Abstract
Hedgehog (Hh) signal- spiller viktige roller i ulike utviklingsprosesser, og dens avvikende reguleringen medfører genetiske lidelser eller maligniteter i forskjellige vev. Hyperaktive av Hh signalering er assosiert med lungekreft utvikling, og det har vært et omfattende arbeid for å undersøke hvordan å kontrollere Hh signalveien og regulerer kreftcelle spredning. I denne studien undersøkte vi en rolle CDO, en Hh co-reseptor, i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Inhibering av Hh signalisering av SANT-1 eller siCDO i lungecancerceller redusert spredning og tumorigenisitet, sammen med reduksjon i ekspresjon av de Hh komponentene. Histologisk analyse med NSCLC mus vev viste at CDO ble uttrykt i avansert grad av kreft, og nettopp samlokalisert med GLI1. Disse data tyder på at CDO er nødvendig for spredning og overlevelse av lungekreft celler via Hh signale
Citation. Leem YE, Ha HL, Bae JH, Baek KH, Kang JS (2014) CDO, en Hh-coreceptor , formidler Lung Cancer Cell Proliferation og tumorgenisiteten gjennom Hedgehog signalering. PLoS ONE 9 (11): e111701. doi: 10,1371 /journal.pone.0111701
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 02.06.2014; Godkjent: 01.10.2014; Publisert: 04.11.2014
Copyright: © 2014 Leem et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (MSIP) (2012R1A1A2005448 til YEL) og (NRF-2011-0017315 til JSK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hh signalveien er en av essensielle signalveier, som er implisert i embryonisk utvikling, morfogenese og proliferasjon [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Den molekylære mekanismen hvordan å regulere Hh signalering er fortsatt under etterforskning. Vanligvis, når Hh ligand binder seg til sin primære reseptor, Lappet 1 (PTCH1), glattet (SMO) frigjøres fra PTCH1 hemming og migrerer til primær cilium. Stimulering av SMO utløser sekvensiell signaltransduksjon som aktiverer transkripsjonsfaktorer av GLI familien. Den aktive form av GLI protein blir translokert til kjernen og regulerer ekspresjon av nedstrøms målgener, inkludert PTCH1 og GLI1 [1], [7], [8].
Tapet av Hh-signalering under embryonal utvikling er forbundet med flere genetiske lidelser inkludert holoprosencephaly, som er den vanligste misdannelse av forhjernen [9], [10], [11]. I motsetning til dette, har konstitutiv aktivering av Hh signale vært kjent for å være involvert i initiering og progresjon av mange kreftformer i huden (sporadisk basalcellekarsinom, BCC), hjerne (medulloblastom), muskler (rhabdomyosarkom, RMS), mage-tarmkanalen, prostata, bukspyttkjertel og lunge [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] . Koblingen av Hh veien til kreftutvikling ble først rapportert i Gorlin syndrom hvor mutasjon i
PTCH1
genet er ansvarlig for forekomsten av kreft [24]. Videre er avvikende oppregulering av Hh signaliserer gjennom tap av PTCH1 eller gevinst-of-funksjon mutasjon i
SMO
ble grundig studert i BCC og medulloblastoma [13], [14].
betydningen av Hh-signalering i karsinogenese ble også undersøkt i spredning av småcellet lungekreft (SCLC), som er et meget aggressivt, lungecancer som utgjør omtrent 20-25% av alle lungekreft [21]. Inhibering av aktiviteten til Hh-signalering ved hjelp av SMO-antagonist, cyclopamine resultert i alvorlig veksthemming i SCLC-cellelinjer [21], [23], [25], [26]. Mens, ble det opprinnelig foreslått at Hh signalisering er mindre assosiert med NSCLC, den mest dominerende type lungekreft og de mest dødelige malignitet. Imidlertid har flere bevis nylig angitt at NSCLC er avhengig av Hh signale aktivitet på proliferasjon, så vel [27], [28], [29], [30].
Selv om den største reseptoren mot Hh er PTCH1, det er flere co-reseptorer som bistår Hh signal positivt, for eksempel CDO, BOC og GAS1 [31], [32], [33], [34], [35]. Hh signalering er involvert i ulike cellulære og utviklingsprosesser, og følgelig stramme forskrifter er absolutt nødvendig for signaleringen for å gjenkjenne og kontrollere mikrovariasjon i cellulære miljø. I mellomtiden er mange lungekreft cellelinjer produsere ulike nivåer av Hh ligand [25], [30]. Selv om et lavt nivå av Hh-ligand er sett i enkelte lungekreftceller, disse cellene viser økningen i Hh mål-gen-ekspresjon antyder oppregulering av Hh signalering. Under disse omstendigheter kan tilstedeværelsen av Hh co-reseptorer bidrar til forsterkning av svake ekstracellulære signalet i kreftceller i tillegg til finjustering av Hh-signalering under embryogenese.
Blant de co-reseptorene, er CDO et transmembranprotein som tilhører immunglobulin (Ig) /fibronektin type III (FNIII) superfamilien, og spiller en viktig rolle i muskel differensiering, embryoutvikling og neuronal differensiering [36], [37], [38], [39]. Strukturell analyse viste at fibronektin gjentas i det ekstracellulære domene av CDO er kritisk for Hh binding [39]. Den positive regulering av Hh signalveien ved CDO ble først identifisert i
Drosophila
. Det har vært kjent at ihog (ortolog av CDO i
Drosophila
) sammen med boi (ortolog av BOC i
Drosophila
) er viktig for aktivering av Hh signalering i den tredje vingen imaginal plate [ ,,,0],40], [41]. I mus, oppviser Cdo mangel flere medfødte defekter, inkludert holoprosencephaly, som er mangelen vanlig, forbundet med mutasjoner i Hh-signalering [39], [42]. Videre er CDO involvert i Hh-mediert ventral nevrale mønstring av pattedyr nevralrøret [31], og så vel som i Hh-mediert celle proliferasjon i lillehjernen granule neuron progenitorceller (CGNPs) [43].
I tillegg til rollen som CDO i organutvikling og cellulær differensiering, sammenslutningen av CDO til Hh signalering, som er innblandet i tumorigenesis fascinert oss å belyse en rolle CDO i kreft celle lunge spredning. I denne studien søkte vi å avdekke bidrag CDO til Hh signalering i NSCLCs og i tillegg til spredning og tumorigenicity i lunge kreftceller. Vi har funnet at nivået av CDO var høyere i NSCLC-celler, og at inhiberingen av CDO ekspresjon nedregulert Hh signalisering, og redusert spredning og tumorgenese i humane lungekreftceller. I tillegg ble CDO uttrykk observert i avansert stadium av NSCLC vev. Til sammen alle data tyder på at CDO, som en co-reseptor for Hh, er avgjørende for kreftcelle spredning og tumorigenicity, og derfor kan det betraktes som en god kandidat for kreft terapeutiske anvendelser.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC kulturer~~POS=HEADCOMP og reagenser
BEAS-2B og NSCLC cellelinjer, A549, H1299, H460 og H520 ble vennlig levert av Prof. DH Kim (Sungkyunkwan University, Samsung Biomedical Research Institute, Korea) [44]. Kulturen i BEAS-2B fulgt ATCC retningslinjer. NSCLC-celler ble dyrket i en fuktet inkubator med 5% CO
2 i RPMI-1640-medium (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum (FBS) supplert med penicillin og streptomycin. For å måle mRNA /protein-ekspresjon eller celledød i siCDO-transfekterte celler, ble mediet byttet til RPMI-1640-medium med 0,5% FBS en dag etter transfeksjon, og de transfekterte cellene ble dyrket i ytterligere 2 dager. 50 uM av SANT1 (S4572, Sigma-Aldrich) løst i DMSO eller tilsvarende volum av kjøretøyet DMSO ble behandlet for celler dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 0,5% FBS i det angitte tidspunkt.
RNA interferens eksperimenter
Hver NSCLC cellelinjen ble transfektert med siCDO hjelp Lipfectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. De følgende sekvenser ble anvendt som siRNA mot CDO. siCDO # 1, Sense, 5′-GGAUCUUGGACCCUUAUGUUU-3 «, Antisense, 5’ACAUAAGGGUCCAAGAUCCUU-3». siCDO # 2, Sense, 5′-CUUCAAAGUCGAAUAUAAAUU-3 «, Antisense, 5′- UUUAUAUUCGACUUUGAAGUU». For
in vivo
tumorigenicity analysen, A549 celler som stabilt uttrykker liten hårnål RNA (shRNA) mot CDO ble utarbeidet av trans med pSuper-puro-shCDO. pSuper-puro-shCDO vektor ble rapportert tidligere [42].
Total RNA forberedelse og real-time QRT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp easyBLUE total RNA ekstraksjon kit (intron Bioteknologi Inc. , Korea), og cDNA ble syntetisert ved hjelp PrimeScript RT reagenssett (TAKARA, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time QRT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Premiks ExTaq kit (TAKARA, Japan) og termosykler Dice sanntid system (TP800, TAKARA, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Termin (F) og revers (R) primere brukt i denne studien er listet opp nedenfor.
SHH
F, 5′-CCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3 «, R, 5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3»;
PTCH1
F, 5′-CAGCACTGGAAAACTCGTCA-3 «, R, 5′-TCTGATGAACCACCTCCACA-3»;
GLI1
F, 5′-AAGGGGTTTCTATCCTTCCAGA-3 «, R, 5′-TCCTTTATTATCAGGAAACAGTGTCA-3»;
CDO
F, 5′-GGGAAATACATCTGCGAAGC-3 «, R, 5′-CTGAGCAGCATCAGGAAGTG-3»;
18S rRNA
F, 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 «, R, 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3». Relativ kvantifisering av en genekspresjon ble beskrevet som fold av relative endringer i mRNA-nivåer sammenlignet med en kontroll, ved hjelp av to
-ΔΔCt ligning, [ΔΔCt = ΔCt (målgenet) -ΔCt (referanse-genet)]. 18S rRNA ble anvendt som en referanse-gen.
celleproliferasjon og levedyktighet assay
Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 5 x 10
3 eller 1 x 10
4 celler per 96-brønn og dyrket i RPMI-1640 inneholdende 0,5% FBS. Trypsinisert-celler ble farget med trypanblått (TB) løsning, og de ikke-farget levedyktige celler ble tellet. For MTT-analysen ble 20 ul av 5 mg /ml MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] 2,5-difenyltetrazoliumbromid) tilsatt til 5 x 10
3 eller 1 x 10
4 celler pr 96-brønn. Etter 4 timers-inkubering ved 37 ° C, ble kultur suppe byttet til 200 ul DMSO. Absorbansen ble målt ved 595 nm. For BrdU-analyse ble celler dyrket med 10 uM bromdeoksyuridin (BrdU; Sigma-Aldrich Corp.) i 1 time. Fikserte celler med 4% PFA ble probet med anti-BrdU-antistoff (Chemicon International Inc.). Fluorescens ble påvist ved Alexa Fluor 488 geit-anti-mus-antistoff (Molecular Probe).
Strømningscytometri-analyse av apoptose
Apoptose ble målt ved hjelp av ApoScan Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit (BioBud, Korea ) og BD FACS CANTO II flowcytometer (BD Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot
Western blot analyser ble utført som beskrevet tidligere [37]. Primære antistoffer brukt i denne undersøkelsen er oppført som nedenfor; Spaltede Caspase3 (# 9664, Cell Signaling), Caspase9 (sc-81663, Santa Cruz), Cdk2 (sc-6248, Santa Cruz), cyclin D1 (sc-246, Santa Cruz), Cyclin E (sc25303, Santa Cruz), GAPDH (AbFRONTIER, Korea), p21 (sc-6246), p27 (ab7961, Abcam).
Colony forming analyse
Fem tusen av cellene ble forsiktig blandet med 10% FBS RPMI-1640 medium inneholdende 0,35% agarose. Blandingen slag på 0,5% agarose bunnen med 10% FBS medium i 6-brønners skåler. De pletterte cellene ble inkubert ved 37 ° C i fuktet inkubator i 3 uker med foring av medium hver annen dag. Den kolonidannelse ble visualisert med 0,01% krystallfiolett og analysert med et disseksjonsmikroskop. Kvantifisering av kolonien antall per felt ble bestemt ved hjelp ImageJ. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer og gjentatt to ganger
I viv
o tumorigenicity analysen
5 × 10
6 av kontrollen (pSuper-puro.) – Eller pSuper-puro-shCDO-transfekterte A549-celler ble subkutant injisert inn i flankene av 6- til 8 uker gamle hunn nakne mus. Tumorvolumet ble målt hver 4. dag, og beregnet som beskrevet [45]. Alle dyrestudier ble gjennomgått og godkjent av International Animal Care og bruk Committee (IACUC) av SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM er en forening for Vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) internasjonalt akkreditert anlegget og retter seg etter Institute for Forsøksdyrforskning (ILAR) guide.
Mus og immunhistokjemi
LSL-K-ras
G12D
mus ble gitt av Dr. Tyler Jacks (MIT Cancer Center) [46], [47]. De parafinsnitt fra
LSL-K-ras
G12D
mus ble immunologisk med 2B3 (mus ascites mot CDO) og anti-GLI1 antistoff (1:100, ab49314, Abcam), og oppdaget ved hjelp av immunfluorescens. Konfokalmikroskopi ble utført ved SKKU School of Medicine-Mikros Shared Resource Facility med Zeiss LSM-510 Meta konfokal mikroskop. Alle dyrestudier ble gjennomgått og godkjent av International Animal Care og bruk Committee (IACUC) av SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM er en forening for Vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) internasjonalt akkreditert anlegget og retter seg etter Institute for Forsøksdyrforskning (ILAR) guide.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student
t
test. Data ble presentert som betyr ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter og som betydelig når
p
verdier var 0,05 (*) eller. 0,01 (**)
Resultater
Hh komponenter som er involvert i lungekreft celleproliferasjon ble hemmet av CDO uttømming i NSCLCs
Tidligere litteratur har vist at CDO fungerer som et tilbehør reseptor for Hh ligand og positivt regulerer Hh signaliserer [39] [48]. Den nære relevansen av aktivering av Hh aliserte til kreftcelle spredning bedt oss først for å teste CDO uttrykk i NSCLC celler. For å gjøre dette, ble totalt RNA isolert fra A549, H1299, H460 og H520 NSCLC cellelinjer så vel som fra BEAS-2B human ikke-cancerous lunge celle, og brukes for å analysere CDO uttrykk ved å gjøre sanntid QRT-PCR. Resultatet viste at CDO ble uttrykt høyere i A549, H1299 og H520 celler enn BEAS-2B men H460 avdekket relativt lavere CDO nivå (figur 1A). I tillegg, undersøkte vi uttrykket for Hh signalkomponenter i NSCLC-celler ved å utføre sanntids QRT-PCR. Jo høyere ekspresjon av SHH ble observert i alle fire NSCLC-cellelinjer enn i den ikke-kreft lunge celle. Likeledes ble nedstrøms målgener av Hh signalering, PTCH1 og GLI1 uttrykt høyere i de NSCLC celler (figur 1A). A549 viste forholdsvis lavere nivå av Hh-ligand, sammenlignet med andre cellelinjer er imidlertid åpenbart at økningen i Hh target genekspresjon (PTCH1 og GLI1). I H520, ble CDO, SHH og PTCH1 uttrykt relativt høyere enn noen andre cellelinjer, men GLI1 uttrykk var ganske lav.
A. Real-time QRT-PCR for uttrykket nivåer av CDO og Hh signalkomponenter (SHH, PTCH1 og GLI1) i BEAS-2B og NSCLC cellelinjer (A549, H1299, H460 og H520). Hvert Ekspresjonsnivået ble normalisert til nivået av 18S rRNA. Den relative mengden av hver komponent i NSCLCs ble bestemt som mengden av hver i BEAS-2B ble satt til 1,0. B. Antall levedyktige celler ble bestemt ved celletelling ved angitt tid i A549, H1299, H460 og H520 ble behandlet med eller uten 50 uM SANT1. C. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse ved den angitte tid i A549, H1299, H460 og H520 ble behandlet med eller uten 50 uM SANT1. Absorbansen ble målt ved 595 nm. D. RT-PCR for CDO i A549, H1299 og H460 transfektert med egge siRNA eller siCDO 1 #. E. Real-time QRT-PCR for Hh signalkomponenter i A549, H1299 og H460 transfektert med egge siRNA eller siCDO. Ekspresjonsnivået av hver komponent ble normalisert til nivået av 18S rRNA. Den relative mengden av hver komponent i CDO-utarmet NSCLCs ble bestemt som den mengde av hvert i kontrollcellene ble satt til 1,0 (rød linje). Alle verdiene representerer hjelp av minst tre bestemmelser ± SD 1. *
p
0,05 og **
p
. 0,01
Vi først bestemt hemmende effekt SANT1 på Hh signalering ved å undersøke uttrykket av Hh signaliserer målgener etter SANT1 behandling. SANT1 binder direkte til SMO, hindrer signalering. Totalt RNA isolert fra DMSO eller SANT1 behandlet A549, H1299 og H460 ble brukt for å analysere PTCH1 og GLI1 uttrykk ved real-time QRT-PCR. Som spådd, tillegg av SANT1 resulterte i reduksjon av PTCH1 og GLI1 uttrykk (Figur S1 i File S1). For å bestemme virkningen av Hh signalering på proliferasjonen av NSCLCs, inhiberte vi Hh signalisering i A549, H1299, H460 og H520 ved bruk av SANT-1. Deretter ble TB celletelling og MTT-analyse utført for å analysere cellevekst og levedyktighet. Dataene viser at tilsetningen av 50 uM SANT1 resulterte i signifikant reduksjon i cellevekst og levedyktighet av fire individuelle NSCLC-celler (figur 1B og C). Effekten av SANT1-mediert inhibering var sterkere ved sene tidspunkter. Disse dataene indikerer at de testede NSCLC celler krever Hh signale aktivitet for å beholde sin spredning.
Deretter spurte vi om CDO bidratt til aktivitet av Hh signalisering i NSCLCs. For å finne ut det, transfektert vi tre forskjellige NSCLC cellelinjer, A549, H1299 og H460 med siCDO eller egge siRNA og evaluert effekten av CDO mangel på uttrykk for Hh signalkomponenter ved real-time QRT-PCR. Ekspresjon av CDO ble vesentlig redusert med siCDO i alle cellelinjer (figur 1D). Å utarme CDO uttrykk, benyttet vi to forskjellige sekvenser av siRNA, siCDO # 1 og # 2. Begge siCDOs ble viser lignende CDO uttømming og resultatene (Data ikke vist), og vi presenterer data fra siCDO # 1. Nivåene av de Hh signaleringskomponentene, SHH, PTCH1, og GLI1 ble betydelig redusert i CDO-utarmet lungekreftceller sammenlignet med det forvrengte styre (figur 1E). Disse data betegne at CDO fungerer som en positiv regulator for Hh signalisering i NSCLC celler, uavhengig av dens uttrykk nivå.
CDO uttømming førte til en hemming av spredning og en induksjon av apoptose i NSCLCs
som vist i figur 1B og C, observerte vi at spredning av NSCLC-celler var ganske følsomme for SANT1. Derfor bestemte vi oss for å fastslå effekten av nedregulering av Hh signalering av CDO knockdown på kreftcelle spredning. For å gjøre dette, vurderte vi frekvensen av mobilnettet spredning av A549, H1299, H460 og H520 etter CDO-utarmet tilstand ved å utføre TB celletelling og MTT analysen (Figur 2A og D). Resultatet viste at CDO knockdown i alle testede NSCLC-celler betydelig redusert cellenummer og levedyktighet, sammenlignet med det forvrengte kontroll. Imidlertid omfanget av reduksjonen spredning var ikke sterkere enn at det i SANT1 behandling (sammenlign figur 2A og D til fig henholdsvis 1B og C,). Skråningen av grafene for celletallet og levedyktigheten i CDO-utarmet cancerceller fremdeles holdt stiger i lengre tid punkt dag 5, sammenlignet med det i SANT1 behandling, selv om nivåene var helt mye lavere enn de i eggekontrollcellene. For å vurdere effekten av CDO utarming på spredning videre, utførte vi BrdU inkorporering analysen. Resultatet viste at CDO knockdown i NSCLC celler førte til 20-40% av nedgang i celleproliferasjon (figur 2B).
A. Antall levedyktige celler ble bestemt ved å telle celle ved angitte tid i kontroll- eller CDO-utarmet A549, H1299, H460 og H520. B. Cell spredning av CDO knockdown A549, ble H1299, H460 og H520 bestemmes av BrdU innlemmelse. C. Western blot-analyse for ekspresjon av cellesyklus regulatorer (Cyclin D1, syklin E og Cdk2), repressorer (P27 og P21) og apoptotiske markører (spaltes Caspase 3 og spaltet caspase 9) ved kontroll eller CDO knockdown A549-celler. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. D. MTT analyse for cellelevedyktighet av kontroll- eller siCDO-transfektert A549, H1299, H460 og H520 i angitt tid. Absorbansen ble målt ved 595 nm. E. Annexin V-FITC apoptose og flowcytometri analyse med A549, H1299, H460 og H520 transfektert med egge siRNA eller siCDO. Alle verdiene representerer hjelp av minst tre bestemmelser ± SD 1. *
p
0,05 og **
p
. 0,01
Nedgangen i celleproliferasjon og levedyktighet i CDO-utarmet NSCLC celler kan være på grunn av redusert cellesyklusprogresjon og /eller forbedret celledød. Hvis du vil kontrollere uttrykket nivåer av cellesyklus regulatorer /repressors, A549 celler transfektert med eggerøre eller siCDO ble undersøkt for immunoblotting. Som et resultat, ble proteinnivået i cellesyklus regulatorer (Cyclin D1, syklin E, og Cdk2) ble redusert, mens uttrykket av Cdk-inhibitorer (P27 og P21) ble forhøyet i siCDO-behandlede A549-celler sammenlignet med de omkastede-behandlede cellene (Figur 2C). Disse dataene indikerer at hemming av CDO uttrykk synes å forårsake cellesyklus arrest hos NSCLC celler.
Da vi spurte om CDO utarming var også assosiert med celledød. Immunoblotting mot spaltede former av kaspase-9 og -3 viste at disse apoptotiske faktorene ble påvist sterkere i siCDO-transfektert A549 enn i kontrollgruppen (Figur 2C). Konsekvent, flowcytometri profil for apoptose med A549, H1299, H460 og H520 utstilt at høyere prosentandel av annexin-V og PI doble positive celler ble funnet i fire individuelle CDO-utarmet NSCLCs (figur 2E). Derfor er disse data tyder på at den minsket spredning av NSCLCs ved CDO uttømming skyldes økt celledød, så vel som svekkede cellesyklusprogresjon.
Inhibering av CDO ekspresjon i NSCLCs viste reduksjon av
in vitro
og
in vivo
tumorigenicity
redusert celleproliferasjon i CDO knockdown ledet oss til å undersøke påvirkning av CDO utarming på ondartede funksjoner i NSCLC celler. For det, vurderte vi graden av kolonidannelse av siCDO-transfekterte A549, H1299, H460 og H520-celler i bløt agar (figur 3A og B). vises resultatet en markert reduksjon i clonogenicity
in vitro
når CDO-nivået ble redusert.
A. Koloni dannelsen av kontroll eller CDO knockdown A549, H1299, H460 og H520 i myk agar. B. Kvantitativ analyse av forsøket beskrevet i A. Colony tall per felt ble bestemt av ImageJ. Verdiene representerer hjelp av tre bestemmelser ± 1 SD. *
p
0,05 og **
p
0,01. C. Representative tumorvekst 50 dager etter subkutan injeksjon av nakne mus med kontroll eller shCDO-behandlede A549-celler. D. tumorvolum av de nakne mus med styre A549 (n = 8) eller CDO-utarmet A549 (n = 10) beskrevet i C. Innretninger er vist som feilfelt. E. Svulster fra hårløse mus injisert med kontroll A549 eller CDO-utarmet A549 celler vist i C.
For å støtte data fra
in vitro
tumorigenicity, vi forberedt stabil cellelinje som uttrykker A549 shRNA mot CDO, og subkutant injisert kontroll eller CDO-uttømte celler til flankene av nakne mus. Den tumorstørrelse ble målt med jevne mellomrom. Som vist figur 3C, D og E, ble en signifikant reduksjon i tumorvekst observert i nakne mus injisert med CDO-knockdown A549. Sammen utgjør disse dataene indikerer at CDO er nødvendig for
in vivo
vekst av NSCLC celler.
CDO uttrykk ble oppdaget med GLI1 sammen i avanserte stadier av NSCLCs
For å finne ut CDO uttrykk under lungekreft progresjon, vi tok fordel av en NSCLC musemodell,
LSL-K-ras
G12D
mus [46], [47]. Etter intranasal innånding av Ad-Cre å indusere spontan lunge tumorigenesis i
LSL-K-ras
G12D
mus, vurdert vi CDO uttrykk i lungen svulstvev som viser fire individuelle kvaliteter av tumorprogresjon ved fluorescerende immunhistokjemi. CDO uttrykk var nesten umulig å oppdage i klasse-1, som er et tidlig stadium av tumorprogresjon med atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH) eller liten adenom (Figur S2 i File S1). Men uttrykket ble beriket som tumorprogresjon er avansert. I klasse-2, i hvilket større adenomer med litt forstørrede kjerner blir detektert, ble CDO ekspresjon observert i cytoplasma av celler i tumor lesjoner, og denne høye ekspresjon ble beholdt inntil grad-3 (figur 4). Som tumorer utviklet seg til å bli invasive adenokarsinomer (grade-4), ble CDO uttrykk noe redusert og detektert i cellemembranen. Uttrykket av CDO i tumorlesjoner ledet oss til å undersøke uttrykket av Hh pathway komponenter i svulstvev. Konfokale bilder immunfluorescens viste at GLI1, en av Hh signaleringsfaktorer ble colocalized med CDO, og dessuten dens ekspresjon ble også sterkt observert i klasse-2 og -3 tumorlesjoner, ikke i klasse-4 (figur 4). Den mangel på GLI1 ekspresjon i klasse-4 er tilsvarende til resultatene blitt foreslått av flere tidligere undersøkelser [23], [29]. Resultatene av disse eksperimentene indikerer at CDO ekspresjon kan bli korrelert med oppregulering av Hh-signalering i tumorlesjoner og CDO er også sannsynlig relatert til utviklingen av lungetumor, ikke i startfasen.
Confocal immunfluorescens deteksjon av CDO (rød) og GLI1 (grønn) i klasse-2, -3 og -4 lunge tumorvev fra
LSL-K-ras
G12D
modell. Cellekjerner ble visualisert ved DAPI (blå) og fasekontrastbilder er vist. Scale bar indikerer 50 mikrometer.
Diskusjoner
Faktisk betydningen av CDO i kreftcelle spredning var noe avdekket og omtalt tidligere. Hayashi
et al.
[49] gjort en innsats for å sile ut gener som koder for transmembrane proteiner, som er sterkt uttrykt i prostata kreft cellelinjer. Blant kandidatene, fokuserte de på 83% av CDO-overexpressed prostatakreft, og viste at å redusere CDO uttrykk indusert apoptose og hemmet celle invasjon i prostatakreft. Men den molekylære mekanismen hvordan CDO er involvert i proliferasjon av prostata-kreft-celler ble ikke forklart. I denne studien har vi avdekket at finjustering og oppregulering av Hh signalering av CDO er ganske nødvendig for celledeling i lungekreft. Vi i tillegg observert at mRNA nivået av CDO i de testede lungekreftcellelinjer unntatt H520 var høyere enn i BEAS-2B, men det var ikke signifikant. Spesielt CDO mRNA nivå i A549 var omtrent 1,7 ganger høyere enn den basale nivået av det i BEAS-2B. Selv om økningen er ikke dramatisk høyt, er det verdt å legge merke hvis vi tenker på at CDO uttrykk er generelt funnet under utvikling og embryogenese, og knapt oppdaget i voksen vev [36].
Det ble opprinnelig antatt at Hh signale ble sjelden knyttet til NSCLC fordi Hh og GLI1 ble observert på et relativt lavere nivå i NSCLC. Siden da dataene, inkludert de nåværende data, for hemming av NSCLC spredning av en SMO antagonist antydet at aktiveringen av Hh signalering via det lave nivået av Hh er sikkert forbundet med tumorigenesis i NSCLC. Under denne omstendighet kan CDO spille en kritisk rolle som en ligand sensor for en liten mengde av Hh, støtter hoved reseptoren, PTCH1 og etter at alle induserer aktivering av Hh-signalering.
I mellomtiden, hvis funksjon CDO i cellen spredning synes å være usikker, avhengig av Hh-nivå. DELLOYE-Bourgeois
et al.
[50] har nylig foreslått at, HH nivået er viktig for CDO å fungere som en avhengighet reseptor, som er nært knyttet til induksjonen av proapoptotiske signal. Ifølge dem når Hh ligand er ganske begrenset, er caspase 3/9 rekruttert til caspase cleavage området i inter domenet av CDO og fremkalle proteolytisk spalting. Dette caspase-mediert spalting utløser slutt apoptose. Rollen til CDO som en avhengighet reseptor i utgangspunktet i konflikt med funksjonen av CDO i kreftceller med Hh uttrykk, det vi avdekket i denne studien. Derfor er passende nivå av Hh ligand ser ut til å være avgjørende for å bestemme funksjonen av CDO som en positiv regulator av Hh-signalering eller en avhengighet reseptor.
Inhiberingen av Hh-signalering ved SANT1 i alle NSCLC-celler som viste mer betydelig reduksjon av celleproliferasjon og levedyktighet ved lengre tidspunkt, i forhold til hemming av CDO-genet uttømming (sammenlign figur 1B og C til figur 2A og D, henholdsvis). Den begrensede effekten av CDO knockdown på hemming av celleproliferasjon kan skyldes at andre Hh co-reseptorer, som BOC og GAS1 er fortsatt uttrykkes og aktiv, selv om vi ikke kan utelukke muligheten for forbigående CDO uttømming med siRNA. Det har blitt vist at alle Hh co-reseptorer, CDO, BOC, og GAS1 samlet er nødvendig for full aktivering av Hh signalering. CDO, BOC og GAS1 individuelt lage et kompleks med PTCH1 og dannelsen av kompleksene er kritisk for Hh-mediert proliferasjon CGNP [43]. Basert på dette, forstå rollene til BOC og GAS1 under Hh-mediert tumorigenesis ville være nødvendig senere.
Påvisning av CDO uttrykk i høyverdig tumorlesjon av NSCLC musemodell, ikke i lesjon i klasse-1 , spent vår nysgjerrighet på seg rollen som CDO-mediert Hh signalisering i tumorprogresjon. Det har blitt foreslått at den dominant oppregulering av Hh signalering synes å være korrelert med tumor karakter, selv om det er kontroversielt i noen typer kreft. I prostatakreft, ble mRNA nivåene av SHH, PTCH1 og GLI1 sterkt forhøyet i mer avanserte stadier av kreft, og alle disse komponentene ble nært knyttet til Gleason scorer [51]. På den annen side, Gialmanidis
et al.
[29] har immunohistokjemisk analysert parafininnstøpte lungevev deler av 80 NSCLC. De fant at aktivering av Hh signale var assosiert med tumor karakter, og den høye aktivering av signal var hovedsakelig påvist i godt differensiert og moderat differensierte tumorer. Den robuste uttrykk for CDO i høy grad av tumor kan føre til en mulighet for at CDO som en positiv regulator regulerer og resulterer i avvikende aktivering av Hh signalering i tumor utvikling og progresjon.
Så langt i arbeidet med å finne kreft behandlinger har vært rettet hovedsakelig SMO, og faktisk flere SMO hemmere har vært bruk til klinikken [52]. Uttrykket av CDO er vanligvis begrenset i utvikling og embryogenese, ikke i voksenstadiet. Unormal ekspresjon av CDO i cancertilstand eventuelt er assosiert med avvikende celleproliferasjon. Som en del av kliniske studier, kunne CDO betraktes som en potensiell indikator for tumordannelse og et terapeutisk mål.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
