Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er den nest største årsaken kreftrelaterte dødsfall i utviklede land. Tidlig påvisning av CRC fører til redusert CRC dødelighet. En blodbasert CRC screening test er svært ønskelig på grunn av begrenset invasivitet og høy akseptgrad blant pasienter i forhold til i dag brukt fekal okkult blod testing og kolonoskopi. Her beskriver vi oppdagelsen og validering av en 29-gen panel i perifere mononukleære blodceller (PBMC) for påvisning av CRC og adenomatøse polypper (AP). Blodprøver ble prospektivt samlet inn fra en multisenter, case-control klinisk studie. Først profilert vi 93 prøver med 667 kandidat- og tre referanse gener ved høy gjennomstrømning real-time PCR (OpenArray system). Etter analyse ble 160 gener beholdt og testet igjen på 51 flere prøver. Lave uttrykte og ustabile gener ble forkastet som resulterer i en endelig datasett av 144 prøver profilert med 140 gener. For å definere hvilke gener, alene eller i kombinasjoner hadde høyest potensial til å diskriminere AP og /eller CRC fra kontrollene, ble data analysert av en kombinasjon av univariate og multivariate metoder. En liste over 29 potensielt diskriminantfunksjoner gener ble utarbeidet og evaluert for prediktiv nøyaktighet ved straffet logistisk regresjon og bootstrap. Denne metoden diskriminert AP 1 cm og CRC fra kontrollene med en sensitivitet på 59% og 75%, henholdsvis, med 91% spesifisitet. Oppførselen til 29-genet panel ble validert med en LightCycler 480 real-time PCR plattform, ofte vedtatt av kliniske laboratorier. I dette arbeidet har vi identifisert en 29-gen panel uttrykt i PBMC som kan brukes for å utvikle et nytt minimalt invasiv test for nøyaktig deteksjon av AP og CRC ved hjelp av en standard real-time PCR plattform
Citation:. Ciarloni L, Hosseinian S, Monnier-Benoit S, Imaizumi N, Dorta G, Ruegg C, et al. (2015) Oppdagelsen av en 29-Gene Panel i perifere mononukleære blodceller for deteksjon av tykktarmskreft og Adenomer Bruk høy gjennomstrømning Real-Time PCR. PLoS ONE 10 (4): e0123904. doi: 10,1371 /journal.pone.0123904
Academic Redaktør: Antonio Moschetta, IRCCS Istituto Oncologico Giovanni Paolo II, ITALIA
mottatt: 08.12.2014; Godkjent: 27 februar 2015; Publisert: 13 april 2015
Copyright: © 2015 Ciarloni et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Diagnoplex SA. Den Funder gitt støtte i form av lønn for forfattere LC, NI, SMB, SH, men har ikke noen ekstra rolle i datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § forfatteren bidrag «
Konkurrerende interesser:. LC SH SMB NI var ansatte i Diagnoplex SA på tidspunktet for undersøkelsen. Også de eier opsjoner i Diagnoplex SA. CR er en co-grunnlegger, rådgivende styremedlem og eier aksjer og andeler av Diagnoplex SA. GD har fungert som foredragsholder, konsulent og rådgivende styremedlem for Diagnoplex SA, og har fått forskningsmidler fra Diagnoplex SA. Dette endrer ikke vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen og andre ledende årsak til kreft dødsfall blant menn og kvinner i Europa [1]. Viktigere er CRC ofte kureres, når diagnostisert på et tidlig stadium. Videre oppdagelse og fjerning av adenomatøse polypper (AP) hindrer CRC dannelse og reduserer dødelighet av CRC. Flere land har allerede vedtatt screening modaliteter for CRC og kliniske retningslinjer anbefaler at gjennomsnittlig risiko individer begynne regelmessig screening ved 50 års alder [2, 3]
Koloskopi er «gullstandard» for AP og CRC diagnose, men det er ikke den foretrukne metoden for masse screening på grunn av sin pris, invasivitet, lav compliance og begrenset tilgjengelighet. Foreløpig anbefales ikke-invasive metoder for masse screening inkluderer immunkjemiske og guaiacum fekal okkult blod testing (iFOBT, gFOBT). Likevel er samsvar med fekal tester fortsatt suboptimal i land med en FOBT screening-program [4, 5, 6]. Derfor er det fortsatt et stort udekket behov ringer for en ikke- eller minimalt-invasiv, kompatibel, kostnadseffektiv og nøyaktig screening test for å oppdage AP og CRC på tidlige stadier. En blodbasert screening test er svært attraktivt på grunn av sin minimal invasivitet og høy aksept blant pasientene. I særdeleshet har vi og andre rapportert signaturer avledet fra perifere mononukleære blodceller (PBMC) genekspresjonsprofiler forbundet med fordøyelses [7, 8, 9, 10], bryst [11], renal [12, 13], lunge [14] og blære kreft [15]. Disse testene er konseptuelt forskjellig fra klassiske tumor biomarkør tester, som de er basert på påvisning av vertens respons på tumor-avledede signaler [16, 17] i stedet for på markører som stammer fra selve svulsten.
Ved søk for forskjeller i genekspresjon og identifisering av RNA-transkripter som senere skal anvendes som potensielle biomarkører, vanlig anvendte metoder omfatter mikromatrisebasert DNA-hybridiserings-plattformer eller RNA-baserte sekvenseringsteknikker [18, 19]. Selv kraftig, disse metodene er komplisert, tidkrevende og kostbart, og generere høyt volum av data som krever spesialisert bioinformatikk verktøy og kompetanse for sine analyser. Dessuten er identifiserte gener av interesse kreve ytterligere validering av mer nøyaktige og følsomme metoder slik sanntid qPCR, før de kan oversettes til klinisk anvendelige tester [20]. I alternativ til disse metoder, høy gjennomstrømning sanntids qPCR plattformer vist seg å gi gode resultater når kandidat-gen utvalg ble drevet ved fast vitenskapelig dokumentasjon, til tross for det faktum at de tillater analyse av bare en brøkdel av den transkriptomet [21]. Viktigere, biomarkør funn basert på qPCR plattformer har den store fordel at en ytterligere valideringstrinnet i betraktning av deres kliniske anvendelse er ikke nødvendig. Videre er de vesentlig mindre kostbare enn hele genomet nærmer seg, slik at analysen av et større prøvesett og dermed øke den statistiske kraften av studien.
Her vi rapporterer oppdagelse og karakterisering av en 29-genet i panel PBMC for påvisning av kolorektal adenomer og karsinomer ved hjelp av et nanoliter høy gjennomstrømning qPCR plattform (OpenArray) [22]. For dette formålet brukte vi prøver prospektivt samlet inn fra en multisenter, case-control studie der pasientene ble henvist til koloskopi eller planlagt for kirurgi for CRC fjerning. Vi har også vist at genet panelet kan lett overføres og implementeres i et medisinsk laboratorium-vennlig analysen, som er et viktig skritt i utviklingen av en ny kostnadseffektiv, enkel blod-basert colorectal cancer screening test.
Materiale og metode
Pasienter
En case-control studie (DGNP-COL-0310), inkludert tre sørkoreanske og seks sveitsiske sentre som registrert 1665 individer eldre enn 50 år som ble henvist for koloskopi av allmennlege eller var planlagt for kirurgi, ble gjennomført fra juni 2010 til april 2013. undersøkelsen ble spesielt utviklet og designet for utvikling og validering av en ny test for CRC screening. Den biomarkør discovery fasen fant sted i løpet av første halvdel av rekruttering av pasienter. For dette formålet, en undergruppe av 144 individer, fordelt til kontroll, CRC og AP grupper (tabell 1), ble tilfeldig valgt, og brukes til genuttrykk profilering av høy gjennomstrømming qPCR.
Temaer hadde ingen første-graders familiehistorie med CRC eller en kjent CRC predisposisjon, tidligere historie av polypper eller kreft, inkludert CRC, ingen hepatobiliære, urin, autoimmune og inflammatoriske lidelser, inkludert inflammatoriske tarmsykdommer, smittsomme sykdommer og feber innen 4 uker før koloskopi. Kroniske sykdommer som er vanlige i populasjonen, slik som diabetes, hypertensjon, hyperkolesterolemi, hjertesvikt, ble ikke betraktet som eksklusjonskriterier. En kontroll gjenstand ble definert som et individ uten fortid og nåtid historie med tykktarms skader eller sykdommer (f.eks små adenomer, hyperplastiske polypper, kreft). AP gruppe inkludert individer diagnostisert med en adenom større enn 1 cm, basert på det endoskopiske målingen. Barnekonvensjonen gruppen inkluderte pasienter med karsinom i alle fire TNM stadier. Endelig diagnose var basert på koloskopi og histopatologisk evaluering.
Etisk godkjenning
Studiet protokollen (DGNP-COL-0310) ble godkjent av vedkommende gjennomgang tavler og etiske komiteer for forskning som omfatter mennesker av Canton Bern, Sveits (Kantonale Etikkommission Berne, No KEK 139/10), Canton St. Gallen, Sveits (Ethikkommission des Kantons St. Gallen, nr EKSG 10/091 /1B), Canton Vaud, Sveits (kommisjons Cantonale d’éthique de la recherche sur l’être menneske, nr VD 77/10), Canton Basel, Sveits (Ethikkommission beider Basel, nr EKBB 242/10), av Severance Hospital, Yonsei University School of Medicine, Sør-Korea (No. 4-2010-0128) og av Institutional bioetikk Review Board of Seoul National University Hospital, Sør-Korea (IRB-nr H-1004-020-315). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne følger de lokale etiske retningslinjer.
Blood innsamling og behandling
Tilleggs blod fra alle fag ble trukket enten opp til 30 dager før eller inntil 12 uker etter koloskopi og før eventuelle polypper eller kreft reseksjon eller preoperativ kjemoterapi. Blodprøvene ble samlet i 4×4 ml BD Vacutainer CPT-rør (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Fylt CPT-rør ble oppbevart i romtemperatur og PBMC separasjon utføres innen 6 timer i henhold til produsentens instruksjoner. PBMC pelleter ble resuspendert i RNA
senere
Solution (Life Technologies, Carlsbad, CA) og lagret ved -80 ° C.
RNA-fremstilling
Automatisert rensing av totalt RNA var utført på Qiacube av RNeasy Mini kit (Qiagen, Venlo, Nederland) og inkluderte en DNase-behandling. RNA-konsentrasjon ble målt ved Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA) og RNA integritet ble analysert ved Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Prøver med RIN 7 ble vurdert av dårlig kvalitet og kastet. I gjennomsnitt RNA viste en RIN av 9 ± 0,5. Isolert total RNA ble alikvotert og lagret ved -80 ° C. For å møte de høye RNA-konsentrasjonen som kreves av RT-protokollen, ble RNA prøver systematisk utfelles etter en standard 100% etanol /3M natrium-acetat-metoden.
Screening utforming og datasett generasjon
i orden å finne relevante blod biomarkører for CRC, utførte vi genekspresjon screening på 144 prøver fra pasienter med AP eller CRC og kontrollpersoner. Screeningen ble unnfanget i 2 faser (fig 1). For det første profilert vi 93 prøver med en stor gen panel. Panelet inkluderte 667 kandidat, hvorav 42 biomarkører tidligere identifisert ved vårt laboratorium [8] og 625 ny kandidat valgt fra litteraturen (S1 tabell). Tre referanse gener for qPCR data normalisering ble også lagt til. Litteratursøket fokusert på gener, molekylære stier og biologiske prosesser som anses å være relevant i svulsten-vertsrespons som inflammasjon og immunrespons, tumorinvasjon og metastase, hematopoiesis, signaltransduksjonsveier (spesielt NF-kB pathway), kjemokiner og cytokiner (i særdeleshet IL-1, IL-2), ekstracellulære matriksproteiner, adhesjonsmolekyler og celleoverflatemarkører. For hver kandidat genet, ble en TaqMan analysen valgt fra en kommersiell depot (Life-teknologi, Carlsbad, CA) (S1 Table) og fordelt i tre 224-analyse Åpne Array plater, som hver måler 12 prøver parallelt. Derfor, for å fullprofil 12 prøver, tre 224-analyseplater, thermocycled i parallell, ble anvendt. For å sjekke for inter-plate variabilitet og reproduserbarhet ble referansen genet RPLP0 analysert for hver prøve på alle 3 plater. RPLP0 standardavvik (SD) analyse av 3 replikater prøven viste en median SD av 0.21 Ct, med en inter-kvartil området 0,14 til 0,34, noe som indikerer at prøven måling var nøyaktig og reproduserbar på tvers av 3-plate-serien. I denne fasen har vi fokusert på å fange den bredeste emnet biologisk variabilitet i stedet for å minimere den tekniske en derfor systemaprøve replikater ikke ble utført, for å tillate profilering av et maksimalt antall prøver.
I en første fase som utføres screening på OpenArray systemet, ble 670 gener profilert på 93 prøver. Av disse ble 163 gener utvalgt og testet videre i fase 2 på ytterligere 51 prøver. Den endelige datasettet inkludert 144 prøver profilerte med 163 gener. En 29-gen panel ble utarbeidet basert på høyeste makt til å diskriminere AP /CRC fra kontrollene ved univariat og multivariat analyse. Til slutt ble 29-genet panel validert med en LightCycler480 plattform, som vanligvis brukes i kliniske laboratorier.
Ut fra 670 gener som ble analysert, 133 viste ingen ekspresjon eller en dårlig PCR-amplifisering. De resterende 534 kandidat gener og 3 referanse gener ble samlet godt uttrykt med en median Ct på 22,94 (inter-kvartil range: 21,28 til 25,24) og en median SD på 0,7 (inter-kvartil Område: 0,59 til 1,04) (S2 tabell). Gene profiler føres gjennom en lys filtreringstrinn hvor de måtte tilfredsstille minst ett av de følgende kriterier for i det minste en av de diskriminering analyse (
i
.
e
. Kontroll versus CRC eller kontroll versus AP): en p-verdi mindre enn 0,1 eller en fold-endring større enn 1,5 (lineær skala). I tillegg biomarkører tidligere identifisert i vårt laboratorium [8] ble beholdt i denne fase uansett deres p-verdi eller fold endring for å bli vurdert i en større prøvesett og anvendelse av en multivariat statistisk tilnærming. I alt ble 160 gener valgt, sammen med de tre referanse gener, for den andre fase av screening. Denne gangen 163 gener, målt ved 168 assays (5 gener med meget lav ekspresjon hadde en annen analyse for å validere tiltaket erholdte), ble tildelt i en enkelt plate (S3 tabell). Andre 51 prøver ble profilert i duplikat med dette redusert genet panelet for å øke størrelsen på utvalget og den statistiske kraft i etterfølgende analyser. Også 40 prøver som allerede er profilert i fase 1 ble gjen analysert for å sikre reproduserbarhet av målingene på tvers av fase 1 og fase 2 og den annen plate format (224-
vs
. 168-assay-format). Uttrykket nivåer oppnådd i begge faser for disse 40 prøvene var sterkt korrelert (R
2 = 0,993) (S1 figur), spørre oss å kombinere de 93 og 51 prøver, profilerte for de 163 genene, i en enkelt endelig datasett ( Figur 1). For å kompilere datasettet, ble middelverdiene av de 40 prøvene målt i duplikater brukes.
nanoliter høy gjennomstrømning qPCR
Ni hundre ng av total RNA ble revers transkribert i 20 ul volum med høy -Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies, Carlsbad, California) med tilfeldige primere, i henhold til produsentens instruksjoner.
Gene uttrykk profilering ble utført ved hjelp av OpenArray system [22] (Life Technologies, Carlsbad, California) en nanoliter høy gjennomstrømming real-time PCR plattform, slik at 3.072 reaksjoner i en enkelt plate. PCR-reaksjoner ble utført i henhold til den TaqMan OpenArray sanntids plater protokollen. Kort, PCR reaksjonsblandinger som inneholder 2,5 mikroliter GeneAmp Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, California), 1 ul TaqMan OpenArray Remix (Applied Biosystems, Carlsbad, California), 0,3 mL RNase-fritt vann, og 1,2 pl cDNA, var lastet automatisk i ett eller to eksemplarer reaksjon i de OpenArray plater ved hjelp av en OpenArray AccuFill instrument i henhold til produsentens protokoller. Den termiske sykluser protokoll bestod av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. På slutten av hvert løp, bildene, samlet før og under PCR løp, ble visuelt inspisert for å sjekke for prøve misloading eller plater leseproblemer. Ct-verdier ble beregnet av OpenArray analyse programvare ved hjelp av automatisk terskel med Ct tillit minimum signal satt til 300. Verdier under minimum signalinnstilling indikert en mislykket reaksjon eller ingen forsterkning og manglende verdier dukket opp i de eksporterte dataene. Mesteparten av tiden en mislykket reaksjon skyldes ekspresjonsnivåene utover påvisningsgrensen. Siden den maksimale Ct detektert var dårligere enn 36, ble disse verdier erstattet av vilkårlig Ct-verdien på 36. Det mangler verdier vurderes å være forårsaket av tekniske grunner ble erstattet med median Ct-verdiene for det aktuelle genet i alle prøver. En referanse RNA (Xpress Ref human Universal total RNA) (Qiagen, Venlo, Nederland) var til stede som positiv kontroll minst en gang i hver PCR-sikt for å sikre fremgangsmåte og reagens stabilitet samt reproduserbarhet over forskjellige PCR løper. Negative kontroller inneholder vann i stedet for cDNA ble brukt til å utelukke mulige DNA-kontaminering.
Sanntids qPCR på 384-brønners plater
To hundre ng av total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av Super VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
Realtime klar Custom RT-qPCR analyser (Roche, Basel, Sveits) basert på Universal ProbeLibrary (UPL) teknologi (S4 tabell), var forhåndsinstallert på 384-brønners plater av produsenten. Real-time PCR-analyse på 384-brønns plater ble utført på LightCycler 480 instrument (Roche, Basel, Sveits) på 144 prøver. PCR-reaksjoner ble utført i duplikater i 384-brønns plater i et totalt volum på 10 pl. Hver brønn ble lastet av en automatisert pipetten (Microlab Starlet, Hamilton Robotics, Reno, Nevada) med 5 mL av Realtime Ready DNA prober Master Mix (Roche, Basel, Sveits) og cDNA tilsvarer 2,5 ng total RNA. QPCR program besto av 2 sekunder ved 95 ° C og 30 sekunder ved 60 ° C i 40 sykluser. Positive og negative kontroller ble generert med hver retrotranscription batch og ble inkludert i hver qPCR løp for hvert mål analyse. Den negative kontrollen inneholdt verken RNA eller cDNA å bekrefte ingen forurensning skjedde. Den positive kontrollen ble gjort med en standardisert mengde av menneskelige Universal Reference RNA (Clontech, Mountain View, California) porsjonert og lagret ved -80 ° C. For qPCR løpe validering, ga den negative kontrollen uten forsterkning eller et krysningspunkt (Cp) verdi opp eller lik 35, og den positive kontroll en Cp verdi, for hvert mål-genet, som falt innenfor et forhåndsbestemt område. Cp verdier ble beregnet automatisk med LightCycler 480 analyse programvare i henhold til 2
nd derivat maksimal metoden [23].
Statistisk analyse
PCR data avledet fra OpenArray og LC480 plattformer ble normalisert ved ΔCT metode med gjennomsnittet av tre housekeeping gener RPLP0, NACA og TPT1. Disse genene ble valgt fordi de var den mest stabile i 3 PBMC-relaterte mikromatrisesettet tilgjengelig fra GEO databasen [24] og også i qPCR-analyse utført av oss (data ikke vist).
Genekspresjon ganger endring, ble definert som med, hvor er de normaliserte data.
Wilcoxon rank test [25] ble brukt på de normaliserte genuttrykk data for å definere gener signifikant forskjellig uttrykt mellom gruppene. I tillegg, i fase 2 screening, ble Wilcoxon rank test anvendt på 500 tilfeldig valgte datasett (bootstrap) og signifikans ble satt til gener som opptrer signifikant (p-verdi 0,05) i minst 250 skostropper ut av 500.
Den multivariat analyse brukes for funksjonsvalg i fase 2 screening omfattet følgende metoder:. K-top scoring par, en parameter-fri, trekk utvalg algoritme [26], og straffet logistisk regresjon metode med forskjellige algoritmer [27, 28]
for å evaluere prediktiv nøyaktighet på 29-genet panel, ble straffet logis regresjonsmodeller montert på datasettet og validert av ikke-overlappende bootstrap metoden [29]. Fem hundre tilfeldige datasett ble trukket med erstatning fra datasettet; hver bootstrap hadde samme størrelse som treningssettet. Modellen ble re-montert på hver bootstrap og godkjent for ut-av-bag prøver. Spesifisitet og sensitivitet gjennomsnittsverdier 500 skostropper ble beregnet og mottaker Driftsegenskaper (ROC) kurver ble generert ved å plotte følsomhet mot falsk positiv rate (1-spesifisitet). Areal under kurven (AUC) ble beregnet.
Pearson korrelasjonskoeffisient ble brukt til å evaluere lineær sammenheng mellom gener «målinger av to instrumenter.
R statistikk miljø ble brukt for statistiske analyser.
Resultater
Definisjon av en 29-gen panel for tykktarmskreft og adenom påvisning
Datasettet settet~~POS=HEADCOMP genereres fra fase 2 screening (163 gener og 144 prøver) ble analysert og filtrert for lav ekspresjon og ustabile gener på tvers av de to faser, og 20 gener ble ytterligere fjernet, redusere antall kandidatgener til 140. dataene ble undersøkt for å definere hvilke gener, alene eller i kombinasjoner, hadde den høyeste strøm for å diskriminere CRC , AP og AP sammen med tidlig stadium CRC (AP + CRC i-II) fra kontrollgruppen (tabell S3). I tillegg ble CRC gruppen sammenlignet med AP gruppe, for å identifisere spesifikke gener i stand til å skille mellom CRC og AP. Generelt er de fleste av genene syntes å være oppregulert i CRC og AP-grupper sammenlignet med kontrollgruppen. Den observerte genuttrykk kaste endringene var relativt beskjeden, som ikke overstiger en faktor på 2,3 (log2 = 1,22) (figur 2). Når et filter basert på en FC 1,3 og p-verdi 0,05 ble brukt på alle gruppesammenligninger (CRC /Con, AP /Con, AP + CRCI-II /Con, CRC /AP), fant vi 28 gener som er fornøyd begge kriteriene (S3 tabell). Blant disse 14 diskriminere CRC og 8 AP fra kontrollgruppen (figur 2), hvorav to var felles for begge forhold (CES1 og IL1B). Sju var bestemt bare for å skille AP fra CRC og en for kresne AP + CRC I-II. Gener ble bekreftet å være signifikant når statistisk testing ble brukt til 500 tilfeldig genererte datasett (bootstrap, data ikke vist).
Vulkanen tomter oppsummere genuttrykket fold-endringer (FC) (
x-aksen
) og p-verdiene (
y-aksen
) for sammenlikningene: A, CRC versus kontroll eller, B, AP versus kontroll. P-verdi cutoff ble fastsatt til 0,05 (horisontal linje) og fold-endring terskel på ± 0,38 (tilsvarer ± 1,3 i lineær skala, vertikal linje). En FC lik 1 betyr at genet blir uttrykt i gruppen av interesse, i gjennomsnitt, dobbelt så mye enn i kontrollgruppen.
multivariabel analyse ble anvendt til datasettet for å diskriminere CRC, AP AP + CRC fra kontrollgruppen. Det følger med KTS-pair [26] og fem forskjellige algoritmer basert på straffet logistisk metode [27, 28, 30] for variable valg og modell montering. Gener ble rangert i henhold til hyppigheten av valget av metoden som brukes som er oppsummert i det multivariable stillingen. Tretti-åtte gener med en score på minst to ble beholdt for å kompilere den endelige genet liste (S3 tabell).
Den univariate og multivariate genet listene var da slått sammen, noe som resulterer i en endelig liste over 29 gener (tabell 2). Interessant, de fleste av de univariate topp-scoring gener syntes å være også de beste-scoring gener i den multivariate analysen. Fire gener (MAP2K3, MAPK6, CD63, ITGB5), ekskludert av filteret av univariate analysen fordi FC 1,3, men statistisk signifikant (p-verdi 0,05), ble «reddet» av den multivariate analysen. Av de andre 10 gener ikke statistisk signifikante og integrert i de endelige listene takket være multivariate tilnærming (GATA2, LTF, MMP9, CXCL10, MSL1, RHOC, FXYD5), de tre første viste en FC . 1.3
Funksjonell analyse utført med oppfinnsomhet Pathway Analysis pakken (IPA, www.qiagen.com/ingenuity), avslørte at panelet ble beriket i gener involvert i leukocytter migrasjon og chemotaxis (CCR1, CXCL10, CXCL11, CXCR3, IL1B, IL8, ITGA2, MMP9, S100A8) (tabell 3). Disse cellefunksjoner er tett knyttet til immuncelletrafikken og betennelse. Meget representert var også gener som er involvert i celledeling og differensiering (BCI3, CD63, EGR1, GATA2, juni, LTF, MAPK6, MMP11, NME1, PPARG, TNFSF13b), noe som reflekterer en mulig rolle i hematopoiesis.
Validering av 29-genet panel
for å evaluere den kliniske relevansen av vår 29-gen panel, spesielt sin prediktiv nøyaktighet, straffet logistisk regresjon ble brukt til datasettet og montert modeller ble validert av ikke-overlappende bootstrap metode. Modeller kan diskriminere CRC eller AP 1 cm fra kontrollene med en gjennomsnittlig sensitivitet på 75% og 59%, respektivt. Den gjennomsnittlige spesifisitet, definert som antall kontroller korrekt klassifisert i løpet av det totale antall kontroller, var 91%. ROC analyse bestemmes en AUC på 0,88 (0,83 til 0,92, 95% KI) og 0,85 (0,78 til 0,91, 95% KI) for CRC eller AP deteksjon, henholdsvis (figur 3). Når den samme tilnærmingen ble brukt på 15 topprangerte gener for CRC eller AP diskriminering av univariat analyse bare (tabell 2), prediktiv nøyaktighet drastisk redusert. Når spesifisitet ble satt til 91%, ble CRC detektert med en sensitivitet på 65% og AP med en sensitivitet på 37%, med en AUC på 0,86 (0,77 til 0,84, 95% CI) og 0,77 (0,70 til 0,82, 95% KI ), respektivt. Dette resultatet støttes vårt valg av å integrere univariat og multivariat tilnærming for genet valg: gener som ellers ville ha blitt forkastet fordi ikke møte fast p-verdi og FC kriterier, var faktisk verdifull for CRC og AP deteksjon som anses av multivariate metoder
A. Oppsummering av de falske og sanne positive tallene for den 29-genet panel i klassifisering av CRC tilfeller. B. Oppsummering av de falske og sanne positive tallene for den 29-genet panel i klassifisere AP tilfeller. Analyser ble utført ved anvendelse av 500 bootstrap validering. De boksplott, er fordelingen av de 500 bootstraps. Den svarte linjen viser gjennomsnittsverdiene enn 500 skostropper for klinisk spesifisitet og sensitivitet.
analysen migrering til en 384-brønners plate qPCR plattform
OpenArray plattformen vist seg å være verdifulle for høy gjennomstrømming genuttrykk profilering og biomarkører. Men dette er plattformen ikke egnet i et rutinemessig klinisk laboratorieomgivelser, i hvilken enkelhet ved bruk, fleksibilitet og lave kostnader er foretrukket. Med sikte på å utvikle den 29-genet panel i et mye brukt CRC screening test, vurderte vi panel oppførsel på en qPCR plattform som er allment vedtatt av kliniske laboratorier. De 144 prøvene ble profilert med 29-genet panelet med en LightCycler 480 (LC480) instrument og et sett med kommersielt tilgjengelige probe-baserte analyser (Universal ProbeLibrary, Roche), forhåndsinstallert på 384-brønners plater.
korrelasjon og lineær regresjonsanalyse viste at genuttrykk nivåer målt på de to plattformene var svært sammenlignbare (korrelasjonskoeffisient: 0,933) (figur 4A). Generelt genekspresjon viste lik varians på tvers av prøvene (figur 4B). Imidlertid viste en gruppe av beskjeden uttrykte gener målinger med mindre standardavvik på LC480 plattformen for på den OpenArray en, noe som tyder på at analysene på LC480 instrument er mer nøyaktig. Når vi gjentok differensial genekspresjonsanalyser mellom kontroller og CRC grupper med LC480 datasettet, fant vi at den relative overflod og statistisk signifikans for de 29 genene var lik eller med lignende trend til hva observert på OpenArray datasettet (fig 4C og 4D) . Men for fem gener (PTGES, MMP11, IL8, CCR1, S100A8) statistisk signifikans ble tapt da målt på LC480.
Scatter tomter sammenlignende analyser utført for hvert gen på datasett generert på LC480 og OpenArray plattformer . Følgende variabler er blitt brukt: A. Mean normaliserte uttrykk verdier (ΔCp og ΔCt) (R
2: 0,933), B. Gjennomsnittlig standardavvik (SD) i forhold til hvert mål gen målt, C. Gene uttrykk fold endringer mellom CRC og kontrollgruppen (lineære absolutte verdier), D. p-verdier fra statistisk testing mellom CRC og kontrollgruppen (log transformert). Linjene representerer en p-verdi 0,05. Gene navn har blitt overlappet til grafene
Diskusjon og konklusjoner
I dette arbeidet har vi identifisert en 29-gen panel uttrykt i PBMC, i stand til å diskriminere personer med AP 1 cm eller CRC fra friske individer. Straffet logistisk regresjonsanalyse klassifisert korrekt 75%, 59% (følsomhet) og 91% (spesifisitet) for CRC, AP og kontroller, henholdsvis.
Den tilnærmingen vi brukte er annerledes i forhold til eksisterende screeningtester for CRC, som den er basert på PBMC gener uttrykk profiler. Dette utnytter de godt etablerte begrepet tumor-host samhandling og bidrag fra benmarg-avledede celler til tumorprogresjon [16, 17]. Det er av interesse at AP, muligens premaligne lesjoner, blir også detektert, om enn med en lavere følsomhet, av den 29-genet panel. Faktisk er inflammasjon assosiert med neoplastiske kolon polypper formasjon [31] og inflammatoriske tarmsykdommer, særlig ulcerøs kolitt, er en risikofaktor for CRC [32]. Viktigere, ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler beskytte mot CRC utvikling [33], forebygge adenom dannelse i eksperimentelle modeller av familiær adenomatøs polypose coli [34] og reversere genuttrykk endringer i normal kolon for å adenom sekvens [35]. Dette forsterker ideen om at den foreslåtte tilnærmingen kan være utviklet for AP og tidlig CRC oppdagelse som mer effektivt alternativ til fekal okkult blodbaserte tester. Bassenget av 670 kandidat gener som brukes til screening inkluderte mange verts gener og stier involvert i inflammasjon, immunrespons og tumorprogresjon. Viktigere, ble disse genene ikke valgt basert på en forutgående genom-wide screen, men basert på eksisterende kunnskap (dvs. litteratur og egne data) og hypoteser (dvs. rollen betennelse i kreft progresjon). De fleste av disse 29 gener av panelet er mediatorer /regulatorer av inflammasjon, celle motilitet, celleoverlevelse, cellesignalisering og formering (tabell 2 og 3). Dette er i overensstemmelse med ideen om at tumor-mobilisert benmargavledede sirkulerende myelomoncytic cellene er i en tilstand av aktivering i respons på tumor utgitt faktorer.
