Abstract
Zero tyngdekraften fører til flere endringer i metabolske og funksjonelle aspekter ved menneskekroppen og eksperimenter i romferd har vist endringer i kreft vekst og progresjon. Denne studien rapporterer genomet brede uttrykket profilering av en tykktarmskreftcellelinje-DLD-1, og en lymfoblast leukemicellelinje-MOLT-4, under simulerte mikrogravitasjon i et forsøk på å forstå sentrale prosesser og cellulære funksjoner som blir feilregulert mellom begge cellelinjer . Endret cellemorfologi, redusert cellelevedyktighet og en avvikende cellesyklusprofil sammenlignet med deres statiske kontroller ble observert i begge cellelinjer i henhold til vektløshet. Prosessen med cellesyklus i DLD-1-celler ble merkbart påvirket med redusert levedyktighet, redusert kolonidannende evne, en apoptotisk befolkning og feilregulering av cellesyklus-gener, onkogener, og progresjon av kreft og prognostiske markører. DNA microarray analyse viste 1801 (oppregulert) og 2542 (nedregulert) gener ( 2 ganger) i DLD-1 kulturer henhold mikrogravitasjon mens MOLT-4 kulturer forskjellig uttrykt 349 (oppregulert) og 444 (nedregulert) gener ( 2 ganger) etter mikrogravitasjon. Tapet i celle proliferativ kapasitet ble bekreftet ved nedregulering av cellesyklusprosessen som demonstrert ved funksjonell gruppering av DNA mikroarray data ved hjelp av genet ontologispråk betingelser. Genomet bredt uttrykk profilen viste også betydelig feilregulering av post transcriptional gene silencing maskiner og flere mikroRNA vert gener som er potensielle kreftdempere og proto-onkogener inkludert
MIR22HG
,
MIR17HG Hotell og
MIR21HG
.
MIR22HG
, en tumor-suppressor genet var en av de høyeste oppregulert gener i microarray data som viser en 4,4 log fold oppregulering etter mikrogravitasjon. Real time PCR validert feilregulering i verts genet ved å demonstrere en 4,18 log fold oppregulering av Mir-22 mikroRNA. Microarray data viste også feilregulering av direkte mål av MIR-22,
SP1
,
CDK6 Hotell og
CCNA2
Citation. Vidyasekar P, Shyamsunder P , Arun R, Santhakumar R, Kapadia NK, Kumar R, et al. (2015) Genome Wide Expression Profilering av kreft cellelinjer dyrket i Microgravity avslører Betydelig feilregulering av Cellesyklus og mikroRNA Gene Networks. PLoS ONE 10 (8): e0135958. doi: 10,1371 /journal.pone.0135958
Redaktør: Zheng Li, Peking Union Medical College Hospital, KINA
mottatt: 26 februar 2015; Godkjent: 28 juli 2015; Publisert: 21 august 2015
Copyright: © 2015 Vidyasekar et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Forsvars Research Development Organization (DLS /81/48222 /LSRB-189 /ID /2009 og DLS /81/48222 /LSRB- 273 /SH DD /2013) til RSV. url: https://www.drdo.gov.in/drdo/boards/lsrb/fplsrb.htm
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Microgravity på romferder har vist seg å påvirke fysiologi av en celle betraktelig [1]. Normal tyngdekraft (1 g) påvirker to-dimensjonal kulturen ved å avsette celler på overflaten av vevskulturplate (TCP), hvor forankringsavhengige celler holder seg og formere seg som et monolag med svært begrenset celle-celle interaksjoner. Den vektløshet og nedsatt akselerasjon (mindre enn 1 g) i plass, fjerner virkningen av tyngdekraften, slik at cellekulturer på plass for å få uhindret bevegelse av kulturmediet, et skjærfritt miljø, og som cellene ikke er bundet av noen retningsbestemt kraft, uhindret bevegelse av cellene i mediet. Under slike forhold celler har en tendens til å smelte sammen og danne aggregater skape tredimensjonale (3D) miljø hvor de samvirker på flere plan [2]. Virkningen av redusert gravitasjon er ikke begrenset til endringer i dyrkningsforhold som det unike miljø kan produsere endringer i den grunnleggende fysiologi av cellen. Selv om virkningsmekanismen av hvordan tyngdekraften, eller mangel på det, påvirker molekylære og cellulære funksjoner er fremdeles uklar, er det blitt fastslått at mikrogravitasjons eller null gravitasjon påvirker vitale prosesser i cellen, og viktigere, vektløshet har vist seg å endre kreftvekst og progresjon [3-5]. Men forskjellige typer kreft reagerer forskjellig på mikrogravitasjon ved å miste eller forsterke cellulære prosesser og funksjoner. I denne studien ble dyrket vi cellelinjer som er representative for faste og hematologiske svulster-DLD-1, MOLT-4 og HL-60 i et roterende cellekultursystem (RCC) som simulert vektløshet. Den RCC er et mekanisk system som simulerer redusert tyngdekraft på jorden ved å kansellere retningsvektor gjennom konstant rotasjon av en High Aspect Ratio Vessel (HARV). Dette opprettholder cellene i en konstant fritt fall og et skjærfritt miljø slik at cellene til å smelte sammen og danne aggregater 3D [2]. Disse aggregater blir opprettholdt i fritt fall og oppleve forhold med redusert gravitasjon for resten av dyrkningsperioden. Vi antok at fysiologiske endringer i celle-funksjoner som celleproliferasjon og levedyktighet kunne bekreftes med endringer i de grunnleggende prosesser i cellen som genekspresjon. Å forholde fysiologiske endringer som for eksempel en endret cellesyklusen profil med feilregulering av genekspresjon, ble Real Time PCR-analyse for cellesyklus gener, onkogener og kreftutvikling og progresjon markører gjennomført. Genome bredt uttrykk profilering av DNA microarray av disse cellelinjer dyrket under mikrogravitasjon avdekket feilregulering av flere veier i kreft og viktigst, bekreftet med observerte fysiologiske endringer i cellen. Vi har også brukt genuttrykk profil for å undersøke feilregulering i trasé som er sentrale for kreft som Notch signalsystemet og feilregulering i innlegget transcriptional gene Slå maskineri. Genuttrykket profilen også avdekket feilregulering av mikroRNA vert gener i mikrogravitasjon inkludert betydelige tumor suppressor, MIR-22 i DLD-en.
Materialer og metoder
Cell kultur
DLD-1 er en epitelial, adherent cellelinje avledet fra en kolorektal adenokarsinom (Dukes type C). MOLT-4 T er en lymfoblast, suspensjonscellelinje avledet fra en akutt lymfatisk leukemi mens det HL-60-cellelinjen er en promyeloblast avledet fra akutt promyelocytisk leukemi. Cellelinjer ble anskaffet fra Nasjonalt senter for celle vitenskap, Pune, India og ble opprettholdt i DMEM-F12 (DLD-1) eller RPMI 1640 (MOLT-4, HL-60) medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, USA) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator i 25 mm
3 vevskulturplater (TCP) og i 10ml
3 høyt aspektforhold fartøy (HARV) innenfor et roterende cellekultursystem (RCC). Cellelinjene ble innført i 10 ml HARV gjennom 5 ml sprøyter og en rotasjonshastighet på 27 omdreininger per minutt (RPM) ble standardisert basert på aggregering av DLD-1-celler lastet på 0,5 x 10
6 celler i løpet av 24 til 48 timer . Celler ble dyrket i HARV i maksimalt 72 timer med ytterligere medium injiseres i HARV hver 16 til 24 timer for å hindre skumdannelse og luftbobler. Innholdet i HARV ble overført til 60mm TCP, uten dissociating celleaggregater, for rutinemessig hhv observasjon og andre cellebaserte analyser ved hjelp 10ml pipetter. 0,25% Trypsin-EDTA ble anvendt for dissosiasjon av celleaggregater og monolagskulturer ved behov.
Totalt RNA-ekstraksjon og cDNA-konvertering
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen, Tyskland) . 2 x 10
6 celler ble sentrifugert og vasket to ganger med PBS. RNA ble isolert fra disse cellene som per produsentens instruksjoner. 1,5 mikrogram av total RNA ble omdannet til cDNA ved hjelp av MMLV-RT (Thermo Scientific, USA) og Oligo-dT-primere (NEB, USA). miRNA omdannelse til cDNA ble utført ved anvendelse av stammesløyfe revers transkriptase (RT) primere uten ditiotreitol (DTT) og RNA denatureringstrinn for å opprettholde integriteten av stammesløyfe primer.
Microarray analyse
Microarray analyse ble utført med RNA prøver fra DLD-en og MOLT-fire cellelinjer dyrket under mikrogravitasjon og under statiske forhold i replikater. Expression data for hver prøve ble innhentet på Affymetrix Genechip Menneskelig Primeview Array. Hybridisering ble utført for en varighet på 16 timer ved 60 rpm ved 48 ° C og skannes på Genechip microarray Scanner 3000 7G. Rådata ble ekstrahert etter skanning av lysbilder og rå datasettene ble analysert ved hjelp GeneSpring GX 12,6 programvare fulgt av differensial genuttrykk (DE), fold change klyngeanalyse.
Gene ontologi analyse
De gener ble undersøkt for sin overflod i ulike Gene ontologi (GO) termer samt trasé ved hjelp av microarray analyse programvare David (Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery) [6]. To verktøy i DAVID programmet ble brukt, genet funksjonelt klassifiseringsverktøy og funksjonell annotering clustering verktøyet. Den DAVID funksjonelle merknad verktøyet ble brukt til å markere relevante GO begreper knyttet til det innleverte genet liste ved å gruppere lignende, overflødige, og heterogene merknadsinnhold fra samme eller forskjellige ressurser inn merknads grupper basert på hypotesen om at tilsvarende merknader bør ha tilsvarende genet medlemmer. Gene berikelse er basert på settet av innsendte gener som er sterkt forbundet med visse vilkår, som er statistisk målt ved Fisher Exact i DAVID system. I denne studien brukte vi gruppen berikelse poengsum som er geometrisk gjennomsnitt av alle p-verdier av enkeltmedlemmer i en tilsvarende merknad klynge. En høyere poengsum indikerer en høyanriket klynge som igjen indikerer den biologiske betydningen av klyngen i listen.
Real time PCR forsterkning
Real time PCR ble utført ved hjelp av SYBR grønn Real time PCR kit fra Qiagen på en Eppendorf mastercycler, ep realplex (Eppendorf, Tyskland). Relative mRNA-ekspresjon ble bestemt ved normalisering til ekspresjonen av et husholdningsgenet, beta-aktin og U6 for mikroRNA genekspresjon. Primer liste er gitt i S1 tabell.
Western blotting
Celler ble lysert med Radio Immuno Nedbør analyse (RIPA) buffer, blandet med Laemmli-prøvebuffer (1 x) og kokt. Proteiner ble utsatt for 12% SDS-PAGE og elektroblottet på BioRad, 0,22 um nitrocellulosemembran (BioRad Laboratories, USA). Membranen ble blokkert med Tris-bufret saltvann plus 0,2% Tween 20 (TBS-T) inneholdende 3% BSA (Sigma Aldrich, USA) fulgt av primært antistoff inkubering over natten og vask med TBS-T-buffer. Sekundært antistoff (anti-muse-HRP-konjugat, 1: 10000 Sigma Aldrich USA) fortynnet i blokkeringsbuffer ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket en gang med TBS-T. Antistoff-reaktive proteiner ble påvist ved hjelp av forsterket kjemiluminescens, Amersham ECL Plus western blotting påvisningsreagenser (GE helsevesenet, UK). Antistoff detaljer er gitt i S1 tabell.
Flowcytometri for cellesyklus analyse
Cellene ble høstet og vasket i PBS før fiksering i kaldt 70% etanol som ble tilsatt dråpevis til pellet mens virvling. Celler ble fiksert i 30 minutter ved 4 ° C. Fikserte celler ble vasket to ganger i PBS og sentrifugert ved 250 g i en sentrifuge. Celler ble inkubert med 50 ul av en 100 pg /ml stamløsning av RNase og 200 mL propidium jodid (fra 50 ug /ml stamløsning). En BD FACSCalibur (USA) flowcytometer ble anvendt for å analysere cellepopulasjon for cellesyklus endringer.
CFU- assay
Cellene ble dyrket i metylcellulose ved 10X sluttkonsentrasjon (0,3 mL celler til 3 ml metyl-cellulose). Rørene ble virvlet for å sikre at celler og komponentene ble grundig blandet. Metyl cellulose ble utlevert ved hjelp av en 3cc sprøyte og jevnt fordelt i fatet med forsiktige virvelbevegelser. Kulturer ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO2 i luft og ≥95% fuktighet. Kolonier ble deretter farget med krystallfiolett (0,5 mg /ml i 1% metanol) i 20 minutter og lufttørket etter vasking i destillert vann. Stained kolonier ble visualisert under et Nikon Eclipse Ti fasekontrastmikroskop.
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i replikater og resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av student t-test med Prism 5-programmet (GraphPad programvare, USA).
Diskusjon
Kultur i mikrogravitasjon
Tilgjengelighet av
Resultater og celler en overflate for å følge for celler på TCP er en stimulans for vekst for heftende celler som DLD-en og derfor statiske kulturer i TCP var sammenflytende (fig 1A). Slow rotasjoner per minutt (RPM) av HARV (16 RPM, figur 1B) ikke tillate at cellene vokser sammen, men cellene kan danne aggregater ved 27 RPM (figur 1C). Farging med AO /EB viste ingen celledød i statiske TCP kulturer (fig 1D), men avslørte celledød i mikrogravitasjon kulturer av DLD1 på 16 RPM (Fig 1E). Celleviabilitet ble forbedret når cellene samles på 27 RPM (figur 1F). Når disse celle aggregater ble enzymatisk dissosiert og dyrket i et TCP etter 48 timer i mikrogravitasjon, celler tok 48 timer å følge (figur 1G, dag 2), mens celler fra statiske kulturer følges innen 24 timer (figur 1G, dag 1) og produsert konfluent kulturer ved dag 4. Microgravity har vist seg å påvirke en rekke cellefunksjoner [7] og ekspresjon eller funksjon av celleadhesjonsmolekyler kan påvirkes [8] å redusere antall DLD-1-celler som kan følge for TCP. Når slike celleaggregater ble platet i TCP uten enzymatisk dissosiasjon, var morfologien av DLD-1-celler forandret (fig 1H og 1I). Krystallfiolett farging av celler dyrket i statisk monolagskultur viser det typiske morfologi av DLD-1-celler (Fig 1 H), mens celleaggregater anta et vekstmønster i likhet med et utenforliggende kultur og perifere celler som inneholdt en stor cytoplasma og cellekjernen (fig 1I). Den forstørrede celle kanskje på grunn av de cytoskeletal endringer i løpet av vekst i mikrogravitasjon [9] eller celler som har mistet kontrollen over cellesyklusen, kan akkumuleres pre-mitotisk proteinet i cytoplasma med polyploidi i kjernen [9] øker i størrelse. En koloni dannende analyse (CFA) på DLD-1 kulturer i mikrogravitasjon forskjøvet til statisk TCP etter enzymatisk dissosiasjon (Fig 1J og 1K) viste den reduserte potensialet av DLD-1 celler til å danne kolonier (figur 1K) sammenlignet med statiske celler (Fig 1J). Den reduserte proliferative kapasitet på kulturer i mikrogravitasjon ble bekreftet av en celle levedyktighet analysen bruker MTT. Statiske kulturer var 41% mer levedyktig enn 27 RPM kulturer og 75% mer levedyktig enn 16 RPM kulturer i mikrogravitasjon (figur 2A). Når disse resultater er tatt sammen, synes mikrogravitasjon å påvirke levedyktigheten og spredning av DLD-1-celler. Strømningscytometri-analyse av PI lastet DLD-1 celler dyrket i henhold til mikrogravitasjon ble sammenlignet med cellesyklusprofil av kulturer i statisk TCP og statisk suspensjon på agar underlag (figur 2B, 2C og 2D). Fra mangel på forankring, statiske suspensjon cellekulturer på agar også aggregere ligner på RCC, men simulering av mikrogravitasjon er fraværende. DLD-1 kulturer i mikrogravitasjon hadde en betydelig populasjon av celler i sub G0 fasen selv om en stor populasjon av celler var fortsatt levedyktig i mikrogravitasjon (Fig 2C). Statisk enkeltlag, TCP kulturer var helt levedyktig (Fig 2B) og betydelig, gjorde de statiske suspensjonskulturer ikke demonstrere en sub G0 fase og hadde profil som ligner på den statiske kontroll (Fig 2D). Fig 2E viser gjennomsnittlig sub G0 fasen befolkningen i de tre dyrkningsforholdene i gjentak av cellesyklus analyse, som bekreftet at redusert levedyktighet var en eksklusiv effekt av mikrogravitasjon i DLD-1 celle aggregater. Molt-fire cellelinje vokser som en suspensjon kultur og det gjorde ikke samle seg positivt i mikrogravitasjon ved høye eller lave turtall, som viser individuelle celler i HARV (Fig 2F, 16 RPM HARV). Imidlertid cellenes levedyktighet ble redusert med 20% sammenlignet med den statiske kontroll i begge RPM ved 48 timer (figur 2G) som korrelerte med reduserte celleantall etter mikroskopisk observasjon etter 48 timer (figur 2F, 16 RPM HARV). Flowcytometri oppdaget en liten apoptotisk befolkning (Sub G0 scenen) i cellesyklus analyse av MOLT-4 kulturer i mikrogravitasjon på 16 RPM (fig 2 H og 2I)
En DLD-1 cellekulturer.; Statisk kultur (kontroll) B DLD-en Microgravity kultur på 16 RPM C DLD-en Microgravity kultur på 27RPM differensialfarging for å påvise apoptotisk befolknings D DLD-1Static monolagkulturer E mikrogravitasjon kulturer av DLD1 16 RPM F mikrogravitasjon kulturer av DLD1 på 27 RPM G Cell heft og spredning analyse Top panel-statiske kulturer, bunn panel-mikrogravitasjon kulturer flyttet til statisk TCP H Morfologiske endringer i DLD-1; Krystallfiolett farging av DLD-1 celler i statiske enlagskultur jeg krystallfiolett farging av DLD-1 celler etter overføring av celleaggregater fra mikrogravitasjon til TCP J Colony forming evne analysen; Statiske kulturer K Colony forming evne analysen; DLD-1 celler etter overføring av celleaggregater fra mikrogravitasjon til TCP
En Celleviabilitet analyse for DLD-1 celler; Levedyktighet målt for mikrogravitasjon kulturer (16 RPM og 27 RPM) og statiske kulturer ved hjelp av MTT B Cell syklus analyse for DLD-1 celler; Statisk C Cellesyklus analyse; Mikrogravitasjon D Cell syklus analyse; Statiske suspensjoner på agar underlag e Den gjennomsnittlige sub G0 befolkningen i gjentak av cellesyklus analyse for mikrogravitasjon, statisk og statisk suspensjonskulturer av DLD-1 celler F MOLT-4 cellekultur statiske og mikrogravitasjon kulturer av MOLT-4 G Celleviabilitet analyse Livskraftig målt for mikrogravitasjon kulturer (16 RPM og 27 RPM) og statiske kulturer ved hjelp av MTT H Cell syklus analyse; Statisk Jeg Cell syklus analyse; Mikrogravitasjon kulturer av MOLT-4.
Real Time PCR for genekspresjonsanalyser
For å påvirke sentrale prosesser kreft som celledeling og cellesyklus, må mikrogravitasjon betydelig påvirke grunnleggende funksjonene cellen slik som gen-ekspresjon. Vi målte mRNA nivåer av betydelige gener involvert i cellesyklus og kreft progresjon for å se etter deres feilregulering i henhold til mikrogravitasjon. Cyclin genuttrykk nivåer påvirke betydelig kreft progresjon og metastasering som de kan henvise celleproliferasjon eller apoptose. CDK er avgjørende for G1 /S og G2 /M-faseoverganger av cellesyklus og deres feilregulert genekspresjon kan påvirke progresjonen av cellesyklusen. Transkripsjon av
CDK1
er regulert slik at den fungerer under mitotiske prophase og meta [10].
CDK1
uttrykk ble nedregulert i MOLT-4 og oppregulert i DLD-1 (5 ganger i løpet av statisk kontroll) (figur 3A). Uttrykket av gener grunnleggende for kreftutvikling og progresjon, som inkluderer onkogener og potensielle kreftstamcellemarkører, ble dysregulerte i mikrogravitasjon.
CD117 plakater (reseptortyrosinkinasehemming-c-kit) uttrykk ble oppregulert med 11,2 ganger i MOLT-4 og nedregulert med 0,2 ganger i DLD-en i henhold til mikrogravitasjon (fig 3A). Høy c-kit ekspresjon beskytter colon carcinoma celler mot apoptose og forbedrer deres invasive potensial [11]; Derfor kan c-kit downregulation i DLD-en i henhold til mikrogravitasjon være betydelig. DLD-en konstitutivt løpet uttrykker
MYC
genet [12] under normale forhold. Overekspresjon av
MYC
sensitizes celler til apoptose og under mikrogravitasjon
MYC
genekspresjon ble ytterligere økt i DLD-1 av 3 ganger (figur 3A). MOLT4 uttrykt senket nivåer av
MYC plakater (0,4 ganger) i mikrogravitasjon (figur 3A).
JUNB
koder for et transcriptional regulator av celle spredning gener og er en del av den umiddelbare tidlige gen familie [13]. En av de mest betydningsfulle genene som skal dysregulerte i begge cellelinjer i mikrogravitasjon,
JUNB
blir oppregulert i mikrogravitasjon ved 2,1 og 1,2 ganger i MOLT-4 og DLD-1 henholdsvis (figur 3A).
En
CDK1
-celle syklus kinase genet,
CD117
-proto-onkogen,
JUNB
-transcription faktor og umiddelbar tidlig genet,
MYC
-proto-onkogen uttrykk i DLD-en og MOLT-4 B real time PCR-analyse i HL-60
CCNE1 Hotell og
CDK2
,
CCNB1 Hotell og
CDK1
, Onkogener.
CD117 Hotell og
MYC
, Kreft prognostiske markører
CD105
,
CD90 Hotell og
CD71
genekspresjonsanalyser i HL-60,
en promyelocytic leukemi cellelinje
Som en ekstra kontroll for blod tumor (og suspensjon) kulturer, vi sjekket genuttrykk nivåer av cellesyklus gener og onkogener i en promyelocytisk leukemi cellelinje HL-60. Real time PCR avslørte opp regulering av
CCNE1 Hotell og
CDK2
i HARV kulturer med
CDK2
være betydelig oppregulert (1,1 og 1,8 ganger henholdsvis) (Fig 3B) .
CCNB1 Hotell og
CDK1
genekspresjon ble dysregulerte med
CDK1
blir opp regulert 1,5 ganger og
CCNB1
nedregulert med 0,8 ganger (figur 3B). Betydelig, proto-onkogener
CD117 Hotell og
MYC
var svært opp regulert i mikrogravitasjon med 4,7 ganger og 10,8 ganger henholdsvis (figur 3B). I likhet med DLD-en cellelinje, HL-60 også over uttrykker
MYC
genet konstitutivt under standardbetingelser. De prognostiske markører
CD71
,
CD105 Hotell og
CD90
ble dysregulerte henhold mikrogravitasjon med 0,75 ganger (nedregulert), 1,4 ganger (oppregulert) og 2,1 ganger (oppregulert) henholdsvis ( figur 3B). Endoglin (
CD105)
hjelpemidler neovaskularisering i kreft [14] og
CD90
uttrykk angir en positiv prognose som leukemistamceller i AML som er i stand til å opprettholde sykdom in vitro og in vivo ikke gjør uttrykke CD90 [15]. Real time PCR-analyse av en kandidat cellesyklus, onkogen, transkripsjonsfaktor og kreft progresjon markør viste både oppregulering og nedregulering. Etter hvert som cellesyklusen reguleres av en rekke faktorer, hvorav mange kan bli påvirket av mikrogravitasjon, en «kollektiv» nedregulering eller dysregulering av prosesser forbundet med cellesyklusen kan validere den observerte fysiologiske stans eller reduksjon i celleformering i henhold vektløshet. Mot dette målet, ble et genom bredt uttrykk profilering ved hjelp av DNA microarray utført. Den genomisk profilering også tillatt oss å spekulere på effekten av mikrogravitasjon på sentrale veier i kreft som Notch signalsystemet, og uttrykk nivåer av nye regulatorer som mikroRNA.
Microarray analyse av DLD-en og MOLT- 4 celler dyrket i mikrogravitasjon
Microarray analyse viste 1801 og 2542 gener opp og ned regulert mer enn to ganger i DLD-1 celler dyrket i mikrogravitasjon i forhold til statisk kontroll. MOLT-4 kulturer henhold mikrogravitasjon forskjellig uttrykt totalt 349 og 444 gener opp og ned regulert i løpet av to ganger, henholdsvis. Tabell 1 viser en kort liste over vanlige gener deregulerte blant begge cellelinjer. En komplett liste over høyt deregulerte gener hos begge cellelinjene er gitt i S2, S3 og S4 tabeller. Den svært feilregulert gener er representert i støtteinformasjons tabellene inneholder interessante kandidatgener som ribonukleotidreduktase M2 (
RRM2
) subenhet som er den mest nedregulert genet i DLD-en i henhold til mikrogravitasjon. RRM2 overekspresjon kan være forbundet med Colo rektal kreft (CRC) progresjon, og kan spille en viktig rolle i den infiltrasjon og metastasering av CRC [16]. Det fungerer som en prognostisk biomarkør og spår dårlig overlevelse av kolorektal kreft [17]. Mens begge cellelinjene viste forandringer i cellesyklus og celle levedyktighet, mikrogravitasjon fremkalte en større respons fra solid tumor cellelinje DLD-en. Sub dødelig stress kan presse en celle inn i en tilstand som er lik den replikative senescens [18]. Stress-indusert for tidlig senescens (SIP) kan forekomme etter DNA-skade, oksidativt stress og behandling med histondeacetylase inhibitorer [18]. Fenomenet SIPS kan forklare tapet i celleviabilitet i begge cellelinjer. Microarray analyse viste at nedregulering av retinoblastom-genet (
RB1
; -0,42 log ganger endring) i DLD-1-celler i henhold til mikrogravitasjon og som tilstedeværelsen av RB1-proteinet er nødvendig for SIPS [19], responsen av DLD-1 celler til mikrogravitasjon kan ikke være gjennom SIPS og tilhørende veier. Omvendt MOLT-4-celler viser oppregulert RB1 uttrykk (0,47 log ganger endring) under mikrogravitasjon og tap i celle levedyktighet kan tilskrives SIPS. Dette kan også forklare den relativt mindre antall gener som er differensielt uttrykt i MOLT-4-celler sammenlignet med genekspresjon profilen av DLD-1-celler i henhold til vektløshet. Andre biomarkører av SIPS, apolipoprotein J og fibronectin, som er overuttrykt i replicative alderdom og SIPS [19], ble ikke uttrykt forskjellig i DLD-en eller MOLT-4 i henhold til mikrogravitasjon. Mekanismen av SIPS er ikke klart forstått ennå, og om mikrogravitasjon kan være en trigger for slurker trasé må bekreftes. Dataene som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE69271 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69271) . De differensielt uttrykte gener fra microarray data ble studert for sin overflod i ulike Gene ontologi (GO) termer samt trasé ved hjelp av microarray analyse programvare DAVID. Berikelse score på enkelt GO vilkår at gener assosiert med ble brukt til å identifisere prosesser som var betydelig feilregulert. GO eller funksjonelle berikelse analyse ble utført med over to fold-differensielt uttrykte gener i begge cellelinjer. Funksjonell klassifisering av gener basert på likhet i funksjon eller familie ble utført.
Validering av kandidatgener valgt fra microarray data
Microarray analyse avslørte oppregulering av
CCNB1
og nedregulering av
ROMO1 Hotell og
HES1
gener når MOLT-4-celler ble dyrket under mikrogravitasjon (fig 4A). Tilsvarende microarray analyse viste nedregulering av
CDK2
genet og oppregulering av
STAT3 Hotell og
HEY1
gener i DLD-1 celler dyrket under mikrogravitasjon (fig 4B). Microarray analyse viste at begge cellelinjene ofte viste nedregulering av
CCNE1
og oppregulering av
CD71 Hotell og
CD44
gener (fig 4C, Fig 5A). Betydelig, dereguleringen av mikroRNA-22 vert genet og dets mål var også under mikrogravitasjon (Fig 5B). mRNA-ekspresjon av disse kandidat gener representant av cellesyklusen, transkripsjonsregulering og progresjon av kreft ble validert ved kvantitativ sanntid PCR. Cyclin B1 som har blitt rapportert som konstitutivt overexpressed i menneskelige kolorektal kreft [20] er over uttrykt i MOLT-4-celler som viste en 7,5 ganger økning av
CCNB1
mRNA til uttrykk under mikrogravitasjon (Fig 4A). Senket uttrykk for
ROMO1
fører til inhibering av cellevekst [21] og MOLT-4-celler uttrykte 0,5 ganger mindre
ROMO1
enn den statiske kontroll (figur 4A). Transkripsjonell og replikering kontrollere regulere onkogener og prognostiske markører og innflytelse celle syklus hendelser.
HES1
er en transkripsjons repressor og er involvert i DNA-reparasjon [22] og
HES1
genuttrykk styres av Notch og Jun signalsystem [23].
HES1
genuttrykk er nedregulert med 0,7 ganger i MOLT-4 (Fig 4A) under mikrogravitasjon.
CDK2
genuttrykk i DLD-1 celler var 0,5 ganger lavere sammenlignet med statisk kontroll (Fig 4B) mens
HEY1
, en transkripsjonsregulator var høyt opp regulert med 10,3 ganger (figur 4B). Signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (
STAT3
) er et oncogent transkripsjonsfaktor som er aktivert og avvikende uttrykt i mange kolorektal kreft [24] og gener oppregulering er validert ved hjelp av RT-PCR (figur 4B). Cyclin E1 genekspresjon nedregulert i begge cellelinjer i henhold til mikrogravitasjons (figur 4C). Cyclin E1 styrer utviklingen av cellesyklusen gjennom G1 fasen av sin interaksjon med cyclin avhengig kinase 2 [25]. Tilsvarende begge cellelinjene uttrykte reduserte nivåer av
CD71
, som koder for et transmembran-glykoprotein som er ansvarlig for cellejernopptak (figur 4C). DLD-1 uttrykt betydelig lavere nivåer (0,42 ganger) i mikrogravitasjon. Høyere ekspresjon av
CD71
er assosiert med negativ prognose for mange solide tumorer og lymfomer noen [26,27] og tallrike studier har funnet en positiv korrelasjon mellom jern lagring og risikoen for tumorer så som i kolorektal karsinom [28 ]. Betydelig,
CD44
genet ble oppregulert i begge cellelinjer (figur 4C, Fig 5A). Mens de fleste isoformer av
CD44
er forbundet med ondartet form av sykdommen, noen former for
CD44
hindre kreftceller fra å spre seg ut av den primære området [29]. Som
CD44
er uttrykt i både tykktarm og lymfoide kreft og som mRNA analyse ville innebære flere varianter, vi undersøkt sine proteinnivået i DLD-en og MOLT-4 kulturer i mikrogravitasjon. Western blotting for standard isoform av
CD44
viser høyere nivåer av proteinet i begge cellelinjene enn statisk kontroll (Fig 5A). Densitometrisk analyse av band og normalisering med p-aktin verdier demonstrerer betydelig opp regulering av
CD44
protein i mikrogravitasjon. mikroRNA har blitt identifisert som potensielle onkogener eller tumor suppressors [30]. Mir-22 vert genet,
MIR22HG
var sterkt oppregulert i DLD-en (Logg fold 4.4), men ikke forskjellig uttrykt i MOLT-4 (Fig 5B). MIR-22 fungerer som en tumor suppressor gjennom post-transcriptional regulering av p21 å bestemme celle skjebne [31]. Det undertrykker kreft progresjon ved å indusere cellealdrings [32] og kontrollerer Evi-en onkogen uttrykk i metastatisk brystkreft celler [33]. Noen mål fra Mir-22 som
SP1
,
CDK6 Hotell og
CCNA2
ble også betydelig nedregulert (Fig 5B), mens andre som p21 (
CDKN1A
) ble ikke signifikant dysregulerte. Den farnesoid X reseptor regulerer MIR-22 som retter seg mot
CCNA2
i tykktarm og lever kreftceller [34]. Real time PCR for MIR-22 mikroRNA viste også en 4,18 log fold oppregulering i DLD-1 celler etter mikrogravitasjon (Fig 5B) bekrefter ganger endring observert i microarray analyse. Real Time PCR for MIR-22 DUER
CCND1 Hotell og
CDKN1A
imidlertid ikke vise betydelig feilregulering med -0,09 log ganger (nedregulering) og 0,11 log ganger (opp regulering) endring, henholdsvis (figur 5B).
