Abstract
Nyere studier har vist at Notch signalering er involvert i mange typer kreft, inkludert muntlig plateepitelkarsinom ( OSCCs). Imidlertid er rollen til Notch signalisering i svulsten mikromiljøet er ennå ikke fullt ut forstått. I denne studien undersøkte vi rollene til NOTCH3 signalering i kreft assosiert fibroblaster (kafeer) i OSCCs. Immunhistokjemisk undersøkelse av 93 mennesker tunge OSCC tilfeller viste at om lag en tredel av OSCCs viste NOTCH3 uttrykk i kafeer, og at dette uttrykket signifikant korrelert med tumorstørrelse. In vitro studie viste at OSCC cellelinjer, spesielt HO1-N-1-celler stimulert NOTCH3 ekspresjon i normale humane dermale fibroblaster (NHDFs) gjennom direkte celle-til-celle-kontakt. Immunhistokjemisk og morfometrisk analyse ved hjelp av menneske OSCC prøver viste at NOTCH3 uttrykk i kafeer signifikant korrelert med micro-fartøy tetthet i kreft stroma. In vitro angiogenese analyser som involverer co-kultur NHDFs med HO1-N-1 og menneskelige navle endotelceller (HUVECs), og NOTCH3 knockdown i NHDFs bruker siRNA, viste at HO1-N-1 celler betydelig forfremmet tube dannelse avhengig NOTCH3 utfoldelse i NHDFs. Videre ble NOTCH3 uttrykk i kafeer relatert til dårlig prognose av OSCC pasientene. Dette arbeidet gir en ny innsikt i rollen Notch signalering i kafeer assosiert med tumor angiogenese og muligheten for NOTCH3 målrettede molekylær terapi i OSCCs
Citation. Kayamori K, Katsube Ki, Sakamoto K, Ohyama Y, Hirai H, Yukimori A, et al. (2016) NOTCH3 induseres i Cancer-assosiert fibroblaster og Fremmer Angiogenese i Oral Plateepitelkarsinom. PLoS ONE 11 (4): e0154112. doi: 10,1371 /journal.pone.0154112
Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningssenter, Saudi-Arabia
mottatt: 28 desember 2015; Godkjent: 09.04.2016; Publisert: 28 april 2016
Copyright: © 2016 Kayamori et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for Promotion of Science: Grant-i-aid for Unge Forskere (B) (KAKENHI 26861543 til Kou Kayamori ) og Scientific Research (C) (20233760 til Ken-ichi Katsube). Dette arbeidet ble også støttet av Japan Society for Promotion of Science: Grant-i-Aid for Scientific Research (A) (KAKENHI 25253098 til Akira Yamaguchi)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
hode og hals kreft stammer fra det øvre aerodigestive kanalen inkludert nesehulen, bihuler, munnhule, svelg og strupehodet. Histopathologically, den dominerende malignitet i hode og nakke kreft er plateepitelkarsinom (SCC).
Oral SCC (OSCC) er den vanligste typen av hode og nakke kreft. Ifølge de siste GLOBOCAN estimater, ble omtrent 300 000 nye leppe /kjeve kreftpasienter diagnostisert i 2012 på verdensbasis [1]. Den 5-års overlevelse av OSCC pasienter fortsatt varierer fra 40 til 60% [2, 3]. Undersøkelse om molekylære mekanismen som regulerer ondartede oppførsel av OSCC vil være behov for utvikling av terapeutiske tilnærminger og forbedring av dårlig prognose.
Kreft stroma er sammensatt av ulike typer celler, inkludert fibroblaster, immunceller, pericytes og endothelial celler. Nyere studier har vist at disse celler og deres produkter en hensiktsmessig mikromiljøer for kreft spredning, invasjon, angiogenese, metastase, og chemoresistance [4, 5]. Spesielt kreft-assosiert fibroblaster (kafeer), som er de viktigste kreft stroma komponenter, spille en avgjørende rolle i tumorprogresjon i ulike typer kreft [6]. Deres opprinnelse er antatt å være enten vev-resident fibroblaster, stamceller rekruttert fra benmarg eller kreftceller som gjennomgikk epitelial-mesenchymale overgang [7]. Flere studier har rapportert at kafeer stimulere kreftcelle invasjon [8-10] eller spredning [11] og korrelerer med dårlig prognose i OSCCs [12, 13].
Notch signalering er en evolusjonært konservert sti som regulerer celleproliferasjon , apoptose og differensiering [14]. Hakk signalisering innledes ved binding av HAKK-ligand til dets reseptor, som blir mediert av celle-til-celle-kontakt. Hos mennesker er det fire reseptorer (NOTCH1-4), og fem ligander (JAGGED1, 2 og DLL1, 3 og 4). Binding av ligand til dets reseptor fører til spaltning og frigjøring av det intracellulære domenet av hakk reseptor (NiCd). NICD translocates fra plasmamembranen til kjernen, som initierer transkripsjon av HAKK målgener [15]. Nyere studier har vist at dysregulering av Notch signalering er involvert i forskjellige sykdommer, inkludert forskjellige typer kreft [16, 17]. Endringer av Notch signalering i kreftceller inkluderer gevinst eller tap av funksjon mutasjoner, og reseptor /ligand overekspresjon [18]. Vi har tidligere demonstrert NOTCH1 downregulation i kreftceller i OSCC av microarray og immunhistokjemiske studier med humane OSCC prøver [19], og nyere studier har indikert at NOTCH1 fungerer som en tumor suppressor i OSCC patogenesen [20-22].
selv om både kafeer og Notch signale spille viktige roller i kreft progresjon, Notch signalering i kafeer, i motsetning til kreftceller, og dens bidrag til ondartet oppførsel er ikke fullstendig klarlagt. NOTCH3 er fysiologisk uttrykt i de glatte muskelceller i små arterier og regulerer differensiering og modning av disse cellene. Tap-av-funksjon mutasjon av NOTCH3 har vist seg å føre til cerebral autosomal dominant arteriopathy med subkortikale infarkter og leukoencefalopati (CADSIL) som er preget av degenerasjon eller tap av vaskulære glatte muskelceller i media, fortykkelse av karveggen og forekomster av granulære osmiophilic materialer (GOM) nær celleoverflaten av de glatte muskelcellene eller pericytes [23]. Nyere studier har vist at NOTCH3 induseres i fibroblaster ved direkte celle-til-celle-kontakt med HUVECs og fremmer dannelsen fartøyet [24, 25]. Disse funnene tyder på at NOTCH3 har en viktig rolle i reguleringen av angiogenese.
I denne studien har vi fokusert på analyse av NOTCH3 i kafeer å undersøke sitt bidrag til OSCC progresjon. Vi viste NOTCH3 uttrykk i kafeer etter immunhistokjemisk undersøkelse av prøver av 93 tilfeller av menneskelig tunge OSCC og funnet ut at NOTCH3-positive kafeer fremme tumor angiogenese i nærvær av ulike kreftcellelinjer
in vitro
. Dessuten, denne NOTCH3 induksjon i kafeer korrelert med dårlig overlevelse OSCC pasienter. Disse resultatene tyder på nytten av NOTCH3 målrettede molekylær terapi i OSCCs.
Materiale og metode
kliniske prøver
Primær tunge plateepitelkarsinom Prøver ble samlet fra 93 pasienter som hadde blitt behandlet på Dental Hospital of Tokyo Medical and Dental University. Ni primære gingivale SCCS, 10 kinn SCCS og 9 SCCS av munngulvet ble også samlet inn. Alle vevene ble fiksert med 10% nøytral buffret formalin og innstøpt i parafin i henhold til rutinemessige laboratorie protokoller. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med den endrede Helsinkideklarasjonen og godkjent av etisk komité i Tokyo Medical and Dental University (Regi nr 1063). Vi brukte kirurgisk reseksjon, formalinfiksert og parafininnstøpte menneskelige OSCC vev for immunhistokjemisk undersøkelse. Selv om skriftlig informert samtykke ikke er innhentet fra pasienter godkjente etikkutvalg avkall på spesifikt informert samtykke i samsvar med endrede etiske retningslinjene for kliniske studier som tilbys av helse-, arbeids- og velferds av Japan (31 juli 2008). Denne forskningen planen ble avslørt i en plakat format i poliklinikken i oral kirurgi avdeling for å sikre at pasientene hadde anledning til å avslå forskningsbruk av deres patologiske prøver, som erstattet for skriftlig informert samtykke, og etikkutvalg godkjent samtykket prosedyren.
farging
For immunhistokjemisk farging, formalinfikserte, parafininnstøpte menneskelige OSCC vevssnitt ble brukt. De primære antistoffene som ble brukt var som følger: anti-NOTCH3, kanin polyklonale, 1: 200 (ab23426, Abcam, CA, USA); anti-SMA, mus monoklonalt, 1: 100 (M0851, Dako, Glostrup, Sverige). Antigen henting ble utført i henhold til produsentens protokoll. EnVision + Dual Link (Dako) ble anvendt for sekundært antistoff, og fargen ble utført med diamino-benzidin substrat. For immunfluorescens dobbelt farging, anti-NOTCH3, 1: 200 (Abcam), SMA, 1: 100 (mus monoklonalt, M0851, Dako eller kanin monoklonalt, Clone SP171, Spring Bioscinece, CA, USA), CD34, 1: 100 ( mus monoklonalt, NCL-L-END, Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) og cytokeratin, 1: 100 (monoklonalt, Clone AE1 /AE3, M3515, Dako) ble brukt som en primær antistoff. For antigen gjenfinning, ble delene behandlet med Tris-buffer (pH = 7,4) inneholdende 0,1 mg /ml trypsin i 30 minutter ved 37 ° C i CD34 antistoff. Alexa Fluor 488 geit-anti-kanin-IgG (A11008, Invitrogen, CA, USA) og Alexa Fluor 594 geit-anti-mus IgG (A11005, Invitrogen) ble anvendt som sekundært antistoff. DAPI ble brukt for nukleær farging. De immunofluoroscent bildene ble tatt og analysert ved hjelp Axioskop2 pluss mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).
Evaluering av Immunohistokjemiske Analyser
immunhistokjemiske resultater for NOTCH3 og α-SMA ble evaluert basert på fargeintensitet og andelen positive fibrinoblast celler i kreft stroma av to patologer uten forutgående kunnskap om pasientens clinicopathological data. Fargeintensitet ble delt inn i fire grupper: negative, svake, moderate og sterke. Tilfeller med moderat eller sterk intensitet i mer enn 30% av fibroblaster i kreft stroma ble ansett som positivt for uttrykket av hvert protein.
Cell Culture
Følgende åtte hode og nakke plateepitel cellekreft cellelinjer, HO1-N-1, SAS, BHY, Ca9-22, HSC3, HSC4, HSC5 og SKN3 ble brukt. Disse linjene var avledet fra munnhulen, bortsett HSC5 som ble avledet fra kjeve sinus. Seks kreftcellelinjer ble avledet fra ikke-munnsår, HeLa fra livmorhalsen SCC, A549 fra lunge adenokarsinom, MCF-7 fra bryst adenokarsinom, MKN74 fra adenokarsinom i ventrikkel, HCT-15 fra colon adenokarsinom og Panc-1 fra bukspyttkjertelen adenokarsinom, var også anvendes. Alle kreftcellelinjer ble dyrket som beskrevet tidligere [26]. HO1-N-1, SAS, Ca9-22, HSC3 og HSC5, og SKN3 ble kjøpt fra japanske Innsamling av forsknings Bioressurser (Osaka, Japan). BHY ble gitt av Dr. Masato Okamoto (Tella Inc, Tokyo, Japan). HSC4 ble etablert av Dr. Momose ved Institutt for Oral og maxillofacial kirurgi i Tokyo Medical and Dental universitet som beskrevet i forrige rapport [27]. Panc-en ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). HeLa, A549, MKN74 og HCT-15 ble kjøpt fra Riken Bioresource senter (Tsukuba, Japan). MCF-7 ble gitt av Cell Resource Center for Biomedical Research (Tohoku universitet, Miyagi, Japan). Primære normale humane dermale fibroblaster (NHDFs) fra en voksen donor ble kjøpt fra PromoCell (C-12302, Heidelberg, Tyskland) og primære humane navlevene endotelceller (HUVECs) ble kjøpt fra Lonza (CC-2517, Tokyo, Japan).
coculture Analyser av kreftceller og NHDFs
NHDFs (5 × 10
4 celler /brønn) ble sådd ut på 24-brønners plater, ruges i fibroblast vekstmedium 2 Kit (C-23120 , PromoCell) i 48 timer, og deretter cocultured med forskjellige cancercellelinjer (5 x 10
3 celler /brønn) ved inkubering i α-MEM i 72 timer. Deretter ble NHDFs isolert ved anvendelse av følgende metode og vurdert ved hjelp av sanntids-PCR-analyse. For western blot-analyse, NHDFs (20 x 10
5-celler /brønn) og cancercellelinjer (2 x 10
4 celler /brønn) ble cocultured ved anvendelse av 6-brønns plater.
NHDF Isolation fra cocultures
NHDFs ble isolert fra cocultures ved hjelp av en magnetisk aktivert celle separasjon (MACS) system med anti-Fibroblast mikroperler (130-050-601, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) og en MS-kolonne ( 130-042-201, Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens protokoll.
siRNA Transfeksjon
Før coculture, NHDFs ble transfektert med siRNA for human NOTCH3 ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Stealth siRNA for human NOTCH3 ble kjøpt fra Invitrogen. Sekvensen av pluss tråden av dsRNA var 5′-UCAAUGCUGUGGAUGAGCUUGGGAA-3 «.
microvessel Evaluering
microvessel tetthet (MVD) av menneskelige OSCC prøvene ble beregnet for to grupper, SMA (+) NOTCH3 (-) kafeer gruppen og SMA (+) NOTCH3 (+) kafeer gruppe. Ved hjelp av dobbel-immunofluorescerende farging for SMA eller NOTCH3 og CD34, antall CD34-positive små blodårer i SMA (+) fibroblastisk kreft stroma ble evaluert i den første gruppen, og antall CD34-positive små blodårer i NOTCH3 (+) fibroblastisk kreft stroma ble regnet med i den sistnevnte gruppen. Før telle antall microvessels, vi først undersøkt hver seksjon på lav effekt forstørrelse for å identifisere området med høyest microvessel tetthet, og valgt tre felt i hvert tilfelle. Tre mikrografer ved høy forstørrelse (× 200) ble tatt. Antall CD34-positive små blodårer ble tellet og den SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastisk område ble kvantitativt analysert ved anvendelse av en Axioskop2 pluss mikroskop og AxioVsion rel 4.8 programvare (Zeiss). Totale tellinger av CD34-positive microvessels per totalt kvantifisert SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastisk område på tre bilder ble beregnet og definert som den MVD i hvert tilfelle.
In Vitro Assay Angiogenese
En
in vitro
endothelial-fibroblast organotypiske coculture analysen ble endret som tidligere rapportert [28]. Første (dag 0), NHDFs ble sådd på 24-brønns plater (5,0 x 10
4 celler /brønn) og dyrket i Fibroblast vekstmedium i 48 timer. Deretter, siRNA for human NOTCH3 ble transfektert inn i de NHDFs i henhold til den ovenfor beskrevne metode. Den neste dag (dag 3), HO1-N-1 eller A549 kreftceller (6,0 x 10
3 celler /brønn) og HUVECs (3,0 x 10
4 celler /brønn) ble cocultured med siRNA behandlede NHDFs i Endotelial cellevekstmedium. Dyrkningsmediet ble byttet ut annenhver dag. På dag 9 ble cellene fiksert og immunhistokjemisk behandlet med anti-CD31-antistoff (monoklonalt muse-, 1: 100, NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Newcastle, UK) og alkalisk fosfatase-konjugert sekundært antistoff (WP20006, Invitrogen) og signalet ble visualisert ved hjelp av BCIP /NBT substrat (11-681-45-001, Roche). Fem fotografi bilder med den høyeste CD31-positive kapillær nettverk i hver brønn ble tatt ved hjelp av en invertert mikroskop (ECLIPSE TS100, Nikon, Tokyo, Japan). Den CD31-positive kapillær nettverksområdet ble analysert kvantitativt ved hjelp av NIH bilde J programvare.
Effekt av NOTCH3 på Cell Proliferation
For å undersøke effekten av NOTCH3 på OSCC cellelinje spredning, HO1-N- 1 ble sådd ut (2,0 x 10
3 celler /brønn) på en 96-brønners plate belagt med en rekombinant, humant Fc-kimær NOTCH3 (R E farging. Scale bar, 100 pm. B: Fordeling av NOTCH3-positive fibrinoblast celler. C: Fordeling av a-SMA-positive fibrinoblast celler. Celler farget brun i B og C representerer positive celler for hvert antistoff. Piler i A, B og C indikerer blodkar lag, noe som er positivt intern kontroll for hvert antistoff. D, E, F: Dual immunhistokjemisk analyse for α-SMA (rød) og NOTCH3 (grønn). Ko-lokalisering av α-SMA og NOTCH3 i fibroblaster ble observert i kreft stroma. Scale bar, 50 pm. Ca, kreftceller. Prikkete linjer i A-F indikere grensesnittet av kreft reir og stroma. G: Kaplan-Meier kurve for total overlevelse i forhold til NOTCH3 uttrykk i kafeer som bruker 93 mennesker OSCC tilfeller. Log-rank test ble brukt til å beregne betydning.
Selv om den hyppigste engasjement stedet for OSCC er tungen, vi videre immunohistochemically undersøkt NOTCH3 uttrykk i kafeer bruker OSCC tilfellene skjedde på menneskelig tannkjøtt, munnslimhinnen og munngulv. Resultatene viste at NOTCH3-positive kafeer dukket opp i gingival SCCS (4 av 9 tilfeller, 44,4%), bukkale SCCS (3 av 10cases, 30%), og SCCS av gulvet i munnen (3 av 9 tilfeller, 33,3 %) (S1 fig). Det var ikke mye forskjell i hyppigheten av NOTCH3-positive kafeer i tumor stroma blant tunge SCCS og andre SCCS.
Disse resultatene tyder på at det er OSCCs med NOTCH3-positive kafeer og OSCCs med NOTCH3-negative kafeer i deres tumor stroma.
Clinicopathological betydningen av NOTCH3 Expression i kafeer i OSCCs
for å karakterisere betydningen av tilstedeværelse av NOTCH3-positive kafeer i OSCC, vi undersøkt sammenhengen mellom NOTCH3 uttrykk i kafeer og en klinisk -pathological funksjoner i de ovenfor beskrevne tungen OSCC tilfeller. Som vist i tabell 2, er OSCCs med NOTCH3-positive kafeer assosiert med signifikant større tumorstørrelse (P = 0,0292) og lymfeknutemetastase (P = 0,0023) sammenlignet med OSCCs uten NOTCH3-positive kafeer. Det var ingen sammenheng mellom NOTCH3 uttrykk i kafeer og alder, kjønn eller histologisk differensiering av SCC. Vi vurderte også sammenhengen mellom NOTCH3 uttrykk i kafeer og prognosen av 93 tunge OSCC pasienter. Kaplan-Meier overlevelseskurver vist at pasienter med NOTCH3-positive kafeer hatt en dårligere prognose enn de uten NOTCH3-positive kafeer (Fig 1G).
Menneskelige OSCCs Stimulere NOTCH3 Expression i fibroblaster
For å bekrefte disse immunhistokjemiske resultatene, utførte vi
in vitro
eksperimenter med cocultured OSCC cellelinjer og primære normale humane dermale fibroblaster (NHDFs). Etter ko-kultur, ble NHDFs separert ved anvendelse av anti-fibroblaster mikroperler som er beskrevet i en tidligere rapport [31]. Western blot analyse av disse NHDFs indikerte at deres coculture med OSCCs, spesielt med HO1-N-1-celler, stimulert NOTCH3 ekspresjon i NHDFs i forhold til basal ekspresjon når NHDFs ble dyrket alene (figur 2A). Videre α-SMA-protein-nivåer var også høyere i NHDFs cocultured med OSCCs sammenlignet med kontroll NHDFs (figur 2A). Vi så videre analysert NHDF /OSCC co-kultur ved hjelp HO1-N-1 celler og NHDFs. Dobbel immunfluorescens farging av NOTCH3 og keratin i denne coculture modellen viste at bunter av NOTCH3-positive NHDFs omgitt keratin-positive HO1-N-en kreft reir (Fig 2B), som lignet fordelingen av NOTCH3-positive fibroblaster rundt kreft hekker i menneskelige OSCC prøver. Videre dobbel immunfluorescens farging for NOTCH3 og α-SMA viste at disse NOTCH3-positive NHDFs også co-uttrykt α-SMA (Fig 2C). Western blotting og kvantitativ real-time PCR analyse av NHDFs adskilt fra denne coculture viste at NOTCH3 ekspresjon ble betydelig oppregulert på både protein- og mRNA-nivået i den NHDFs cocultured med HO1-N-1, sammenlignet med de NHDFs dyrket alene (fig 2D og 2E, siCtrl). MRNA-ekspresjon av HEY1, en nedstrøms mål for HAKK, ble også signifikant økt i NHDFs ko-dyrket med HO1-N-1 sammenlignet med ekspresjon i fravær av HO1-N-1 (figur 2F, siCtrl). I tillegg α-SMA-ekspresjon i NHDFs cocultured med HO1-N-1 ble også øket på både protein- og mRNA-nivåer i forhold til kulturen i fravær av HO1-N-1 (figur 2D-2F, siCtrl). Induksjon av HEY1 og α-SMA ved coculture ble betydelig inhibert i NHDFs transfektert med siRNA for NOTCH3 (siN3) sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (siCtrl) (figur 2D, 2F og 2G). Dette siN3 undertrykte betydelig NOTCH3 uttrykk i forhold til siCtrl (Fig 2D og 2E). Sammen er disse dataene indikerer at OSCCs har potensial til å indusere HAKK aktivitet ved å stimulere uttrykk for NOTCH3 i NHDFs, og at NOTCH3 uttrykk regulerer α-SMA uttrykk. Listen NOTCH3 induksjon i NHDFs ble observert når HO1-N-1 og NHDFs ble cocultured i direkte kontakt system. Separasjon co-kultur ved hjelp av en porøs transwell fremkalte ikke oppregulering av
NOTCH3
uttrykk i NHDFs (fig 2 H). Dette resultatet innebærer at juxtacrine signalisering gjennom celle-til-celle-kontakt mellom kreftceller og fibroblaster er avgjørende for induksjon av NOTCH3 ekspresjon i fibroblaster. Videre er det mRNA-ekspresjonsnivået av NOTCH1 eller NOTCH2 i NHDFs cocultured i en direkte kontaktsystem med HO1-N-1-celler viste ingen signifikant endring i forhold til de NHDFs dyrket alene. NOTCH4 ekspresjon ble ikke påvist i dette systemet (fig 2I). Disse resultatene tyder på at OSCCs spesifikt stimulere NOTCH3 ekspresjon i fibroblaster
A: NHDFs ble dyrket alene (CTL; kontroll) eller cocultured med representert orale og maksillære SCC cellelinjer.. 3 dager etter coculture, ble NHDFs isolert fra denne coculture ved hjelp av anti-Fibroblast mikroperler for Western blot-analyse. B og C: Immunofluorostainig bruker coculture med HO1-N-1 og NHDFs. Kultur av NHDFs alene ble anvendt som en kontroll. Bunter av NOTCH3-positive NHDFs (grønt) ble observert rundt AE1 /AE3-positve HO1-N-en kreft reir (red) (B). Double NOTCH3 og α-SMA-positive NHDFs ble grepet mellom HO1-N-en kreft reir. Ca, HO1-N-en kreft reir. Stiplede linjene viser grensesnittet til HO1-N-1 kreft reir og NHDFs. (C). Scale bar, 100 pm. Kjernene ble kontra av DAPI. D-G: NHDFs transfektert med negativ kontroll siRNA (siCtrl) eller siRNA for NOTCH3 (siN3) ble dyrket alene eller cocultured med HO1-N-1 celler. 3 dager etter coculture, ble NHDFs isolert fra denne coculture og underkastet Western blot (D) og qPCR analyser for å måle NOTCH3 (E), HEY1 (F), α-SMA (G). H: NHDFs ble dyrket alene (kontroll), eller direkte cocultured med HO1-N-1 celler, eller cocultured med Transwell-skilt HO1-N-1 celler. 3 dager etter at dyrkningen ble NHDFs isolert og underkastet qPCR-analyse. I: qPCR å måle hver HAKK mRNA uttrykk i NHDFs isolert fra coculture med HO1-N-1 celler. ND, ikke oppdages. *
P
0,05, **
P
0.01.
NOTCH3 Uttrykt i kafeer Regulerer Angiogenese
immunhistokjemisk undersøkelse ved hjelp av humane OSCC prøver indikerte at NOTCH3 uttrykk i kafeer signifikant korrelert med T-stage (tumorstørrelse). Dette resultatet antydet at NOTCH3-positive kafeer fremme tumorvekst ved å stimulere tumorcelle-proliferasjon og /eller ved å øke angiogenese. For å undersøke disse mulighetene, vi først utført en
in vitro
celleproliferasjonsanalyse ved hjelp HO1-N-1-celler, som uttrykker liganden HAKK JAG1 som bestemt ved Western blotting (figur 3A). Behandling med et rekombinant humant NOTCH3-Fc /kimæren, som kan binde til dens ligand, JAG1, ikke påvirker HO1-N-1 proliferasjon (figur 3B)
A:. JAGGED1 ekspresjon i forskjellige orale kreftcellelinjer ble analysert ved hjelp av Western blot. B: Effekten av NOTCH3 på celleproliferasjon. Spredning av HO1-N-1 celler med eller uten rekombinant humant NOTCH3-Fc chimera behandling ble overvåket for 72hr.
Deretter gjennomførte vi dobbelt immunfluorescens farging av NOTCH3 og CD34 (en markør for endotelceller ) for å bestemme om NOTCH3 ekspresjon i kafeer er forbundet med tettheten av blodkar i human tunge OSCC prøver. Mikro fartøy tetthet på tumor invasiv området var signifikant økt i NOTCH3 (+) kafeer gruppe sammenlignet med den NOTCH3 (-) kafeer gruppe (fig 4A og 4B). Dette resultatet antydet at NOTCH3 (+) kafeer fremme angiogenese. For ytterligere å undersøke mekanismen av slike angiogenese, utførte vi en organotypiske angiogenese assay ved coculturing HO1-N-1-celler, HUVEC og NHDFs for å bestemme hvorvidt OSCC-indusert NOTCH3 i NHDFs letter kar formasjonen. Immunofluorescent farging av denne co-kulturen viste en CD31-positive meshwork dannet av HUVECs og NOTCH3-positive NHDFs rundt kreftcelle reir (fig 4C). Western blot-analyse indikerte at NHDFs cocultured med HUVECs alene, i fravær av HO1-N-1-celler viste NOTCH3 induksjon sammenlignet med kontroll NHDFs. Mye høyere nivåer av NOTCH3 ekspresjon ble observert i NHDFs som ble cocultured med HUVECs sammen med HO1-N-1-celler (figur 4D). For å evaluere rør dannelse i denne analysen, visualisert vi CD31-positive celler ved immunfarging. Sammenlignet med kontrollgruppen, CD31-positive rør dannelse ved HUVECs i nærvær av NHDFs og tak siRNA ble betydelig øket ved ko-kultur med HO1-N-1. Dette rør dannelse ble signifikant undertrykt når de NHDFs ble transfektert med siN3 (figur 4E og 4F). Disse resultatene antydet at OSCCs fremme angiogenese ved å indusere NOTCH3 ekspresjon i kafeer
A og B: Sammenligning av microvessel tetthet (MVD) mellom NOTCH3 (-) kafeer og NOTCH3 (+) kafeer tilfeller.. Immunofluorostaining for α-SMA (grønn), NOTCH3 (grønn) og CD34 (rød) ved hjelp av menneskelig tunge OSCC prøver. Ca, kreft reir. Stiplede linjene viser grensesnittet til kreft reir og stroma. Piler demonstrerte CD34-positive microvessel. Scale bar, 50 pm. Kjernene ble kontra med DAPI (A). Kvantitativ evaluering av MVD mellom disse to gruppene (B). C-F:
In vitro
angiogenese analysen cocultured med HO1-N-1 celler, HUVECs og siRNA transfekterte NHDFs. Immunofluorostaining for NOTCH3 (grønn) og CD31 (rød). Ca, HO1-N-en kreft reir. Stiplede linjer indikerer margin av HO1-N-1 kreft reir. Scale bar, 100 pm. Kjernene ble kontra med DAPI (C). NHDFs isolert fra denne coculture ble underkastet Western blot (D). Representant bilde av rør formasjon ved HUVECs i hver tilstand. Scale bar, 100 um (E). Kvantitativ evaluering av røret formasjonsområdet (CD31-positive område) i hver betingelse (F). siCtrl, negativ kontroll siRNA. siN3, siRNA for NOTCH3. **
P
0.01.
For å undersøke om NOTCH3 induksjon i fibroblaster er en unik egenskap ved OSCCs, vi cocultured NHDFs med cellelinjer avledet fra kreft i ulike organer, inkludert livmorhalsen, lunge, bryst, mage, tykktarm, og bukspyttkjertel. Western blot-analyse indikerte at A549 celler, som er en adenocarcinoma lunge cellelinje, stimulert ekspresjon av NOTCH3 i NHDFs på et nivå som var lik den som er indusert av HO1-N-1 (figur 5A). En
in vitro
angiogenese-analyse viste at A549 celler betydelig indusert tube-formasjonen i HUVECs ved samtidig dyrket med NHDFs og at dette meshwork ble betydelig redusert ved NOTCH3 knockdown i NHDFs (Fig 5B og 5C). Western blot-analyse av NHDFs isolert fra angiogenese analysen viste tilsvarende resultater som de som ble oppnådd når NHDFs cocultured med HUVECs og HO1-N-1 ble analysert (figur 5D). Disse resultatene indikerer at andre enn OSCC kreftceller kan indusere NOTCH3 i kafeer og fremme angiogenese
A:. NHDFs ble cocultured med ulike kreftcellelinjer avledet fra ikke-munnsår. 3 dager etter coculture, ble NHDFS isolert fra denne coculture og utsatt for Western blot-analyse for å detektere NOTCH3 og α-SMA. B-D: In vitro angiogenese analysen cocultured med A549, HUVECs og siRNA transfekterte NHDFs. Representative bilder av røret dannelse (B) og dens kvantitativ evaluering (C) i hver tilstand. Scale bar, 100 pm.
