Abstract
Bakgrunn
Host T-celle responser er assosiert med gunstige utfall i ovarialcancer (EOC), men det er fortsatt uklart hvordan man best kan fremme disse svarene hos pasienter. Mot dette målet, evaluert vi et panel av klinisk relevante cytokiner for evnen til å forbedre flere T-celle effektorfunksjoner (polyfunksjonalitet) i den opprinnelige svulsten miljø.
metodikk /hovedfunnene
Eksperimenter var utføres med bosatt CD8 + og CD4 + T-celler i bulk ascites cellepreparater fra høyverdig serøs EOC pasienter. T-celler ble stimulert med α-CD3 i nærvær av 100% autologt ascites fluid med eller uten eksogent IL-2, IL-12, IL-18 eller IL-21, alene eller i kombinasjon. T-celle-proliferasjon (Ki-67) og funksjon (IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCI4, og CD107a ekspresjon) ble bestemt ved multi-parameter flowcytometri. Parallelt ble 27 cytokiner målt i kultursupernatantene. Mens ascitesvæske hadde varierende virkninger på CD8 + og CD4 + T-celle proliferasjon, det hemmet T-cellefunksjon i de fleste pasientprøver, med CD107a, IFN-γ, og CCI4 som oppviser den største hemming. Dette ble fulgt av reduserte nivåer av IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, Mip-1α, PDGF-BB, bFGF og i kultursupernatanter. T-celleproliferasjon ble forsterket av eksogent IL-2, men andre T-cellefunksjoner ble i stor grad upåvirket av enkelt cytokiner. Kombinasjonen av IL-2 med cytokiner inngrep med komplementære signalveier, spesielt IL-12 og IL-18, økt ekspresjon av IFN-γ, TNF-α, og CCI4 i alle pasientprøver ved å fremme polyfunksjonelle T-celle responser. Til tross for dette, andre funksjonelle parametere generelt vært hemmet.
Konklusjon /Betydning
EOC ascites miljø forstyrrer flere T-cellefunksjoner, og eksogene cytokiner engasjerende ulike signalveier bare delvis reversere disse effektene. Våre resultater kan forklare den begrensede effekten av cytokin terapi for EOC til dags dato. Full restaurering av T-cellefunksjon vil kreve aktivering av signalveier utover de som er engasjert ved hjelp av IL-2, IL-12, IL-18 og IL-21
relasjon:. Tran E, Nielsen JS, Wick DA , Ng AV, Johnson LDS, Nesslinger NJ, et al. (2010) polyfunksjonelle T-celle responser blir forstyrret av eggstokkreft Ascites Miljø og bare delvis restaurert ved klinisk relevante cytokiner. PLoS ONE 5 (12): e15625. doi: 10,1371 /journal.pone.0015625
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 13 august 2010; Godkjent: 19 november 2010; Publisert: 22.12.2010
Copyright: © 2010 Tran et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av British Columbia Cancer Foundation, United States Department of Defense, og naturvitenskap og Forskningsrådet Canada. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tallrike studier i det siste tiåret har vist at immunsystemet påvirker kliniske utfall hos pasienter med høy grad av serøs epitelial eggstokkreft (heretter kalt EOC). Nærmere bestemt, er tilstedeværelsen av tumor-infiltrerende CD8 + T-celler assosiert med forlenget sykdomsfri og total overlevelse [1], [2]. Videre er forhøyede mengder CD56 + -T-celler i ascites rommet korrelert med øket følsomhet platina [3]. Mer nylig, ascitesvæske inneholdende forhøyede nivåer av IL-17 (et cytokin som hovedsakelig produseres av Th17 og andre effektor-T-celler [4]) ble korrelert med øket total overlevelse [5]. Sammen utgjør disse studiene tyder på at forsterke den endogene T-cellerespons for å EOC kan være av klinisk fordel for pasienter. Inneholder imidlertid ovarian tumor miljø mange immunsuppressive celletyper og faktorer som kan motsette anti-svulst T-celle responser. Følgelig er forhøyede antall av tumorassosierte regulatoriske T-celler (Tregs) og makrofager assosiert med dårlig overlevelse i EOC [1], [2]. Mange vannløselige immunsuppressive faktorer er også funnet i ascites, inkludert IL-10, TGF-β, VEGF, B7-H1 /PD-L1, B7-H4, SDF-1, EBAG9 /RCAS1, Fas-ligand, og løselig IL-2-reseptor [1], [2].
den heterogenitet av immundempende mekanismer i EOC presenterer en formidabel utfordring for immunterapi, som det tyder på at flere immunsuppressive mekanismer kanskje trenger å bli reversert for å gjenopprette T-cellefunksjon. For eksempel er treg uttømming blir vurdert som et middel for å forbedre immunitet mot flere humane cancere [6], inkludert EOC [7], men i beste fall ville bare reversere en mekanisme av immunsuppresjon, slik at andre immunologiske barrierer intakt. Snarere enn å forsøke å deaktivere disse barrierene én etter én, ville en mer pragmatisk klinisk tilnærming være å levere faktorer som kan grovt overstyre immunsuppressive barrierer i svulsten miljø. Således kan identifisere de signaler eller tilstander som fremmer T-celleresponser i EOC miljø fører til mer effektive immunterapeutiske strategier.
For å oppnå dette har vi tidligere utviklet en musemodell for EOC som tillater funksjonell vurdering av CD8 + T celle responser i eggstokktumor miljøet [8]. Nærmere bestemt har vi utviklet en murin tumor EOC linje for å uttrykke en CD8 + T-celle-epitop fra modellen antigen ovalbumin. Mus med avanserte, spres svulster med omfattende ascites ble behandlet av adoptiv overføring av CD8 + T-celler spesifikke for ovalbumin epitop. Bemerkelsesverdig, adoptivt overført CD8 + -T-celler gjennomgikk under kraftig spredning ikke bare i lymfeknuter og perifert blod, men også i ascites og tumor avdelinger. Faktisk, på toppen av responsen, de overførte T-cellene utgjøres opptil 40% av CD8 + -T-celler i perifert blod, og opp til 96% av CD8 + T-celler i ascites. Dette dyp proliferative respons ble etterfulgt av en rask og nesten fullstendig tumorregresjon hos de fleste dyr, viser at T-cellene var funksjonelt aktive. Viktigere, spredning og anti-tumor-aktivitet av de overførte CD8 + -T-celler var fullstendig avhengig av IL-2 /IL-15 signalisering, som demonstrert ved genetisk forstyrrelse av IL-2-reseptor alfa (CD25) eller beta (CD122) underenheter [ ,,,0],8]. Dermed, selv i omgivelser av avanserte ovarietumorer, CD8 + T-celler montert potente anti-tumorrespons, forutsatt at IL-2 /IL-15 signalveier var intakt.
De foregående resultatene reist spørsmålet om cytokiner slike som IL-2 kan tilsvarende overstyre de immunsuppressive effekter av ascites i menneskelig EOC. Foregå
i
studier med humane EOC prøver vitro har vist at IL-2 kan delvis gjenopprette lymfokin-aktiverte dreper (LAK) celle cytotoksisitet i nærvær av 50% ascites fluid, mens kombinasjonen av IL-2 med TCR stimulering [9] eller IL-12 [10], [11] fullt ut gjenopprettes LAK cytotoksisitet. Men bruk av 50% ascites-væske alene ikke fullt ut rekapitulere ovarial tumor miljø, som også inneholder immunosuppressive celletyper som for eksempel Tregs og MDSCs [1], [2]. Videre er Laks hovedsakelig består av NK-celler, som kan påvirkes forskjellig av ascites i forhold til T-celler. I tillegg er disse tidligere studier målt cytotoksisitet ved masse LAK-cellepreparater og dermed ikke belyse virkningene av cytokiner på forskjellige T-celleundersett. Til slutt,
in vitro
cytotoksisitet er bare ett aspekt av T-cellefunksjon og ikke alltid korrelerer med effektive T-celle responser
in vivo product: [12].
Det er økende forståelse av betydningen av polyfunksjonelle T-celler (dvs. T-celler som samtidig kan utføre flere funksjoner) i effektive immunresponser [13]. Spesielt er polyfunksjonelle T-celle-responser assosiert med beskyttende immunitet etter vaksinering mot kopper (vaccinia-virus) [14], gul feber [15], tuberkulose [16], [17], og leishmaniasis [18]. Forhøyede mengder polyfunksjonelle T-celler er også korrelert med gode resultater i en rekke forskjellige sykdoms innstillinger, inkludert HIV /AIDS [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] , [26], [27], [28], [29], hepatitt C [30], og lymfocyttiske choriomeningitt [31]. I innstillingen av kreft, har flere studier funnet forbedrede antall kreftspesifikke flerfunksjonene T-celler hos pasienter som responderte positivt på ulike former for immunterapi, inkludert adoptiv T-cellen terapi, α-CTLA-4 antistoff terapi og kreftvaksiner [32] , [33], [34], [35], [36].
i den foreliggende undersøkelse, vurderte vi for første gang virkningene av det menneskelige EOC ascites miljø på T-celle-polyfunksjonalitet. Vi evaluerte også evnen til IL-2 og tre andre klinisk relevante cytokiner (IL-12, IL-18 og IL-21) for å gjenopprette et bredt spekter av T-cellefunksjoner. Vi fant ut at ascites hemmet flerfunksjonene svar av både CD4 + og CD8 + T-celler, med noen funksjoner som viser større hemming enn andre. Videre ble bare et undersett av T-cellefunksjoner gjenopprettet ved eksogene cytokiner levert alene eller i kombinasjon. Således vil full restaurering av T-cellefunksjon i EOC krever aktivering av signalveier utover de som er engasjert ved hjelp av IL-2, IL-12, IL-18 og IL-21.
Resultatene
EOC ascites forstyrrer flere T-celle funksjoner
Primære ascites prøver ble innsamlet fra pasienter med høyverdig serøs EOC (tabell 1). For å modellere den native ascites tumormiljøet så tett som mulig
in vitro
, analyserte vi bulk ascites cellepelletene, som i tillegg til CD8 + og CD4 + -T-celler, som finnes resident tumorceller, Tregs, B-celler, NK-celler, og CD14 + celler (tabell 2). Videre ble cellene dyrket i 100% autologt ascitesvæske å ta med eventuelle løselige faktorer, slik som TGF-β, IL-10, og VEGF (tabell 2), som kan påvirke T-cellefunksjon. På grunn av mangelen på veldefinerte T-celleantigener i eggstokkreft, stimulert vi kulturer med α-CD3 antistoff, som skal stimulere både effektor og regulatoriske undergrupper. Således ble hver pasient T-celler analysert i nærvær av det fulle komplement av naturlig forekommende kreftceller, immunosuppressive celler og løselige faktorer.
Vi har nylig demonstrert i en murin modell av det EOC ascites miljø kan være meget ettergivende for T-celle proliferasjon [8]. For å se om dette gjaldt også i humane EOC prøver, testet vi effekten av ascitesvæske på T-celleproliferasjon. Som vist i fig. 1A, ascitesvæske hadde sterkt varierende effekt på CD8 + T-celleproliferasjon (som målt ved hjelp av Ki-67 ekspresjon), som strekker seg fra sterk hemming (1/5 pasienter) til forbedring av proliferasjon (2/5 pasienter). Generelt ble tilsvar tendenser sett for CD4 + T-celler (data ikke vist). Således, som foreslått av våre studier murine [8], er det menneskelige EOC ascites miljø ikke universelt undertrykkende og i noen tilfeller kan øke T-celleproliferasjon.
Masse ascites-celler ble stimulert med plate bundet α-CD3 i media eller 100% autologe ascitesvæske i 48 timer. (A) proliferasjon og funksjon av CD8 + -T-celler i nærvær av media eller autologe ascitesvæske (øvre panel) ble vurdert ved å måle ekspresjonen av Ki-67, CD107a, CCI4, IFN-γ, TNF-α, og IL-2 etter flowcytometri. (B) Virkning av IL-2 (andre flaten), IL-12 (tredje panel), og IL-21 (fjerde panel) på CD8 + T-celle-proliferasjon og forskjellige funksjoner, i nærvær av autologt ascitesvæske. Data er blitt normalisert til a-CD3 stimulerte celler i media (dvs. medier verdier ble subtrahert fra hvert stimulering tilstand). * Det var en signifikant effekt av cytokin for å øke den angitte funksjon i forhold til celler stimulert i media (Wilcoxon matchet parvis t-test, p 0,05).
Vi neste fastslått om andre T-celle funksjoner var tilsvarende påvirket av eggstokkene ascites. Flowcytometrisk analyse ble brukt for å vurdere fem vanlig brukte markører for T-cellefunksjon: IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCI4, og CD107a [13], [14], [19], [20], [ ,,,0],21]. De første fire markører er cytokiner som er involvert i T-celle proliferasjon eller effektorfunksjon, mens CD107a blir uttrykt på overflaten av T-celler som gjennomgår cellulær degranulering og således tjener som en markør for cytotoksisitet [13]. I 4/5 pasientprøver, ascitesvæske forårsaket en dramatisk inhibering av CD107a ekspresjon av CD8 + T-celler (fig. 1A), som ble ledsaget av reduserte nivåer av granzyme B i kultursupernatantene (Supp. Fig. S1A), noe som indikerer ascites miljø generelt hemmer T-celle degranulering. CCI4 og IFN-γ ekspresjon ble også inhibert av ascites i majoriteten av prøver (Fig. 1A). T-celler som uttrykker IL-2 og TNF-α var relativt sjeldne, og var minimalt påvirket av ascitesvæske i de fleste tilfeller (fig. 1A). Lignende resultater ble oppnådd med CD4 + T-celler (data ikke vist). Intriguingly, effekten av ascites på T-celle proliferasjon og andre T-celle-funksjoner var stort sett frakoplet. For eksempel, med pasientprøver IROC008 og IROC036, ascitesvæske forbedret både CD8 + og CD4 + T-celle proliferasjon, men inhiberte ekspresjon av CD107a, CCI4, og IFN-γ (Fig. 1A, og data ikke vist). Således har ascitesvæske vidt varierende effekter på T-celle-funksjoner mellom pasientprøver, i samsvar med den heterogene natur av EOC.
For ytterligere å karakterisere virkningene av ascitesvæske på immunfunksjon, kultursupernatantene fra de ovennevnte eksperimenter ble evaluert ved å multiplekse bead-analyser for ekspresjon av et fleksibelt panel av cytokiner i forbindelse med immunologiske og inflammatoriske prosesser. Av 27 cytokiner ble testet, ni (IL-1, IL-1RA, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, Mip-1α, PDGF-BB, og bFGF) ble inhibert av ascitesvæske i forhold til media i alle 5 pasientprøver (Supp. fig. S1B). Ascitesvæske hadde varierende virkninger på de gjenværende cytokiner (data ikke vist). Selv om multipleks bead analyser ikke gir informasjon angående cellulær kilde (r) av cytokiner, resultatene likevel understreke de brede virkningene av ascites fluid på cytokin miljøet i EOC.
selv om en systematisk evaluering av de utallige immunsuppressive faktorer i EOC [1], [2] var utenfor rammen av denne studien, gjorde den mulige påvirkning av Tregs, TGF-β, IL-10, og VEGF. Prosentandelen av Tregs varierte fra 2,5% til 6,8% av totale celler, men viste ingen signifikant korrelasjon med graden av inhibering av T-celleproliferasjon, eller CD107a, CCI4, IFN-γ, TNF-α, og IL-2-ekspresjon; på samme måte, nivåene av TGF-β, IL-10, VEGF og i ascites fluid ikke signifikant korrelert med graden av T-celle-inhibering (tabell 2; Pearson korrelasjon p 0,05 for alle sammenligninger). Disse resultatene understreker den komplekse immunobiology av ovarial tumor miljø i at graden av immunsuppresjon korrelerte ikke med disse vanlige immunsuppressive faktorer.
Eksogene cytokiner bare delvis gjenoppretter T-cellefunksjon i EOC ascites miljø
i vår musemodell for EOC, IL-2 /IL-15 signalisering var kritisk for CD8 + T-celle-proliferasjon og funksjon i ascites [8]. Men de foregående forsøkene viste at de aller fleste av T-celler i EOC ascites ikke uttrykte detekterbare nivåer av IL-2. Dette førte oss til å spekulere at tilsetningen av IL-2 til kulturene kan gjenopprette T-celle proliferasjon og funksjon. For å teste dette ble bulk ascitesceller stimulert med α-CD3 i nærvær av 100% ascitesvæske med eller uten eksogent IL-2 og T-celle-proliferasjon og funksjon ble målt 48 timer senere. I 4/5 pasientprøver, IL-2 reversert fullt ut virkningene av ascites på T-celleproliferasjon og faktisk induserte responser som er større enn de som er sett i komplett medium (Fig. 1B). I motsetning til IL-2 hadde liten effekt på ekspresjonen av CD107a, CCI4, IFN-γ, eller IL-2 for de fleste pasientprøver, selv om det forårsaket en svak, men statistisk signifikant, økning av TNF-α ekspresjon (Fig. 1B). Således, IL-2 alene forbedret T-celle proliferasjon men, generelt, hadde neglisjerbare virkninger på andre funksjoner.
neste spørsmål om inngrepet av andre signalveier kan bedre styrke T-cellefunksjon. Mens IL-2 aktiverer primært STAT5 veien, den tilhørende cytokin IL-12 aktiverer STAT4 veien, noe som har vist seg å øke T-cellefunksjonen i forskjellige fysiologiske innstillinger [37]. Når tilsatt til EOC kulturer, IL-12 alene hadde bare liten effekt på proliferasjonen eller funksjon av CD8 + T-celler i de fleste pasientprøver (fig. 1B). Vi evaluerte neste IL-21, som hovedsakelig aktiverer STAT1 og Stat3 trasé [38]. I likhet med IL-12, IL-21 hadde bare begrensede effekter på T-celle proliferasjon eller funksjon (Fig. 1B). . Generelt ble lignende trender sett med CD4 + T-celler (data ikke vist)
Reasoning at et bredere grad av funksjonell forbedring kan oppnås ved samtidig aktivering av flere STAT veier, vurdert vi to kombinasjoner av cytokiner: a) IL-2 + IL-12, og b) IL-2 + IL-12 + IL-21. Viktigere, vil den sistnevnte kombinasjon teoretisk aktivere alle STAT veier som er relevante for CD8 + T-celle-responser (dvs. STAT1, STAT3, STAT4, og STAT5). Generelt begge cytokin kombinasjoner indusert T-celleproliferasjon i likhet med det som ses med IL-2 (sammenlign fig. 2 med fig. 1B). Spesielt imidlertid, CD8 + T-celler fra IROC028, som ikke klarte å proliferere som reaksjon på en enkelt cytokin (Fig. 1B), prolifererte i respons til begge cytokin-kombinasjoner (fig. 2). Videre har begge cytokin kombinasjoner var beskjedent mer effektive enn enkelt cytokiner ved å øke IFN-γ og TNF-α produksjon (fig. 2). Til tross for dette, verken cytokinet kombinasjon forsterket ekspresjon av CD107a eller IL-2 (fig. 2). Lignende resultater ble oppnådd med CD4 + T-celler, selv om effektene av cytokiner var generelt svakere (data ikke vist). Oppsummert tillegg av cytokin kombinasjoner engasjere et bredt spekter av STAT signalveier mislyktes i å fullt gjenopprette T-cellefunksjon i EOC ascites miljø.
Bulk ascites celler ble stimulert med plate bundet α-CD3 i media eller 100% autologt ascitesvæske i 48 timer. Proliferasjon og funksjon av CD8 + -T-celler i nærvær av media, autologt ascitesvæske (øvre panel) eller ascites fluid i nærvær av IL-2 + IL-12 (midtre panel), eller IL-2 + IL-12 + IL -21 (nedre panel) ble vurdert ved å måle ekspresjonen av Ki-67, CD107a, CCI4, IFN-γ, TNF-α, og IL-2 ved strømningscytometri. Data er blitt normalisert til a-CD3 stimulerte celler i media (dvs. medier verdier ble subtrahert fra hvert stimulering tilstand). * Det var en signifikant effekt av cytokin kombinasjon for å styrke den angitte funksjon i forhold til celler stimulert i media (Wilcoxon matchet parvis t-test, p 0,05).
Til slutt, vi vurdert om aktivering av ikke -STAT signalveier kan ytterligere forsterke T-cellefunksjon. For å oppnå dette, vurderte vi cytokin IL-18, som hører til IL-1-cytokin-familien, aktiverer den MyD88 /NFkB vei, og kan direkte forbedre CD8 + T-celle-responser i forskjellige innstillinger [39], [40] [41]. IL-18 alene hadde svake virkninger på T-celle proliferasjon og funksjon (Fig. 3A). Imidlertid, når kombinert med IL-2 + IL-12, IL-18 betydelig forbedret ekspresjon av IFN-γ og, i mindre grad, TNF-α (fig. 3A). Videre er kombinasjonen av IL-2 + IL-12 + IL-18 økte betydelig mengden av IFN-γ fremstilt på en per-celle-basis, som bevist ved øket midlere fluorescensintensitet (MFI) (fig. 3B, C). Ikke desto mindre, kan kombinasjonen av IL-2 + IL-12 + IL-18 var ikke i stand til i betydelig grad å forbedre ekspresjonen av CD107a eller IL-2 (fig. 3A) og bare moderat forbedret granzyme B frigivelse (Supp. Fig. S2A). Likeledes denne kombinasjonen ikke klarte å gjenopprette ekspresjon av IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, Mip-1α, PDGF-BB, eller bFGF i kultursupernatantene (Supp Fig. . S2B). Denne kombinasjonen gjorde imidlertid svakt øke nivåene av IL-5 og IL-10 i kultursupernatantene (Supp. Fig. S2C). Således er kombinasjonen av IL-2 + IL-12 + IL-18 bare delvis gjenoppretter T-celle-funksjoner i EOC miljø.
Masse ascites-celler ble stimulert med plate bundet α-CD3 i medier eller 100% autolog ascitesvæske i 48 timer. Proliferasjon og funksjon av CD8 + -T-celler i nærvær av media eller autologe ascitesvæske (øvre panel) ble vurdert ved å måle ekspresjonen av Ki-67, CD107a, CCI4, IFN-γ, TNF-α, og IL-2 ved strømningscytometri. (A) Virkning av IL-18 (midtre panel) og IL-2 + IL-12 + IL-18 (nedre panel) på CD8 + T-celle-proliferasjon og ulike funksjoner i nærvær av ascitesvæske. Data er blitt normalisert til a-CD3 stimulerte celler i media (dvs. medier verdier ble subtrahert fra hvert stimulering tilstand). * Det var en signifikant effekt av IL-2 + IL-12 + IL-18 for å forsterke det angitte funksjon i forhold til celler stimulert i media (Wilcoxon tilpasset parvis t-test, p 0,05). (B) Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av IFN-y-positive CD8 + T-celler ble bestemt ved intracellulær IFN-γ farging. * Effekten av IL-2 + IL-12 + IL-18 var signifikant større enn de to andre cytokin kombinasjoner (Wilcoxon tilpasset parvis t-test, p 0,05). (C) Representative flowcytometri plott som viser effekten av cytokin-kombinasjoner på IFN-γ produksjon på en per-celle-basis. Vist er den midlere fluorescens intensiteten (Y-aksen) av IFN-γ produksjon og prosentandelen av CD8 + -celler som uttrykker IFN-γ (tall). Alle data er inngjerdet på CD8 + lymfocytter.
Eksogene cytokiner indusere nye flerfunksjonelt T-celle profiler
I teorien kan den forbedrede aktivitet av cytokin kombinasjoner i forhold til enkelt cytokiner reflekterer enten (a ) forskjellige cytokiner som stimulerer forskjellige subpopulasjoner av T-celler, eller (b) cytokiner som virker synergistisk for å indusere enkelt T-celler til å utføre flere funksjoner (det vil si induksjon av polyfunksjonelle T-celler). For å undersøke dette problemet, brukte vi boolsk gate analyse for å studere de ulike funksjons permutasjoner vises av CD8 + og CD4 + T-celler under ulike stimulering forhold. Som vist i den øvre delen av fig. 4, når masse ascites-celler ble stimulert i fullstendig media, ble bare fem dominerende funksjonelle permutasjoner sett blant CD8 + T-celler: (a) ikke-funksjonelle (dvs. null-funksjon) T-celler (data ikke vist); (B) Mono-funksjonelle T-celler som uttrykker CCI4 eller CD107a (permutasjoner 2 og 5), (c) bi-funksjonelle T-celler som uttrykker både CD107a og CCI4 (permutasjon 13), og (d) tri-funksjonelle T-celler som uttrykker CD107a, CCI4 og IFN-γ (permutasjon 24). I nærvær av 100% ascites fluid, antallet ikke-funksjonelle T-celler økte, mens den andre funksjonelle permutasjoner ble redusert med unntak av mono-funksjonelle T-celler som uttrykker CCI4 (fig. 4, andre panel). Generelt tillegg av enkelt cytokiner klarte å betydelig endre de funksjonelle permutasjoner sett med ascites alene, selv om IL-2 hadde svake effekter på flere permutasjoner (Supp. Fig. S3). I motsetning til dette, tilsetning av cytokin-kombinasjoner (enten IL-2 + IL-12 + IL-21 eller IL-2 + IL-12 + IL-18) markant redusert antall nullgjennom og monofunksjonelle T-celler og som genereres tre nye polyfunksjonelle permutasjoner: a) CCI4, og IFN-γ (permutasjon 10); b) CCI4, IFN-γ, og TNF-α (permutasjon 17); og c) CCI4, IFN-γ, TNF-α, og CD107a (permutasjon 28) (Fig. 4, tredje og fjerde paneler). Lignende tendenser ble observert for CD4 + T-celler, selv om effektene var generelt svakere (data ikke vist). Dermed disse kombinasjonene av cytokiner synes å virke synergistisk å indusere flerfunksjonene responser av private T-celler i motsetning til å stimulere flere subpopulasjoner av mono-funksjonelle T-celler.
Bulk ascites celler ble stimulert med plate bundet α-CD3 i media eller 100% autolog ascitesvæske i 48 timer i nærvær eller fravær av den angitte cytokin kombinasjonen. Boolsk port analyse ble utført for å kvantifisere antallet av T-celler som uttrykker hver av 31 mulige funksjonelle permutasjoner. Vist er resultatene for CD8 + T-celler stimulert i media, ascitesvæsken eller ascitesvæske supplert med kombinasjoner cytokin IL-2 + IL-12 + IL-21 eller IL-2 + IL-12 + IL-18. Hyppigheten av T-celler som uttrykker et gitt permutasjon er uttrykt som en prosentandel av totale CD8 + T-celler. * For det indikerte permutasjon, effekten av cytokin kombinasjonen var vesentlig større enn det som ble sett med media (Wilcoxon matchet parvis t-test, p 0,05).
Diskusjoner
Vi viser her at ascites miljøet i human EOC har varierende effekter på CD8 + og CD4 + T-celle-proliferasjon, og kan faktisk til og med forbedre spredning i noen tilfeller. I motsetning til dette, ascites vanligvis inhiberer ekspresjon av IFN-γ, TNF-α, CCI4, og CD107a av T-celler, noe som resulterer i en overvekt av nullgjennom eller monofunksjonelle T-celler. Videre er ascites miljø vanligvis hemmet ekspresjon av IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, Mip-1α, PDGF-BB, bFGF og i kultursupernatanter. Selv om IL-2 kunne gjenopprette T-celleproliferasjon, det var stort sett ineffektiv på å øke andre T-celle funksjoner, som var andre monoterapi cytokiner (IL-12, IL-18 og IL-21). Kombinasjoner av cytokiner som aktiverer komplementære signalveier (i særdeleshet IL-2 + IL-12 + IL-18) var i stand til å øke ekspresjonen av IFN-γ, TNF-α, og CCI4 men hadde neglisjerbare virkninger på andre T-celle-funksjoner. Således kan eksogene cytokiner delvis gjenoppretter T-cellefunksjon i den menneskelige EOC miljø; vil imidlertid alternative strategier være nødvendig for å fullt gjenopprette T-cellefunksjon.
En begrensning med denne studien er det relativt lite utvalg, som var nødvendig gitt antall cytokiner og funksjonelle lese-outs involvert. Til tross for den lille prøvestørrelse, var det en bemerkelsesverdig grad av likhet mellom de generelle funksjonelle profiler av alle fem pasientprøver, både ved start og etter cytokin stimulering. Dette tyder på at de forskjellige immunsuppressive mekanismene som er tilstede i eggstokkreft kan til slutt konvergerer mot et felles T-celle-funksjonell tilstand styrt av et konservert sett av regulatoriske signaler.
frigjøring av cytotoksiske granuler er en viktig mekanisme ved hvilken T-celler drepe virus-infiserte og transformerte celler [42]. Vi fant ut at ascitesvæske sterkt hemmet T-celle degranulering, og dette ble bare delvis restaurert av eksogene cytokiner (som gjenspeiles av beskjeden forbedring av granzyme B release). Tidligere studier har vist at kombinasjonen av IL-2 med TCR-stimulering [9] eller IL-12 [10], [11] fullt ut kunne gjenopprette LAK-cytotoksisitet i nærvær av 50% ascitesvæske. Denne uoverensstemmelse med våre resultater kan gjenspeile mer krevende dyrkingsbetingelsene vi anvendte, ved at T-celler ble analysert i nærvær av 100% ascites væske og en fullstendig utfylle andre tumorassosierte celletyper.
Den manglende IL-2-produksjon av både CD8 + og CD4 + -T-celler i disse forsøk er også i overensstemmelse med en nedsatt antitumorrespons. I vår musemodell for ovariekreft [8], tumorregresjon var fullstendig avhengig av IL-2 /IL-15 signalisering. Likeledes, Gattinoni og kolleger vist at effektor-CD8 + T-celler i stand til potente
in vitro
antitumor cytotoksisitet og IFN-γ produksjon, men ikke IL-2-produksjon, hadde begrenset antitumoraktivitet
in vivo
, mens T-celler som hadde lav
in vitro
cytotoksisitet, men høy IL-2 produksjon, mediert overlegen anti-tumorrespons [12]. Som CD8 + T-celler generelt mister evnen til å produsere IL-2 ved differensiering, til svikt av cytokiner forbedre IL-2-produksjon tyder på at de fleste tumorassosierte T-celler kan være terminalt differensiert effektorer [13]. I så fall bør det videre arbeidet være rettet mot å isolere og utvide mindre differensierte undergrupper av T-celler med større pluripotency.
I tillegg til mislyktes IL-2-produksjon, har vi funnet at ascitesvæske hemmet uttrykk for en rekke andre cytokiner ( IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, Mip-1α, PDGF-bB, og bFGF) i kultursupernatanter. Selv om multipleks cytokin-analysen benyttet vi kan ikke skille hvilken celletype (r) blir hindret fra å produsere disse cytokinene, mange av disse cytokiner er dokumentert roller i T-celle responser og dermed deres reduserte nivåer er forventet å påvirke T-cellefunksjon. Spesielt er IL-17 produsert av Th17 undergruppe av CD4 + T-celler i henhold til inflammatoriske tilstander og har blitt korrelert med forbedret total overlevelse i EOC [5]. Gitt at kombinasjonen av IL-2 + IL-12 + IL-18 mislyktes i å øke IL-17 produksjon, vil alternative strategier være nødvendig for å fremme denne effektor-reaksjonsveien i tumormiljøet. For eksempel, IL-1β, IL-6, TGF-β, IL-23, og ICOS har alle vist seg å påvirke differensiering, ekspansjon eller funksjon av Th17-celler [4], [43], og således kan potensielt bli manipulert for å fremme IL-17 produksjon
in vivo
.
i motsetning til disse andre cytokin-defekter, kombinasjonen av IL-2 + IL-12 + IL-18 potent forbedret IFN-γ produksjon av CD8 + T-celler (fig. 3B, C). IFN-γ spiller en sentral rolle i antitumorimmunitet ved å hemme tumor proliferasjon og angiogenese, og oppregulere tumor antigen presentasjon. Endogent IFN-γ beskytter mot tumorutvikling, og i en rekke tumormodeller, er kritisk for anti-tumorimmunitet [44]. Videre IFN-γ og IFN-γ reseptor-ekspresjon, så vel som flere gener nedstrøms fra IFN-γ, er forbundet med øket overlevelse hos mennesker EOC [1]. Hvordan kan IL-2, IL-12 og IL-18 samvirkende øke IFN-γ produksjon? Først disse cytokinene gjensidig oppregulerer ekspresjonen av deres respektive reseptorer, noe som resulterer i økt sensitivitet av T-celler til alle tre cytokiner [45], [46], [47], [48]. For det andre kan disse cytokinene megle synergi og utfyllende signal hendelser [37], [49], [50]. For eksempel, IL-2 og IL-12 synergistisk aktiverer p38 MAPK-reaksjonsveien for å forbedre IFN-γ uttrykk [51]. Likeledes, IL-12 og IL-18 aktiverer transkripsjonsfaktorene STAT4 og AP-1, henholdsvis, som kan synergistisk øke IFN-γ promoteraktivitet [52]. Således synes det koordinert aktivering av både STAT og ikke-STAT signalveier viktig for maksimal ekspresjon av IFN-γ. Det er bemerkelsesverdig, men at disse signalene ikke var tilstrekkelig til å gjenopprette ekspresjon av mange andre cytokiner. Dette tyder på at det i fremtiden, bør andre enn IFN-γ cytokiner brukes som skrive outs hvis man ønsker å optimalisere hele spekteret av T-celle funksjoner for kreft immunterapi.
Kombinasjonen av IL-2 + IL -12+ IL-18 også induserte betydelige endringer i flerfunksjonene T-celle permutasjoner.
