Abstract
Størrelse utvalg via filtrering tilbyr et antigen uavhengig tilnærming for berikelse av sjeldne celle populasjoner i blodet hos kreftpasienter. Vi evaluerte ytelsen til en ny tilnærming for multipleks sjelden celledeteksjon i blodprøver fra metastatisk bryst (n = 19) og lungekreftpasienter (n = 21) og friske kontroller (n = 30) ved hjelp av en automatisert mikrofluid filtrering og multipleks immunoassay strategi. Captured celler ble nummerert etter sekvensiell farging for spesifikke markører for å identifisere sirkulerende tumorceller (CTCs), utegående mesenchymale celler (CMCs), antatte sirkulerende stamceller (cscs) og sirkulerende endotelceller (CECs). Prekliniske valideringsforsøk ved bruk av kreftceller tilsatt i frisk blod viste høy utvinningsgrad (gjennomsnitt = 85%) og reproduserbarheten av analysen. I kliniske studier ble CTCs og CMCs påvist i 35% og 58% av kreftpasienter, henholdsvis, og var i stor grad fraværende fra friske kontroller (3%,
p
= 0,001). Mean nivåer av CTCs var signifikant høyere i bryst enn i lungekreftpasienter (
p
= 0,03). Femti-tre prosent (53%) av kreftpasienter næret antatte cscs, mens ingen var detekterbare hos friske kontroller (
p
0,0001). I motsetning til dette ble CECs observert i både kreft og kontrollgrupper. Direkte sammenligning av CellSearch
® vs. vår microfluidic filtermetoden avdekket moderat korrelasjon (R
2 = 0,46, kappa = 0,47). Seriell analyse av blodet hos brystkreftpasienter demonstrert muligheten for overvåking sirkulerende sjeldne cellepopulasjoner over tid. Samtidig vurdering av CTCs, CMCs, cscs og CECs kan gi nye verktøy for å studere mekanismer for sykdomsutvikling og behandlingsrespons /motstand
Citation. Magbanua MJM, Pugia M, Lee JS, Jabon M, Wang V, Gubens M, et al. (2015) A Novel Strategi for Påvisning og telling av sirkulerende sjeldne celle populasjoner i metastatisk kreft pasienter som bruker Automated mikrofluid Filtrering og Multiplex Immunoassay. PLoS ONE 10 (10): e0141166. doi: 10,1371 /journal.pone.0141166
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 15 juli 2015; Godkjent: 04.10.2015; Publisert: 23 oktober 2015
Copyright: © 2015 Magbanua et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Siemens Healthcare Diagnostics (SHD). Ekstra midler ble innhentet fra Breast Cancer Research Foundation (BCRF). BCRF hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. SHD var involvert i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. JWP mottatt forskningsmidler fra Siemens Healthcare Diagnostics. MP, KM, JP, HS, og AU er ansatte i Siemens Healthcare Diagnostics. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Nyere teknologiske fremskritt har gjort det mulig for pålitelig deteksjon og karakterisering av sirkulerende tumorceller (CTCs) i blodet hos kreftpasienter [1, 2]. For å kvantifisere nivåer av CTCs, har bestemmelser blitt utviklet for å legge til rette for deteksjon av epitel-celler i blodet ved hjelp av cellulære markører som EpCAM og cytokeratins [3]. Derfor har den kliniske betydningen av disse cellene blitt vist i en rekke studier som viser at forhøyede CTC tallene er assosiert med redusert overlevelse og dårlig respons på behandling [4-7]. Imidlertid har nyere studier identifisert CTCs med lavt uttrykk av epiteliale markører, f.eks de som gjennomgår epitelial-mesenchymale overgang (EMT), som ikke kan oppdages ved epithelial baserte analyser [8, 9]. Antigen-uavhengige berikelse, for eksempel filtrering systemer, og tilbyr en alternativ tilnærming som potensielt kan eliminere bias i utvalget på grunn av avhengighet spesifikt antigen uttrykk [10-14]. Filter-baserte metoder lette berikelse av ikke-hematologiske sjeldne celler (inkludert CTCs) ved å utnytte størrelsesforskjeller mellom disse celler og celler i perifert blod [10-14]. Mens leukocytter og erytrocytter typisk måler omtrent 6 til 8 pm i diameter, kan CTCs variere i størrelse, med diametere på 10 uM eller større [15, 16]. Endelig kan celler som er fanget på filteret bli utsatt for ytterligere analyse for påvisning og telling av CTCs [17-19].
I denne studien, vurderte vi resultatene av en ny tilnærming for deteksjon og telling av flere sjeldne celle populasjoner i blodet av metastatisk brystkreft og lungekreft pasienter som bruker en automatisert microfluidic filtrering og multiplex immunoassay strategi. Ulike sirkulerende sjeldne celle populasjoner ble funnet og nummerert, inkludert sirkulerende tumorceller (CTCs), utegående mesenchymale celler (CMCs), utegående endotelceller (CECs) og antatte sirkulerende stamceller (cscs). CTC tellinger ble sammenlignet med resultatene fra CellSearch
® system, et amerikansk Food and Drug Administration (FDA) -cleared analyse for telling av CTCs. Vi testet også muligheten for serieblodanalyse i en undergruppe av brystkreftpasienter.
Metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Boards ved Universitetet of California San Francisco (UCSF; Committee on human Research) og Siemens Healthcare Diagnostics (Elkhart, IN; Schulman Associates IRB). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra hver kreftpasient og friske frivillige som deltok i denne studien. Kreftpasienter ble registrert mellom januar og august 2014 ved UCSF. Friske donorer ble rekruttert i Siemens.
Pasient og Sunn Blood Prøvetaking
Om lag 6-9mL av blod ble samlet i rør som inneholder kalium tetra syre (K
3EDTA) og 0.45mL Transfix
® (Vacutest Kima). Prøver fra UCSF ble sendt til Siemens Healthcare Diagnostics i isolerte bokser utstyrt med kontrollert romtemperatur pakker (Saf-T-Pak ™ Inc.) og en digital temperatur opptaker (Track-It ™, Monarch Instrument). Blodprøvene ble lagret ved omgivende laboratorietemperatur inntil videre behandling.
Kontroll Preparat
Positive og negative kontroller ble fremstilt ved bruk av blodprøver fra friske donorer. Omtrent 8 ml blod ble trukket inn i rør inneholdende K
3EDTA og 0,045% Transfix
®. For positive kontroller, 10 ul av faste dyrkede celler (10
5 celler /ml)-enten SKBR3 (brystkreft linje, American Type Culture Collection ATCC
® HTB-30
TM) eller NCI H226 ( en lungekreft linje, ATCC
® CRL-5826
TM)-var tilsatt i frisk blod. En positiv kontroll inneholdende ca. 1000-celler og en negativ kontroll (ikke-piggete blod fra frisk donor) ble inkludert i hvert forsøk.
Circulating Cell Isolering og Immunocytochemistry Farging
Alle blodprøver ble behandlet ved Siemens Healthcare Diagnostics. Prosesstrinn som inkluderte filtrering, celle isolasjon, og immunocytochemistry (ICC) farging ble utført ved hjelp av en Hamilton starlet ™ robot (Hamilton Company, Reno Nevada). Instrumentet ble spesielt utstyrt med en filtrering enhet og programvare for å kontrollere robot automatisering av nedstrøms prosesser. En filtermembran med overflateareal på 3,8 cm
2 med porestørrelse 8 pm (Whatman ™ Nuclepore ™, GE Healthcare) ble montert på enheten. Den 8 pm porestørrelse ble valgt basert på optimal celle bedring som rapportert i litteraturen [15, 20, 21]. Detaljer om filtrering og celleisolasjonsprosedyrer er beskrevet i S1 File og S1 Fig. Kort beskrevet ble fullblodprøver fortynnet med fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 0,083% fibrinogen. De fortynnede prøver ble så filtrert gjennom mikrofluidfilteranordningen. Denne prosessen beriker for sirkulering av sjeldne celler, men beholder også ca. 50,000-100,000 hvite blodceller (WBC). Cellene fanget på filtermembranen ble fiksert, og automatisert ICC farging ble utført for å identifisere spesifikke cellepopulasjoner. Optimalisering av analyseparametre er omtalt i S2 Fil.
S1 tabell viser de antistoffene og fluorescerende prober brukt i denne studien. Detaljer om ICC prosedyren er beskrevet i S1 fil. I korthet ble cellene permeabilisert, og en blokkeringsoppløsning ble tilsatt for å forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffer. Celler ble inkubert i et passende antistoff-løsning for farging av målantigener. Et flytskjema som illustrerer fargeprosessen er vist i fig S1 Optimalisering av analyseparametre er omtalt i S2 File
De følgende cellelinjer ble anvendt som kontroller for å bestemme grenseverdier for positive signaler immunfarging:. (1) SKBR3, en brystkreft cellelinje som er CK +, VIM-, CD144-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (2) NCI-H2228, en lungekreft cellelinje som er CK +, VIM +, CD144-, TPBG /5T4 +, PIWIL2-, CD144-; (3) NCI-H266, et kreft linje lunge som er CK +, VIM +, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (4) MDA-MB-231, en brystkreft cellelinje som er CK +, VIM-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; og (5) en transfektert MDA-MB-231 uttrykker PIWIL2 og derfor er CK +, VIM-, TPBG /5T4-, PIWIL2 +, CD144 (gave fra Dr. Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, Kina ). Normale leukocytter og endotelceller ble brukt som positive kontroller for henholdsvis CD45 og CD144 flekker, og som negative kontroller for alle andre markører.
Mikroskopisk analyse og telling av sirkulerende Sjeldne Cells
Detection og bildebehandling celler ble utført ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Leica DM5000, Leica Microsystems GmbH) (S1-fil). Forskjellige celletyper ble nummerert på grunnlag av fargemønstre observert.
Den første deteksjonsterskelen ble definert som det punkt hvor fluorescens-signalet var påvisbar å være høyere enn ikke-spesifikk fluorescens fra filtreringsmembran. Analytiske cut-offs ble ytterligere definert basert på fluorescens nivåer av kjente kreftceller (SKBR-3 eller H226) og WBC fra friske kontrollpersoner benyttet som kontroller for positive og negative signaler, henholdsvis. For konsistens, bare en etterforsker (KM) telles cellene, mens en annen etterforsker (MP) bekreftet celler.
Statistical Analysis
Vi analyserte oppregning resultater (celler /ml) ved hjelp av t- tester. The Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne oppklaringsprosenten mellom gruppene. En
p
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Analyse Design
Vi har evaluert en ny strategi for multipleks sjeldne celle telling bruker. en automatisert filtrering basert instrument (Siemens Healthcare Diagnostics) og farging med flere immunfluorescens cocktails. Enheten består av en filtermembran montert på en micromachine støtte som tillater isolering av sjeldne celler, etterfulgt av autostaining og mikroskopisk påvisning. Denne engangs integrert celle fangst og karakterisering enhet etset med microfluidic strukturer muliggjør kontrollert filtrering over et trykkområde på 10-30 mbar (fig 1A). Detaljerte utformingen av den mikrofluid anordning er vist i S3 fig.
A. Utformingen av mikrofluidfilteranordningen og den skjematisk oversikt over prosesstrinnene for å fange og påvisning av sirkulerende sjeldne celler, B. Biomarkører og immuno-fenotyper av sirkulerende sjeldne celler identifisert gjennom den sekvensielle fargeprosedyre, C. Gjennomsnittlig prosent gjenvinning etter skyter kjente nummer av H226 lungekreftceller i sunn blod, D. Scatter plot som viser antall H226 tilsatt celler og antall celler gjenvunnet.
CTC farging cocktail inkludert 4 «, 6-diamidino-2- phenylindole (DAPI), en pan-cytokeratin (pan-CK) antistoff, og antistoffer mot CK8 /18, CK19, og CD45 (S1 tabell). DAPI fluorescens ble påvist i den blå kanalen og ble anvendt for å identifisere kjerneinneholdende celler. Fluorescent Pan-CK, CK8 /18, og CK19 antistoffer ble brukt til å merke celler av epitelial opprinnelse og ble påvist i den røde kanal, mens fluoriserende antistoffer mot CD45 ble anvendt til å merke celler av hematopoietisk opprinnelse, og ble påvist i vidt røde kanal . CTCs ble definert som kjernedannelse, CK-positive, og CD45-negative, mens WBCs ble definert som kjernedannelse, men var CK-negative og CD45-positive (figur 1B).
CMC /CEC farging cocktail inkludert antistoffer for vimentin (VIM) og CD144. VIM markør ble brukt til å identifisere celler som gjennomgår EMT. Celler merket med fluorescerende antistoffer mot VIM ble detektert i den røde kanal. Antistoffer mot CD144 ble anvendt for å identifisere celler av endotelial opprinnelse. Merkede celler ble detektert i den grønne kanalen. Også den karakteristiske fargemønsteret for CD144 demonstrerer lokalisering på cellemembranen lettere identifisering av CECs. Resultatene av denne fargeprosessen ble kombinert med de fra den første flekk, som DAPI og CD45 signalene var fremdeles synlig. CMCs ble definert som kjernedannelse, VIM-positive, CK-negative, CD144-negative, og CD45-negative. CECs ble definert som kjernedannelse, CD144-positive, VIM-positive, CK-negative, og CD45-negative.
CSC fargeprosessen benyttes en høy følsomhet immunologisk metode med tyramide signalforsterkning (TSA ™, Life Technologies) for å påvise ekspresjon av kandidaten stamcelle markører, PIWIL2 og TPBG /5T4, som uttrykkes på et lavt nivå. Forsterkede signaler ble påvist i den grønne kanalen og ble brukt til å identifisere mulige cscs definert som kjernedannelse, stamcelle markør-positive, CK-positiv /negativ, VIM-positiv /negativ, CD144-negative, og CD45-negative. TPBG /5T4 uttrykk ble benyttet for å identifisere mulige lungekreft cscs mens PIWIL2 ekspresjon ble brukt for å oppdage antatte brystkreft cscs.
svært kontrollert filtreringsprosessen og den flertrinns fargings parametre ble optimalisert for å minimalisere detekteringen av falsk positive i frisk donor blod. Bruk av en proprietær blod samling rør som inneholder en optimalisert fiksativ formulering (Transfix
®), sammen med kontrollerte frakt og lagringsforhold bidro til den høye frekvensen av rapporterings resultater (98%).
Analytisk Resultater
Først vurderte vi resultatene av mikrofluidfilterenheten med en pigg-in modell som involverer H226 lunge kreftceller. En rekke 5-160 celler ble tilsatt i frisk donor blod og isolert bruker enheten. ICC farging og mikroskopiske analyser ble utført for å oppdage og nummerere kjernedannelse, CK-positive, og CD45-negative celler. Ensartethet av celletall observert blant triplikatprøvene indikerte høy reproduserbarhet (fig 1C). I tillegg observerte vi en høy korrelasjon mellom observert og forventet avkastning (R
2 = 0,99). Isolering av piggete celler var veldig effektivt, med en utvinningsgrad på 85% (Fig 1D). Med 5 piggete celler, ble lavere utvinning på 40% observert, og skyldtes tube etterlevelse og celle tap. Resultatene er helt sammenlignbare med de av CellSearch [22, 23]. For eksempel, CellSearch telling av delte, prøvene var 80% og 82% [22]. Allard og kolleger [23] rapporterte bedring med en 4-celle pigg viste standardavvik på 2 og 95% konfidensintervall fra 1-11, som er statistisk umulig å skille fra våre resultater med 5 celle pigg.
Klinisk testing
klinisk validering av mikrofluidfilterenheten ble utført på fullblodprøver fra pasienter med metastatisk brystkreft og lungekreft pasienter. For å bestemme bakgrunnsnivåer hos friske personer, ble blodprøver fra 30 kontroller også evaluert. Prøvene ble behandlet via mikrofluidfilterenheten, og cellene fanget på membranen ble farget for markører for å identifisere sirkulerende celler av interesse. Representative bilder av forskjellige celletyper er vist i figur 2.
representative bilder av sirkulerende tumorceller (CTC), hvite blodceller (WBC), sirkulerende mesenchymale celler (CMC), sirkulerende endotelceller (CEC), og putative sirkulerende stamceller (CSC) i metastatisk bryst (B) og lungen (L) kreftpasienter. Målestokk representerer 8 pm.
Pasient egenskaper er presentert i tabell 1. Av de 43 pasienter inkludert, 40 ble evaluert (S2 fig). Den endelige kohort var sammensatt av 19 brystkreftpasientene og 21 lungekreftpasienter. Av de 19 brystkreftpasienter, 95% var ER-positive og 26% var HER2-positive, mens 81% og 19% av lungekreftpasienter ble diagnostisert med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekarsinom ( SCLC), respektivt. Klinisk relevante driver mutasjoner, for eksempel i
EGFR
,
KRAS
, og
ELM4-ALK
fusjon, var til stede i 40% av lungekreftpasienter.
Forkortelser: ER-østrogen reseptor, NSCLC- ikke-småcellet lungekreft, SCLC- småcellet lungekreft
Påvisning og telling av sjeldne Sirkulasjonscelletyper
. analysert fargemønstre på fanget cellene ved hjelp av fluorescens mikroskopi for å nummerere CTCs, CMCs, CECs, og antatte cscs i blodet hos kreftpasienter og friske kontroller. Oppregningen Resultatene er oppsummert i tabell 2.
Forkortelser: Sirkulasjonstumorceller (CTC), sirkulerende mesenchymale celler (CMC), sirkulerende endotelceller (CEC) og antatte sirkulerende stamceller (CSC)
CTCs ble påvist i 35% av kreftpasienter, inkludert 47% av brystkreftpasientene og 24% av lungekreftpasienter (fig 3A). CTCs var stort sett fraværende fra kontroller, med unntak av en enkelt celle detekteres i en frisk donor (3%). CTC deteksjon i kreftpasienter var betydelig høyere enn hos friske kontroller (
p
0,001). Den midlere CTC nivå hos brystkreftpasienter (0,41 CTC /ml) var signifikant høyere enn hos lungekreftpasienter (0,04 CTC /ml,
p
= 0,03) (tabell 2, figur 4A).
Andel prøver med påvisbare sjeldne celler: A. sirkulerende tumorceller (CTC), B. sirkulerende mesenchymale celler (CMC), C. CTC og CMC, B. sirkulerende mesenchymalceller (CMC), D. antatte sirkulerende stamceller ( CSC), og E. sirkulerende endotelceller (CEC) i metastatisk brystkreft og lungekreft pasienter og friske kontroller. F. Andel pasienter med påvisbare cellegrupper. Prosent påvisning mellom grupper ble sammenlignet ved bruk av Fisher nøyaktige tester og ble betraktet som signifikant (*) når
p
-verdi var. 0,05, ellers ikke signifikante (ns)
Mean celler per ml for A. sirkulerende tumorceller (CTC), B. sirkulerende mesenchymale celler (CMC), C. CTC og CMC, D. antatte sirkulerende stamceller (CSC) og E. sirkulerende endotelceller (CEC) i metastatisk brystkreft og lungekreft pasienter og friske kontroller. En enkelt prøve t-test ble brukt for å sammenligne gjennomsnitts celler per ml til populasjonsgjennomsnitt på 0. En stjerne (*) viser en
p
-verdi 0,05, F. Sammenligning av oppregning resultater mellom CellSearch
® og mikrofluidfilteranalyse, G. avtalen i positive og negative samtaler mellom CellSearch
® og mikrofluidfilteranalyse i 16 blodprøver. Prøver med ≥5 sirkulerende tumorceller (CTC) pr 7,5ml av blod ble betraktet som positive ved hjelp av CellSearch
® assay mens prøvene med detekterbar CTC ( 0). Ble betraktet som positive ved hjelp av mikrofluidfilter-baserte analysen
CMCs ble påvist i 58% av kreftpasienter, blant annet 58% i brystkreft og 57% i lungekreft (figur 3B). CMC oppdagelse var signifikant høyere hos kreftpasienter enn hos friske kontroller, i hvem ingen CMCs ble oppdaget (
p
0,001). Mener CMC nivåene var 0,34 CMC /ml hos brystkreftpasienter og 2,37 CMC /ml hos lungekreftpasienter, som ikke var en signifikant forskjell (
p
= 0,23) (tabell 2, figur 4B).
Når påvisning av både epitel (CTCs) og mesenchymale (CMC) celletyper ble kombinert, CTC + CMC frekvens hos kreftpasienter var 70%, inkludert 79% for brystkreft og 62% av lungekreftpasienter, henholdsvis (fig 3C ). Dette var vesentlig høyere enn 3% deteksjonsraten hos friske kontroller (
p
= 0,001). Bety CTC + CMC nivået hos brystkreftpasienter (0,75 celler /ml) var ikke signifikant forskjellig fra den for lungekreftpasienter (2,41 celler /ml,
p
= 0,32) (tabell 2, figur 4C).
Antatte cscs ble påvist i 54% av kreftpasienter, inkludert 58% av brystkreftpasienter og 50% av lungekreftpasienter (fig 3D). CSC påvisning hos kreftpasienter var signifikant høyere (
p
0,001) enn hos friske kontroller, som ikke viser noen påvisbare cscs (fig 4D)
I sterk kontrast til CTCs, CMCs. og cscs, CECs var til stede i 43% av friske kontroller. CECs ble påvist i 55% av kreftpasienter generelt, inkludert 53% av brystkreft og 57% av lungekreftpasienter (figur 3E). CEC deteksjon frekvens var ikke signifikant forskjellig mellom kreftpasienter og kontroller. Totalt sett, CECs var de mest tallrike av cellepopulasjonen studert hos kreftpasienter (gjennomsnitt, 3,61 CEC /ml). Videre betyr dette CEC nivået hos kreftpasienter var betydelig høyere enn hos friske kontroller (0,47 CEC /ml,
p
= 0,007), Tabell 2, Figur 4E).
De gjennomsnittlige cellestørrelser for CMC, CEC og cscs var alle omtrent 10 uM i diameter (rekkevidde, 5-15 mm). Vi gjorde observere gjenvundne celler som var mindre enn porestørrelsen. Vi tillegger evnen til å felle mindre celler til tverrbinding effekten av paraformaldehyd fiksering. Videre har vi observert at filtrering gjenvinning var den samme for alle celletyper av tilsvarende størrelse. Andre filtreringssystemer har rapportert det samme gjenoppretting for dyrkede celler av samme størrelse, og redusert gjenoppretting for celler med mindre størrelser [11, 13, 24, 25].
Andre studier har rapportert nærvær av CK-positive og CD45-positive celler i blodet hos kreftpasienter [26, 27]; imidlertid var disse cellene ikke påvist i våre prøver. Vi oppdager tilfeldige klynger av celler i forskjellige cellepopulasjoner, spesielt for CECs (Fig 3F). Antatte cscs ble imidlertid bare påvist som enkeltceller. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i forekomsten av cellegruppene mellom lunge og brystkreftpasienter.
Sammenligning med CellSearch
® analysen
I 16 like blodprøver, CTCs ble analysert ved hjelp av både microfluidic filter-baserte analysen og CellSearch
® system. Direkte sammenligning av CTC deteksjon avdekket moderat avtale mellom de to analysene (Fig 4F, R
2 = 0,46; Fig 4G, kappa = 0,47).
Serieblodanalyse
I tre bryst kreftpasienter, serielle blodprøver ble analysert for å vurdere muligheten for å overvåke sirkulerende cellepopulasjoner over tid.
Pasient A var en 49 år gammel kvinne diagnostisert med ER-positiv, HER2-negativ metastatisk brystkreft. Blodprøver ble tatt på dag 0, 28 og 84 fra et klinisk forsøk (figur 5A). Microfluidic filter basert analyse viste en markant økning i alle sjeldne celle populasjoner (CTCs, CMCs, cscs, og CECs) mellom tidspunktene 2 og 3. I kontrast, gjorde parallell testing via CellSearch
® systemet registrerer ingen CTCs. Klinisk testing av serum tumormarkør ved matching tidspunkter CA 15-3 viste en tilsvarende økning mellom tidspunktene 2 og 3 (CA 15-3 nivåer: 84, 88, 124 U /ml). Etterfølgende klinisk vurdering bekreftet at pasienten opplevde sykdomsprogresjon.
Sirkulasjonstumorceller (CTC), utegående mesenchymalceller (CMC), sirkulerende endotelceller (CEC), og antatte sirkulerende stamceller (CSC) ble nummerert i blodet prøvene oppsamlet ved forskjellige tidspunkter (TP) i løpet av behandlingen. Y-aksen til venstre representerer skalaen for CTC, CMC, og CSC per ml blod, mens y-aksen til høyre representerer skalaen for CEC per ml blod. Klinisk respons ble evaluert ved hjelp Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) målekriterier.
Pasient B var en 54 år gammel kvinne diagnostisert med ER-positive, HER2-negativ metastatisk brystkreft. Blodprøver ble tatt på dagene 0 og 14. mikrofluidfilter-baserte analyser viste ingen påviselige CTCs i hver tidspunkt. CellSearch
® ble utført på en selvstendig prøve omtrent tre uker før den første mikrofluidfilter-baserte tester (dag -21), så vel som på en parallell prøve på tidspunktet punkt 2; disse på samme måte viste ingen påvisbare CTCs. Men nivåene av cscs var lav og uforandret. CMCs og CECs ble også oppdaget og synes nivåene å avta over tid (figur 5B). Serum CA 15-3 nivåer vurderes 26 dager før og 2 dager etter den første microfluidic filter-basert testing viste en svak nedgang (50 og 47 U /ml). Klinisk vurdering indikerte at pasienten hadde en delvis respons på kreftbehandling.
Pasient C var en 68 år gammel kvinne diagnostisert med ER-positive, HER2-negativ metastatisk brystkreft. Blodprøver ble tatt på dagene 0 og 30. mikrofluidfilterbasert analyse viste økte nivåer av sirkulerende alle sjeldne cellepopulasjoner på dag 30 (figur 5C). CellSearch
® testing av blodprøver tatt ved samme tidspunkt vises også en økning i CTC nivåer (7 og 17 CTCs per 7,5 ml blod). Klinisk vurdering avslørte sykdomsprogresjon.
Diskusjoner
Vi utviklet en ny analyse for anriking, deteksjon og telling av sirkulerende sjeldne celle populasjoner hos kreftpasienter. Protokollen består av to viktige trinn: berikelse ved filtrering ved hjelp av en mikrofluidanordning og sekvensiell multiplex farging for å identifisere sjeldne celletyper. Etter omfattende preklinisk testing, vurderte vi den kliniske resultatene av vår analyse i å oppdage og opplisting CTCs, CMCs, cscs, og CECs i blodet av metastatisk brystkreft og lungekreft pasienter.
En rekke microfluidic tilnærminger for isolering av CTCs har blitt rapportert [28-32]. For eksempel har den CTC-iCHIP, et automatisert mikrofluidseparasjonssystem blitt brukt for å isolere og analysere CTCs [28, 32]. Så vidt vi vet, har ingen av de eksisterende plattformene blitt brukt for multipleks deteksjon av sirkulerende sjeldne celler.
CTCs ofte ble påvist i bryst og lunge kreftpasienter, men var stort sett fraværende hos friske kontroller. Den midlere grad av CTCs var signifikant høyere i bryst sammenlignet med lungekreftpasienter, overensstemmelse med tidligere observasjoner ved bruk av CellSearch
®-analyse [10]. Head-to-head sammenligning av vår microfluidic filter metode vs. FDA-ryddet CellSearch
® systemet avdekket moderat avtalen.
Vi har tidligere rapportert muligheten for telling og isolering av CTCs av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) etter immunomagnetisk berikelse [33-35]. Imidlertid ble både Immunomagnetisk berikelse og FACS flekker basert på EpCAM uttrykk. Den filtrering baserte metoden som brukes i den aktuelle studien eliminerer avhengighet av overflatemarkører for identifisering av CTCs. Derfor, i tillegg til å CTCs med epitelial markør uttrykk, vår analyse også oppdaget at sirkulerende sjeldne celler med mesenchymale markør uttrykk. Faktisk CMCs ble påvist i 58% av kreftpasienter, og ingen ble påvist hos friske kontroller. Kombinert deteksjon av epitel (CTCs) og mesenchymale (CMC) sjeldne celletyper (dvs. CTC + CMC) var 79% og 62% i bryst og lunge kreftpasienter, henholdsvis, som representerer en potensiell økning i følsomhet med CTC eller CMC alene.
kreft stamcelle hypotesen tar for gitt at en sjelden undergruppe av tumorceller i stand til selvfornyelse og multipotency er ansvarlig for startfasen og vekst [36, 37]. Flere markører, inkludert CD44, CD24, og ALDH1, har blitt brukt til å oppdage og berike for mulige cscs fra solide tumorer [38-40]. I denne studien brukte vi to nye kandidat stamcellemarkører, PIWIL2 [41, 42] og TPGB /5T4 [43, 44], for å oppdage mulige cscs hos kreftpasienter. PIWIL2 er medlem av P-element-indusert pysete testikkel /argonaute (Piwi /siden) familie og spiller en viktig rolle i utviklingen av kjønnsceller [45]. Studier har nylig vist at PIWIL2 er uttrykt i forstadier til kreft og kreft stamceller [41, 42, 46, 47]. I tillegg er dette gen uttrykkes på forskjellige stadier av brystkreft, men ikke i normalt brystvev [48]. Den andre antatte stamcelle markør, trophoblast glykoprotein (TPBG /5T4), er en onkoføtal-protein som er uttrykt i føtale trofoblaster, det ytterste lag av celler i en pattedyr embryo [49]. Nyere studier har vist at TPBG /5T4 blir uttrykt i tumor-celler i å initiere lungekreft [43, 44], og høy ekspresjon i flere cancertyper har vært forbundet med dårligere klinisk utfall [43, 50-52]. I denne studien ble antatte cscs oppdaget i et flertall av bryst og lunge kreftpasienter, men var helt fraværende hos friske kontroller.
Endotelceller i omløp kan oppstå fra tumor angiogenese-relaterte prosesser hos kreftpasienter, samt som fra skade av den normale blodkar [53-55]. Endringer i CEC nivåer har blitt observert i en rekke sykdoms innstillinger, inkludert kreft, infeksjoner og hjerte-og karsykdommer [56-60]. CECs, derimot, er ofte observert i sykdomsfrie enkeltpersoner så vel [54, 55]. I vår studie, CECs var den mest tallrike av cellepopulasjoner studert i både kreftpasienter og friske; imidlertid, kreftpasienter ble vist å vise noe høyere nivåer. Dette funnet er konsistent med resultatene fra en tidligere studie som viser at flertallet av de sirkulerende sjeldne celler tatt av størrelsen utvalget var endotelceller [19].
For å demonstrere gjennomførbarheten av serieanalyse, sirkulerende sjeldne celler i valgt bryst kreftpasienter ble analysert ved forskjellige tidspunkter i løpet av behandlingen. Sammenligning av antall sirkulerende sjeldne celler med nivåene av etablerte kliniske markører, slik som CA 15-3 og CTC assay ved Cellsearch
®, viste lignende tendenser. I tillegg foreløpige observasjoner i denne lite antall pasienter viste at nivåene av sirkulerende sjeldne celler kan relatere til svar utfallet.
Selv om vår sekvensiell farging tilnærming til slutt gir svært rene cellepopulasjoner, celle utvinning kan ytterligere forbedres ved å evaluere forskjellige filtrer og filtreringsparametere [13, 15]. Også, parallelt testing med forskjellige isoleringsmetoder, inkludert flowcytometri, kan utføres for å sammenligne fangingseffektiviteter.
Vår tilnærming overfor tilsvarende begrensninger som med andre størrelses-baserte metoder.
