjennom anstand aktivitet. HT29-celler ble utsatt for uttømming serum i 24 timer, og deretter lysert. Hvis du vil kontrollere samspillet mellom Hsc70 og Rab1A i en anstand avhengig måte, ble anti-Hsc70 eller anti-Rab1A immunoprecipitant eluert med ATP, etterfulgt av eluering med SDS prøvebuffer og immunoblotting for å bekrefte agn proteiner. (B) Hsc70 knockdown redusert nivået av Rab1A proteinet under stressbetingelser. HT29-celler transfektert med
Hsc70
eller
kontroll
siRNA ble utsatt for serum uttømming, 5-FU, eller kjøretøy behandling i 24 timer. Immunoblotting for endogen Rab1A og Hsc70 proteiner. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) Hsc70 knockdown ikke redusere
Rab1A
mRNA nivå. Etter knockdown av Hsc70 og i kontrollen,
Rab1A
mRNA nivåer ble bestemt ved qPCR på 48 timer etter transfeksjon. (D) Hsc70 knockdown fremmet ubiquitinering av Rab1A. Etter Hsc70 knockdown eller kontrollceller ble lysert, ble immunutfelling (IP) med anti-Rab1A eller anti-ubiquitin-antistoffer utført, etterfulgt av immunblotting med anti-ubiquitin eller anti-Rab1A antistoffer. (E) MG132 behandling hemmet Rab1A degradering. Hsc70 knockdown cellene ble utsatt for serum uttømming eller 5-FU behandling, og deretter MG132 (10 mm) eller kjøretøy ble lagt for den siste 8 timer før prøvetaking. SD, serum uttømming. FU, 5-fluorouracil. Ub, ubiquitin, IgG LC, immunglobulin lett kjede. Data (unntatt i C) er representative for minst to separate eksperimenter som ga lignende resultater.
Rab1A knockdown celledød er ikke fra apoptose
For å undersøke om fravær av Rab1A induserer apoptose, vi undersøkte tilstedeværelse av apoptotiske celler ved atom farging med Hoechst 33258. Ran, et medlem av Ras super, samhandlet med Hsc70 under alle forhold i henhold til vår proteomikk analyse (tabell S2). Ran knockdown ble utført som en positiv kontroll for apoptose. Ran knockdown celler utstilt apoptotisk kjernefysisk fragmentering uavhengig av serum utarming, mens Rab1A knockdown celler utstilt eneste liten apoptose når de utsettes for serum mangel (Fig. 5A). Ved telling av Hoechst-fargede celler og de med atom fragmentering, ble Rab1A knockdown funnet å redusere celletallet i samme grad som Ran knockdown (Fig. 5B). Men apoptose ble markert indusert av Ran knockdown, men ikke av Rab1A knockdown (Fig. 5C). Fordi vi også gjorde ikke oppdage typiske PARP-1 og caspase-3 apoptotiske signaturer på Rab1A knockdown (Fig. 5D), celledød forverret av Rab1A knockdown ble vist ikke å være ansvarlig for apoptose. Dermed disse resultatene tyder på at Rab1A knockdown-indusert celledød er ikke fra apoptose.
HT29 celler transfektert med
Hsc70
,
Rab1A
,
Ran
eller
kontroll
siRNA ble utsatt for serum uttømming, 5-FU, eller kjøretøy behandling i 24 timer. (A) Rab1A knockdown hadde liten effekt på induksjonen av apoptose. Induksjonen av apoptose ble analysert ved farging med Hoechst 33258. hvite pilspisser angir apoptotiske kjerner med kondensert kromatin. Scale bar, 50 mikrometer. (B, C) Nedgangen i celle nummer av Rab1A knockdown var ikke på grunn av apoptose. Totale antallet celler og apoptotiske celler ble kvantifisert ved telling av Hoechst-fargede celler og celler med atomkondensering i (A), henholdsvis. *,
p
0,05, **,
p
0,01 vs. kontroll /kjt;
†
p
0,05,
††,
p
0,01 vs. kontroll /SD;
##
p
0,01 vs. Rab1A /SD av to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni /Dunn post hoc test; Verdiene er gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 3). (D) Rab1A undertrykkelse ikke indusere apoptose. Apoptose ble bestemt ved de spaltinger på PARP-1 og caspase-3, påvist ved immunblotting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Veh, kjøretøy. SD, serum uttømming. FU, 5-fluorouracil. Immunoblotting data er representative for minst tre separate forsøk som ga lignende resultater.
Kvantitativ Differential Proteomics i Rab1A knockdown Cells
For å undersøke hvorfor fraværet av Rab1A indusert celledød ikke inkludert apoptose, vi utført kvantitativ differensial proteomikk analyser av Rab1A knockdown celler basert på iTRAQ teknikk. De iTRAQ-merkede proteiner som var blitt utvunnet fra Rab1A knockdown-celler ble analysert og sammenlignet med den proteomet av kontrollceller. Som et resultat ble 25 proteiner med en endring av ekspresjon av ≥1.2 ganger anses å være oppregulert, mens 27 proteiner med en endring 0,8-gangers ble nedregulert (tabell S3). For å evaluere de funksjonelle forskjellene mellom disse to undergrupper av proteiner, utførte vi GO analyse (Fig. 6A og B). De oppregulert proteiner ble klassifisert i kategorier av protein transport, mitokondrier, og proteasome, mens klassifisering i henhold til vilkårene ribosom og transkripsjon /translasjon var spesielt vanlig blant downregulated proteiner. Disse resultatene antydet at Rab1A knockdown økte nivåene av andre proteiner som er involvert i endoplasmatiske retikulum (ER) -Golgi menneskehandel, men førte ikke til erstatning for Rab1A funksjon. Dysfunksjon i Rab1A lettes proteindegradering og stoppet proteinsyntese, noe som indikerer at Rab1A knockdown i celler indusert akkumulering av misfoldede proteiner. Derfor kan Rab1A knockdown celler utsettes for proteotoxic stress, som senere induserer celledød.
HT29 celler ble transfektert med siRNA for
Rab1A
eller rykke kontroll. Protein identifikasjon i Rab1A knockdown celler ble utført gjennom kvantitative proteomikk av stabile isotoper merking, ved hjelp iTRAQ. (A) oppregulert proteiner med iTRAQ forholdet ≥1.2. (B) downregulated proteiner med iTRAQ forholdet. 0,8
Rab1A-knockdown celledød ble forårsaket av Hemming av Autophagy men ikke ER-Golgi Trafikk
Siden Rab1A er involvert i ER-Golgi trafikk, ved siden undersøkte vi om avbrudd av denne trafikken induserer celledød. Selv om behandling med BFA, en inhibitor av ER-Golgi trafikk, indusert celledød, morfologi av døende celler var vesentlig forskjellig fra den ved Rab1A knockdown (Fig. 7A og B). Fordi BFA er også kjent som en ER stress-indus er BFA behandling spådd å bevirke den intracellulære akkumuleringen av misfoldede og denaturerte proteiner. Derfor vi neste undersøkt induksjon av autophagy. Som forventet, BFA behandling indusert LC3B-II, mens Rab1A knockdown ikke. Rab1A knockdown dessuten ført til akkumulering av p62, som kan binde LC3, og dermed tjener som en selektiv substrat av autophagy (Fig. 7C). Når Rab1A ble undertrykket, mRNA nivået av Rab1B øket to ganger, mens dens proteininnhold hadde en tendens til å øke noe (fig. S2A og B). Rab1A kan derfor ha en unik ukjent funksjon som Rab1B mangler eller de totale nivåer av Rab1A og Rab1B kan reduseres under terskelen som er nødvendig for celleoverlevelse når Rab1A ble undertrykket. Videre, siden Hsc70 knockdown indusert LC3B-II som tillot LC3B å bli assosiert med autophagic vesikler, det gjorde ikke påvirke dannelsen av autophagosomes, i motsetning til Rab1A knockdown (Fig. 7D). 2B.
