Abstract
Eggstokkreft er fortsatt den mest dødelige gynekologisk kreft og ny målrettet molekylære behandling mot denne elendig sykdommen fortsetter å være utfordrende . I denne studien, analyserte vi uttrykksmønstre interleukin-6 (IL-6) og dens reseptor (IL-6R) ekspresjon i eggstokkreft vev, evalueres virkningen av disse uttrykkene i kliniske resultatene av pasienter, og funnet ut at en høy- nivået av IL-6R uttrykk, men ikke IL-6-ekspresjon i cancerceller er uavhengig prognostisk faktor. I
in vitro
analyser ved hjelp av eggstokkene cellelinjer, mens seks (RMUG-S, RMG-en, OVISE, A2780, SKOV3ip1 og OVCAR-3) på syv uttrykt IL-6R sammenlignet med en primær normal eggstokk overflaten epitel , bare to (RMG-en, OVISE) av syv cellelinjer overexpressed IL-6, noe som tyder på at IL-6 /IL-6R signale utøver i en parakrint måte i visse typer eggstokkreft celler. Eggstokkreft ascites ble samlet fra pasienter, og vi fant ut at primær CD11b
+ CD14
+ celler, som var overveiende M2-polariserte makrofager, er den viktigste kilden til IL-6 produksjon i en eggstokkreft mikromiljø. Når CD11b
+ CD14
+ celler ble dyrket med kreftceller, både invasjonen og spredning av kreftceller ble robust forfremmet og disse kampanjene ble nesten helt hemmet av forbehandling med anti-IL-6R antistoff (tocilizumab ). De data som er presentert heri tyder på en begrunnelse for anti-IL-6 /IL-6R behandling for å undertrykke den peritoneal spredning av ovariecancer, og representerer tegn på det terapeutiske potensialet av anti-IL-6R terapi for ovarian cancer behandling.
Citation: Isobe A, Sawada K, Kinose Y, Ohyagi-Hara C, Nakatsuka E, Makino H, et al. (2015) Interleukin 6 Receptor er en uavhengig prognostisk faktor og en potensiell terapeutisk mål av eggstokkreft. PLoS ONE 10 (2): e0118080. doi: 10,1371 /journal.pone.0118080
Academic Redaktør: Goli Samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRALIA
mottatt: 01.10.2014; Godkjent: 05.01.2015; Publisert: 06.02.2015
Copyright: © 2015 Isobe et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning fra departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur fra Japan (21791555 og 23592447 til KS, 22390308 til HK og 23659779 til TK). Dette arbeidet ble også delvis støttet av Osaka Medical Research Foundation for vanskelige sykdommer (KS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer. Nyere overbevisende data støtter involvering av den inflammatoriske stromal mikromiljøet, forårsaket av over-uttrykk for cytokiner eller chemokiner, fremme eggstokkene tumorigenesis, kreft progresjon og motstand mot kjemoterapi. [1] Derfor rettet mot disse cytokiner fra stromal mikromiljøet kan tilby en lovende terapeutisk strategi for å forbedre forvaltningen av pasienter med eggstokkreft
Blant de cytokiner rapportert så langt, interleukin-6 (IL-6) er en av de viktige immun cytokiner stede i eggstokkreft mikromiljøet.; det fremkaller flere veier som fører til tumor spredning, angiogenese og chemoresistance. [2] Høyere serum og ascites nivåer av IL-6 er funnet hos pasienter med eggstokkreft enn hos pasienter med andre kreftformer, og nivåer har vist seg å korrelere med graden av sykdom og dårlig klinisk utfall. [3-5] Selv Rath et al. nylig viste at IL6-R-ekspresjon er sterkt uttrykt i eggstokkreft vev sammenlignet med normalt vev eller godartede sykdommer, [6] den kliniske effekten av IL6-R ekspresjon i eggstokkreft arter som ikke er blitt undersøkt. Derfor ble vi oppfordret til å undersøke kliniske verdier av IL-6 og IL-6R i eggstokkreft vev ved hjelp av microarray (TMA) vi bygget og de tilsvarende kliniske data.
Det ser ut til at antagonisere IL-6 /IL-6R signalering kan ha terapeutisk aktivitet i pasienter med ovarialcancer gjennom inhibering av en tumorfremmende cytokin-nettverket. Faktisk, målrettet anti-IL-6 antistoff terapi har blitt brukt i kliniske studier og funnet å være godt tolerert hos pasienter i flere kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene. [7] Tocilizumab (Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japan), er et humanisert anti- humant IL-6R-antistoff og binder seg til IL-6-bindingssete av human IL-6R. Det er kjent å kompetitivt hemme IL-6 /IL-6R signalering og helt nøytraliserer IL-6 aktivitet. [8, 9] En rekke kliniske studier har klart vist at suppresjon av IL-6 /IL-6R signalering ved tocilizumab er terapeutisk effektive i lindre Castleman sykdom og revmatoid artritt. [10, 11] Gitt sin suksess i behandling av disse sykdommene, tocilizumab kan vise seg nyttig i behandling av IL-6-relatert kreft, og vi ble motivert til å belyse den terapeutiske potensialet i tocilizumab mot eggstokkreft.
Selv om ikke bare eggstokkreft celler, men tumorassosierte makrofager har blitt rapportert å produsere IL-6, [12, 13] er det fortsatt diskuteres om økt IL-6-nivåer i pasienter med ovarialcancer produseres av tumoren selv eller hovedsakelig av vertsvev. Flertallet av pasienter med kreft i eggstokkene ved avanserte stadier til stede peritoneal metastatiske sykdommer, ofte ledsaget av massive ascites. [14] Massive ascites av pasienter som består av ikke bare kreftceller, men også fibroblaster, endotelceller og hovedsakelig immun-celler, som alle er avgjørende for kreft vekst, progresjon og metastasering. [15] bukhinnemakrofager antas å spille en sentral rolle i denne sammenheng, som er dokumentert av flere studier opplever at makrofagen uttømming i peritoneal eggstokkreft modeller undertrykker kreft progresjon og akkumulering av ascites. [16, 17] Makrofager som infiltrerer tumorvev, som er referert til som tumor-assosierte makrofager (TAM), er kjente bidragsytere til tumorprogresjon og er forbundet med dårlig prognose av forskjellige kreftformer. [18, 19] Siden TAMs er kjent for å frigjøre ulike proangiogenic cytokiner og vekstfaktorer, vi hypotese at makrofager kan være en av potensielle ansvarlige kilder til anriket IL-6 akkumulering i eggstokkreft ascites.
på denne bakgrunn vi forsøkt å analysere uttrykks mønster av IL- 6R samt bruke eggstokkreft TMA og for å evaluere effekten av disse uttrykkene på de kliniske resultatene av pasienter. Eggstokkreft ascites ble samlet fra pasienter som gjennomgikk kirurgi, og vi fant ut at primær CD11b
+ CD14
+ celler, som var overveiende M2-polarisert TAMs, var den viktigste kilden til IL-6 produksjon i en ovarial tumor mikromiljø og robust fremmet eggstokkreft invasjon og spredning. Dataene som presenteres her foreslå en begrunnelse for anti-IL-6 /IL-6R terapi for å undertrykke peritoneal spredning av eggstokkreft og gi bevis av det terapeutiske potensialet i anti-IL-6R terapi for å kurere denne elendig sykdommen.
Materialer og metoder
etikk erklæringen
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet skriftlig informert samtykke i samsvar med etiske komité krav fra institutter og Helsinkideklarasjonen. Institutional Review Board (IRB) fra Osaka University Graduate School of Medicine godkjent denne studien protokollen på 2011/02/15 (nr 10064). IRB av Gifu Universitetet Graduate School of Medicine godkjent det på 2012/7/2 (nr 26-50).
Material
Antistoffer mot IL-6 (R-49L), IL- 6R (C-20) og total STAT3 (C-20) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rekombinant humant IL-6 ble oppnådd fra Chemicon (Temecula, CA) og rekombinant human sIL-6R var fra R 25%, 1, ≥25%) og intensiteten av farging (0, none; 1, svak, 2, sterk). «Høy» ekspresjon av IL-6 ble definert hvis sammensetningen stillingen av tetthet og intensitet var ≥1. «Lav» uttrykket ble definert dersom sammensetningen score på tetthet og intensitetspoeng var 0. «High» ekspresjon av IL-6R ble definert dersom sammensetningen score på tetthet og intensitet ble = 2. «Low» uttrykket ble definert dersom sammensetningen poengsum av tetthet og intensitetspoeng var ≤1.
real Time Reverse Transcription (RT) -PCR analyse
Total RNA ble isolert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California). En mikrogram total RNA ble revers-transkribert med ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan). For kvantitativ mRNA uttrykk analyse, ble TaqMan RT-PCR utføres på StepOnePlus ™ Real-Time PCR system å følge produsentens instruksjoner. TaqMan Probe-baserte genekspresjon Analysene ble brukt for IL-6; Hs 00174131_m1 og IL-6R; Hs 01075667_m1 (Applied Biosystems). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Relative nivåer av mRNA genuttrykk ble beregnet ved hjelp av to
-.
ΔΔCT
metode som beskrevet tidligere [21]
RT-PCR-analyse
cDNA ble syntetisert fra 1 mikrogram RNA ved hjelp av en ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan) med tilfeldige primere. For IL-6R ekspresjon, ble primerne utformet for å binde til regionen skjøte ut fra IL-6R for å detektere ikke bare en membranbundet form (IL-6R), men også en oppløselig form (sIL-6R). Primersekvensene og de forventede PCR-produktene var som følger; forstand IL-6R, 5′-TCCACCCCCATGCAGGCACT-3 «(basene 1419 til 1438) og anti-sense-IL-6R; 5»-GTGCCACCCAGCCAGCTATC-3 «(basene 1840 til 1859), størrelse; IL-6R, 441 bp, sIL-6R, 341 bp. β-actin-sense: 5»-CGTGACATTAAGGAGCTGTG-3 «, β-actin-anti-sense: 5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3», størrelse 376 bp. Sekvensene til cDNA ble referert til GenBank (deponeringsnr. X12830 for IL-6R og sIL-6R og NM_001101 for β-aktin). CDNA-templater ble PCR-amplifisert med Taq PCR masterblanding (Qiagen, Valencia, CA) inneholdende 1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP, og 2,5 U Taq DNA-polymerase, og hver spesifikk primer 0.2 uM under de følgende betingelser : 35 sykluser ved 94 ° C i 45s, 60 ° C i 45s og 72 ° C i 60 s. Produktene ble elektroforert på 2% agarosegeler, og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging og ultrafiolett belysning.
Western Blot analyse
totalt 4 x 10
5-celler ble sådd ut på 6- vel plater og lysert med 1 × Cell Lysis Buffer (Cell Signaling). Lysatene (30 ug) ble separert ved 5-20% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner, etterfulgt av inkubasjon med de primære antistoffer (p-STAT3, 1: 1000 i 5% bovint serumalbumin (BSA), STAT3, 1 : 1000 i 5% BSA, p-ERK, 1: 2000 i 5% BSA, ERK, 1: 2000 i 5% BSA, p-aktin, 1: 10000 i 5% BSA) og deretter med en tilsvarende sekundære pepperrot-peroksidase konjugert IgG. Proteinene ble visualisert med Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA).
celleproliferasjonsanalyse
SKOV3ip1 eller RMG1 celler ble sådd ut i 24-brønners plater (1 x 10
4 celler /brønn) i 10% FBS /DMEM i 24 timer og deretter inkubert i 0,1% BSA /DMEM i nærvær eller fravær av IL-6 med eller uten anti-IL-6R-antistoff i 72 timer. Celleproliferasjon ble evaluert ved en modifisert MTS analyse ved bruk av en Cell Titer 96AQ kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. I co-kultur eksperimenter, polykarbonat filtre med en-mikrometer porer (celler kan ikke passere gjennom filtrene) ble plassert på 24-brønners plater og like mange primære celler ble sådd som en stimulerende. Celle proliferasjon ble uttrykt som forholdet mellom antallet levedyktige celler.
Matrigel invasjon assay
I korthet ble polykarbonatfiltere med 8-um porer belagt med 25 ug matrigel (BD Biosciences). SKOV3ip1 eller RMG1-celler (1 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut på de øvre kamrene i 0,1% BSA /DMEM og inkubert i det samme medium inneholdende IL-6 som en kjemoattraktant i bunnkammeret for 72 h.Thereafter , filtre ble fiksert og farget med Carazzi er Hematoxylin løsning. Noninvading celler ble fjernet ved hjelp av en bomullsdott, og invaderende celler på undersiden av filteret ble telt ved bruk av et invertert mikroskop. Fem orbital mikroskopiske felt fra hvert filter ble tilfeldig valgt. I ko-kultur eksperimenter ble et likt antall primære celler utsådd i bunnkammeret som en kjemoattraktant.
Enzym-bundet immunosorbant assay (ELISA)
For kvantitativ analyse av humant VEGF-A, SKOV3ip1-celler (1 x 10
5 celler) ble dyrket under serumfritt medium i nærvær eller fravær av IL-6 i 72 timer. Anti-IL-6R-antistoff (10 ug /ml) eller en ekvivalent mengde av kontroll IgG ble samtidig påført. Deretter ble kondisjonert kulturmedium oppsamlet og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Humant VEGF-A platina ELISA-sett (eBiosecience, SanDiego, CA) ble anvendt for å bestemme konsentrasjonen av VEGF-A, i henhold til produsentens protokoll, med en følsomhet på 7,9 pg /ml. For kvantitativ analyse av humant IL-6 eller human sIL-6R, 1 x 10
5 av SKOV3ip1 celler og primære celler ble dyrket under serumfritt medium i 72 timer, og følgende konsentrasjoner i kulturmediet ble målt ved bruk av Menneskelig IL- 6 ELISA Ready-SET-GO med en følsomhet på 2 pg /ml eller menneskelig sIL-6R Instant ELISA (eBioscience) med en følsomhet på 10 pg /ml.
Isolering av primære celler fra eggstokkreft ascites
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet skriftlig informert samtykke i henhold til Osaka University Hospital etiske komité krav og Helsinkideklarasjonen. Ascites ble oppsamlet aseptisk, og cellene ble isolert ved standard Ficoll-Paque densitet-gradient (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Deretter ble CD11b positive (CD11b
+) celler samt CD14 positive (CD14
+) celler renset ved positiv seleksjon ved hjelp av magnetisk aktivert celle sortering (MACS) teknologi (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). Endelig CD11b
– celler, CD11b
+ CD14
– celler og CD11b
+ CD14
+ celler ble samlet inn. Celler ble dyrket i 20% FBS RPMI 1640 medium og anvendt for forsøk på passeringer 2 til 3.
fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse
For celleoverflatefarging, encellede suspen ble inkubert med fysoerytrin (PE) konjugert anti-CD11b monoklonalt antistoff (ICRF44) (BD Biosciences), allofykocyanin (APC) konjugert anti-CD14 monoklonalt antistoff (M5E2) (BD Biosciences), Alexa Fluor-488 konjugert anti-CD68 monoklonale antistoff (y1 /82A) (Miltenyi Biotec) og eFluor-450-konjugert anti-CD206 antistoff (19,2) (eBioscience, San Die go, CA) i 30 minutter ved 4 ° C. Etter vasking ble cellene resuspendert i 500 pl av 1% BSA /PBS. De fargede celler ble kjørt på en FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences). Data ble analysert ved hjelp av FlowJo program (TreeStar, Ashland, Oregon).
Statistisk analyse
Statcel versjon 3 (OMS-Publishing Inc., Saitama, Japan) og JMP versjon 10.0.2 (SAS Institute Japan Ltd., Tokyo, Japan) ble brukt for statistiske analyser. Forskjeller ble analysert ved anvendelse av Mann-Whitney U-test. Estimert overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og sammenligninger mellom grupper ble analysert ved bruk av log-rank test. Multivariabel analyse ble utført ved hjelp av en Cox proporsjonal farer regresjonsmodell. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på den tosidige
P
0,05 nivå.
Resultater
Høy ekspresjon av IL-6 reseptor er en uavhengig prognostisk markør for eggstokkreft pasienter
For å kunne vurdere det terapeutiske potensialet av IL-6R, vi etablert TMA lysbilder fra 94 japanske eggstokkreft pasient. Karakteristikken av pasientene er oppsummert i tabell 1. IL-6R ekspresjon ble evaluert ved immunhistokjemi, og hver prøve ble scoret basert på prosentandelen av positive celler og intensiteten av fargingen. Typisk ble klar membranøs farging sees i tilfellene med positiv IL-6R ekspresjon (Fig. 1A). Av 94 pasienter, 32 (34,0%) viste «høy» IL-6R uttrykket, inkludert 14 av 34 serøs (41,1%), 3 av 16 mucinous (18,8%), en av 11 endometrioid (9,1%), 10 av 20 Tøm celle (50,0%), og 4 av 13 andre (30,8%) ovariekarsinomer. I kontrast, 62 (66,0%) tilfeller uttrykt «lav» eller negativ IL-6R uttrykk. Blant pasienter med eggstokkreft, de som hadde «høy» IL-6R uttrykk viste betydelig dårligere PFS enn de som hadde «lav» eller negativ IL-6R uttrykk (PFS, 23,8 vs. 32,3 måneder,
P
= 0,0029, fig. 1B). Tilsvarende ble IL-6 ekspresjon evaluert ved immunhistokjemi, og hver prøve ble bedømt. Cytoplasmatisk farging ble observert i tilfeller av positiv IL-6 ekspresjon (Fig. 1C). Av 94 pasienter, 39 (41,4%) viste «høy» IL-6 uttrykket, inkludert 13 av 34 serøs (38,2%), 8 av 16 mucinous (50,0%), 5 av 11 endometrioid (45,5%), 11 av 20 Tøm celle (55,0%) og 2 av 13 andre (15,4%) ovariekarsinomer. I motsetning til dette, 55 (58,5%) tilfeller uttrykkes «lav» eller negativ IL-6 ekspresjon. Selv om den prognostiske verdien av IL-6 ble undersøkt av Kaplan-Meier metoden og sammenligninger utføres med log-rank test, IL-6 uttrykk klarte ikke å vise noen signifikant korrelasjon med prognoser for pasienter (Fig. 1D). For en multivariat analyse ble utført for å velge en modell for å overleve med flere prediktorer. Alder, ble FIGO stadium, histologisk type resttumor ved tidspunktet for kirurgi, «høy» IL-6-ekspresjon og «høy» IL-6R ekspresjon angitt i denne modellen. Den endelige modellen inkludert «høy» IL-6R uttrykk, men ikke IL-6 uttrykk er en betydelig uavhengig prediktor for redusert PFS i eggstokkreft pasienter (
P
= 0,017,
HR
; 2,388 ( 1,171 til 4,895), tabell 2) sammen med klinisk stadium og operasjoner.
(A) Immunhistokjemisk farging av microarray med maligne eggstokkvev seksjoner. Representative områder av fire forskjellige eggstokkreft farget hjelp av en anti-human IL-6R antistoff og scoret som «Lav» eller «Høy». Morkaker komplisert med korioamnionitt ble anvendt som en positiv kontroll. Pilene viser membran flekker i trophoblasts. En negativ kontroll er ikke-immune sera. (B) IL-6 reseptor ekspresjon korrelerer med dårlig prognose i pasienter med eggstokkreft. Kaplan-Meier-kurver av progresjonsfri overlevelse (
forlot
) og total overlevelse (
høyre
) av eggstokkreft pasienter behandlet ved Gifu universitetssykehus (n = 94). (C) Representative områder av fire forskjellige eggstokk-kreft farges ved hjelp av et anti-humant IL-6 antistoff og et innlegg som «lav» eller «høy». Morkaker komplisert med korioamnionitt ble anvendt som en positiv kontroll. Pilene viser cytoplasmisk farging i villous mesenchymalceller. En negativ kontroll er ikke-immune sera. (D) IL-6 uttrykk ikke påvirke prognosen hos pasienter med eggstokkreft. Kaplan-Meier-kurver av progresjonsfri overlevelse (
venstre
) og total overlevelse (
høyre
) av pasientene. Original forstørrelse, × 200. Scale bar i hvert panel representerer 50 mikrometer.
IL-6 reseptor, men ikke IL-6 er sterkt uttrykt i eggstokkreft cellelinjer
Siden «high «uttrykk for IL-6R, men ikke IL-6 påvirket prognosene av pasienter med eggstokkreft, kvantifisert vi uttrykk for IL-6 og IL-6R i eggstokkreft cellelinjer ved real-time RT-PCR. Ekspresjonsnivået av primære OSE-celler ble satt til 1,0. Selv om bare to (RMG-1 og OVISE) av syv cellelinjer uttrykte høye nivåer av IL-6 sammenlignet med OSE-celler (fig. 2A), seks (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 og OVCAR-3 ) av syv cellelinjer viste markert høy ekspresjon av IL-6R (11,0 til 270,1 fold) (fig. 2B). Lignende trender ble bekreftet ved Western Blot (Fig. 2C). Den membranbundne form av IL6R ekspresjon i stor grad er begrenset til hepatocytter, immunceller og noen tumorceller. [6] Derfor, er det løselige isoform (sIL-6R) som anses å spille en viktig rolle i inflammatoriske sammenhenger ved å tillate et økt respons på IL -6 i alle celletyper. For å bestemme hvorvidt ovarie cancer-cellelinjer hovedsakelig uttrykker full-lengde (IL-6R) eller differensielt spleiset isoformen som mangler transmembrandomenet (sIL-6R), har vi utviklet primere som koder skjøte lesjoner og utført RT-PCR (Fig . 2D). I alle cellelinjer unntatt OSE, fant vi at både IL-6R og sIL-6R ble uttrykt. Ekspresjonen av sIL-6R ble ytterligere bekreftet ved kvantitativ ELISA. Alle ovarie cancer cellelinjer som ble testet ga en viss mengde av sIL-6R (6,3 til 94,0 pg /10
5-celler, fig. 2E). Således, ved behandling med IL-6 (100 ng /ml) alene drastisk indusert fosforylering av STAT3, en nøkkel nedstrøms molekyl i IL-6 /IL-6R signalveien, så vel som av ERK i SKOV3ip1-celler (fig. 2F), og tilsetningen av eksogen sIL-6R ble ikke nødvendig for disse phosphorylations. Forbehandling av anti-IL-6R-antistoff inhiberte de reaksjoner på en doseavhengig måte, noe som indikerer at IL-6R blir høyt uttrykt i visse typer av eggstokkreft celler og at IL-6 /IL-6R signale utøver på en parakrin måte i disse celler, selv om cellene ikke produserer IL-6.
Sanntids tids~~POS=HEADCOMP RT-PCR av IL-6 (A) og IL-6R (B). Total RNA ble samlet inn fra sju forskjellige eggstokkreft cellelinjer ved hjelp TRIzol og utsatt for real-time RT-PCR. De to
-ΔΔCT metoden ble brukt for å beregne den relative overflod i forhold til GAPDH uttrykk. Relative fold forskjeller med hensyn til primær eggstokk overflaten epitel (OSE) er presentert. (C) Western Blot. Cellelysater fra syv eggstokkreft celler ble oppløst ved SDS-PAGE og immunoblottet med et antistoff mot IL-6 og IL-6R. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (D) RT-PCR. RNA ble oppsamlet og uttrykk for full-lengde IL-6R (IL-6R) og løselig IL-6R (slL-6R) ekspresjon i ovarie cancer cellelinjer ble undersøkt. PCR-betingelsene var som beskrevet i Materiale og metode. (E) ELISA-analyse av slL-6R. Syv eggstokkreft celler (1 x 10
5 hver) ble sådd ut på 24-brønners plater og dyrket med 1 ml serum-fritt medium i 72 timer. Kondisjonerte medier ble oppsamlet, og konsentrasjonen av human sIL-6R ble målt ved hjelp av ELISA. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. n.d .; ikke funnet. (F) Western Blot. Eksogent behandling av IL-6 aktiverer IL-6 /IL-6R signalisering i ovarie cancer-cellelinjer. SKOV3ip1 celler ble stimulert med IL-6 (100 ng /mL) i 30 minutter med eller uten forhåndsbehandling ved hjelp av Ranti-IL-6R-antistoff (1-100 pg /ml) ikke-immun IgG som kontroll. Cellelysater ble oppsamlet og lik mengde av cellelysater (30 ug) ble løst ved 10% SDS-PAGE og immunoblottet med anti-fosforylert STAT3 (p-STAT3) antistoff og anti-fosforylert P44 /42 MAPK (p-ERK1 /2) antistoff. Membranene ble strippet og rehybridized med antistoffer som detekterer de samlede former av proteinet. Blot er representative for tre forsøk.
Eksogene behandling av IL-6 induserer spredning, invasjon og VEGF produksjon av eggstokkreft celler
Siden IL-6 /IL-6R signalering er kjent å opptre på en rekke måter å utfylle kreft progresjon, undersøkte vi om det eksogene behandling av IL-6 øker spredning, invasjon og VEGF-relaterte angiogenese i eggstokkreft celler. For dette formål har SKOV3ip1 celler som uttrykker ikke detekterbare nivåer av protein av IL-6 og RMG-1-celler som uttrykker et visst nivå av IL-6 ble benyttet. Begge cellelinjer som har høye nivåer av IL-6R uttrykk som bekreftet i fig. 2A. Eksogent behandling av IL-6 robust indusert celle invasjon av eggstokkreft celler på en doseavhengig måte (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 4,27 ± 0,53 fold, RMG-1, 2,99 ± 0,46 ganger), mens induksjon var nesten fullstendig inhiberes ved forbehandling med anti-IL-6R-antistoff (fig. 3A). Tilsetningen av eksogent sIL-6R har ikke lenger fremme invasjonen av eggstokkreft celler indusert ved hjelp av IL-6, noe som tyder på at IL-6RS (IL-6R og sIL-6R) fremstilt fra kreftceller er nok til å aktivere IL-6 /IL -6R signalering. Eksogent behandling av IL-6 også betydelig forbedret spredning av begge eggstokkreft celler på en doseavhengig måte (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 1,60 ± 0,29 fold, RMG-1, 1,64 ± 0,39 ganger) og forbehandling av anti -il-6R antistoff nesten avskaffet disse forbedringene (fig. 3B). Deretter undersøkte vi VEGF produksjon fra SKOV3ip1 celler. Eksogent behandling av IL-6 (100 ng /ml, 72 timer) signifikant stimulert VEGF produksjon fra kreftceller (kontroll; 239,4 ± 16,3 pg /1x 10
5-celler, IL-6; 322,4 ± 11,8 pg /1×10
5 celler) og forbehandling av kreft celler med anti-IL-6R-antistoff inhiberte signifikant VEGF-produksjon (fig. 3C). Kollektivt, eksogent behandling med IL-6 indusert proliferasjon, invasjon og VEGF produksjon av eggstokkreft celler, selv om de ikke uttrykker IL-6, og samtidig behandling med løselig IL-6R ble ikke nødvendig. Disse data antydet at i visse typer eggstokkreft celler, kan IL-6 /IL-6R signale øke kreft progresjon i en parakrint måte.
(A) En matrigel invasjonen analysen ble gjort ved hjelp av en modifisert Boyden kammer system . 1 x 10
5 av SKOV3ip1 (
venstre
) eller RMU-S (
høyre
) celler ble plassert på toppen kammeret i serumfritt medium og lov til å invadere i 72 timer . Forskjellige konsentrasjoner av IL-6 (1-100 ng /ml) eller 60 ng /ml sIL-6R ble påført i bunnkammeret som et kjemotiltrekkende. 10 ug /ml anti-IL-6R-antistoff eller ikke-immun IgG ble ko-behandles. Ikke-invaderende celler ble fjernet ved hjelp av en bomullsdott, og invaderende celler på undersiden av filteret ble nummerert. Relative antall av invaderende celler i forhold til kontrollen (ingen behandling IL-6) er vist. (B)
In vitro
celleproliferasjon analysen. 1 x 10
4 celler av SKOV3ip1 (
venstre
) eller RMG1 (
høyre
) celler ble sådd ut i 24-brønners plater i 10% FBS /DMEM i 24 timer og deretter inkubert i serumfritt medium i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av IL-6 (1-100 ng /ml) med eller uten anti-IL-6R-antistoff eller ikke-immun IgG som kontroll i 72 timer. Celleproliferasjon ble evaluert ved en modifisert MTS assay. Celle proliferasjon ble uttrykt som forholdet mellom antallet levedyktige celler. (C) ELISA-analyse av VEGF-A. 1 x 10
5 SKOV3ip1 celler ble sådd ut på 6-brønners plater og dyrket med 2 ml serumfritt medium i nærvær eller fravær av 100 ng /ml IL-6 i 72 timer. Anti-IL-6R antistoff eller kontrollere IgG ble co-behandlet. Kondisjonerte medier ble oppsamlet, og konsentrasjonen av humant VEGF-A ble målt ved hjelp av ELISA. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og verdiene er midler ± SD av tre paralleller. n.s .; ikke signifikant, *; P 0,05, **; P 0.01.
CD11b
+ CD14
+ celler forbedrede invasjon og spredning av eggstokkreft celler gjennom IL-6 produksjons
Siden IL-6 /IL-6R signale P P
