Abstract
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er involvert i karakteristikkene av kreft, for eksempel invasjon, metastaser, og chemoresistance. I galleveier kreft (BTC), blir EMT indusert av transformerende vekstfaktor-beta-1 (TGF-β1). EMT er reversible; Derfor er det tenkelig at den kan være relatert til noen epigenetiske endringer. Vi fokuserte på histondeacetylase (HDAC) hemmere som regulatorer av TGF-β1 signalering, og undersøkt deres effekt på EMT og chemoresistance. Vi benyttet fire BTC cellelinjer (MzChA-1, gemcitabin-resistente MzChA-1, TFK-1, og gemcitabin-resistente TFK-1) og anvendt vorinostat som HDAC-inhibitor. Den relative mRNA uttrykk for en epitelial markør (CDH1) og mesenchymale markører (CDH2, vimentin, SNAI1) ble målt ved QRT-PCR for å vurdere faktorer assosiert med EMT. MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) analyse ble utført for å evaluere chemoresistance av hver cellelinje. I tillegg ble NOD /SCID-mus brukes for å evaluere effekten av vorinostat
in vivo
. I den overordnede MzChA-en og TFK-1 cellelinjer, TGF-β1 indusert EMT og chemoresistance; mens vorinostat hemmet EMT og chemoresistance indusert av TGF-β1. I gemcitabin-resistente cellelinjer som høyt uttrykte TGF-β1, vorinostat hemmet EMT og dempes chemoresistance. Vi viste at vorinostat inhiberer kjernetranslokasjon av SMAD4 som er et signaleringsfaktor TGF-β1, og dette er en av de mekanismer som regulerer vorinostat EMT. Vi viste også at vorinostat demper bindingsaffiniteten SMAD4 til CDH1 relaterte transkripsjon faktorer SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, og vri. Videre kombinasjonsbehandling med vorinostat og gemcitabin forbedret overlevelsestiden i mus xenopodet med gemcitabin motstandsdyktig MzChA-1 celler. I konklusjonen, vorinostat regulert TGF-β1-indusert EMT og chemoresistance gjennom hemming av SMAD4 kjernefysisk trans
Citation. Sakamoto T, Kobayashi S, Yamada D, Nagano H, Tomokuni A, Tomimaru Y, et al. (2016) En histondeacetylase Inhibitor undertrykker Epitelial-Mesenchymale Overgang og Demper Chemoresistance i galleveiene kreft. PLoS ONE 11 (1): e0145985. doi: 10,1371 /journal.pone.0145985
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 25 juni 2015; Godkjent: 07.10.2015; Publisert: 04.01.2016
Copyright: © 2016 Sakamoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grant-i-Aid for Scientific Research av JSP ((C) 24592024), og Grand-i-Aid for Unge Forskere JSP ((B) 26861069)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
galleveier kreft (BTC), som har en økende forekomst over hele verden, har en dårlig prognose, fordi det er vanskelig å diagnostisere i de tidlige stadier. Den 5-års overlevelse er mindre enn 30% [1-3]. Ved diagnose, mange pasienter har operabel BTC på grunn av lokal spredning av sykdommen og /eller metastaser. Gemcitabin (GEM) -baserte kjemoterapi er ofte brukt; imidlertid, er det antitumoreffekt utilstrekkelig, og den midlere overlevelsestid er begrenset til omtrent 10 måneder [4,5]. For å forbedre prognosen for BTC pasienter har molekylærbiologi av sykdommen blitt studert, inkludert inflammatoriske cytokiner, epitel-mesenchymale overgang (EMT), DNA-reparasjon system, cellesignalering, og apoptose [6-9]. Vi har tidligere vist at EMT ble observert ved invasjonen foran og i regionale lymfeknutemetastaser med inflammatorisk cytokin ekspresjon i BTC [10]. Flere typer cytokiner velig indusere EMT, som er relatert til ondartede prosesser som invasjon, metastase, og chemoresistance (S1 tabell) [11-15]. Transformerende vekstfaktor-beta-1 (TGF-β1) induserer EMT og chemoresistance, og kjemoresistent BTC-celler produserer IL-6 og TGF-β1 [10]; Derfor vurderte vi at disse cytokinene kan spille en viktig rolle i å fremme EMT i BTC.
etterfølgende runder av EMT og mesenchymale-epitel overgang (MET) forekomme i løpet av svulstutvikling, noe som tyder på at EMT kan være reversible og forbundet med epigenetiske endringer [16]. Vi fokuserte på histondeacetylase (HDAC) som en faktor knyttet til epigenetiske forandringer. I våre microarray data, mRNA nivåer av klasse I HDACs (HDAC1, HDAC2, HDAC3, og HDAC8) ble forhøyet i GEM-resistente BTC celler. Dessuten ble den HDAC-aktivitet økes ved eksponering til TGF-β1. Disse funnene antyder at HDACs kan være forbundet med EMT, og hemming av HDACs kan undertrykke EMT gjennom virkninger på TGF-β1 signalering. Vi har også undersøkt SMAD4, nøkkelen signale faktor TGF-β1 for EMT, og fant det var direkte stimulert av TGF-β1 signalering, med trans inn i kjernen hvor det oppregulerer EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer som SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2 og TWIST [17-21]. I tillegg, i normale hepatocytter og mesothelial celler, hemming av HDACs dempes den kjernefysiske translokasjon av SMAD4 [22,23]. I denne studien hypotese vi at HDAC hemmere kan regulere EMT gjennom TGF-β1 signalveien i BTC celler.
Hensikten med denne studien var å undersøke effekten av HDAC hemmer vorinostat på TGF-β1 signale sti og chemoresistance, som er relatert til EMT i BTC celler. Først undersøkte vi effekten av vorinostat på TGF-β1-indusert EMT. Deretter undersøkte vi effekten av vorinostat på kjemoresistent BTC-celler. Deretter viste vi påvirkning av vorinostat på SMAD4 atomtrans i BTC celler. Til slutt, vi evaluert effekten av vorinostat kombinert med GEM for BTC med hjelp mus xenopodet med MzChA-en eller GEM-resistente MzChA-1 celler. Resultatene viste effektiviteten av en HDAC hemmer i å regulere EMT og chemoresistance
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi identifiserte også en av de mekanismer som en HDAC hemmer undertrykker EMT og demper chemoresistance.
Materialer og Metoder
Cellelinjer, kulturer og narkotika
Vi brukte menneske BTC cellelinjer MzChA-1 og TFK-1. De MzChA-1 celler ble vennlig levert av professor Gregory J. Gores av Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, USA (USA) [24-27]. De MzChA-1-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium.
TFK-1-cellelinjen ble oppnådd fra Riken Bioresource Center i Japan. Disse cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium. Hvert medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Alle cellelinjer ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
Alle cellelinjer ble behandlet med 5 ng /ml rekombinant humant TGF-β1 (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ, USA), 100 nM (MzChA-1 og GEM-resistente MzChA-1) eller 300 nM (TFK-1 og GEM-resistente TFK-1) av histondeacetylase-inhibitoren vorinostat (Selleckchem, Houston, TX, USA), eller dimetylsulfoksyd (som en kontroll) i 72 timer. I forsøket med TGF-β1, ble hvert medium endret til serumfritt medium 24 timer etter passasje for å utelukke påvirkning av TGF-β1 i serum. TGF-β1 og vorinostat ble tilsatt til hver cellelinje etter endringen av mediet. Antistoffene beskrevet i S2 tabell ble brukt til western blot analyse, immunhistokjemi, og immunocytochemistry.
Etablering av GEM-resistente MzChA-en (MzChA-1_GR) og TFK-en (TFK-1_GR) kloner
GEM-resistente MzChA-1 og TFK-1 cellelinjene ble etablert gjennom eksponering for økende konsentrasjoner av GEM (fra 0,2 ng /mL til 80 ng /mL for MzChA-en, og fra 0,2 ng /mL til 40 ng /ul i TFK-en) over 3 måneder. Etter å ha bekreftet at disse cellelinjer oppnådd mer motstand mot GEM enn de overordnede cellelinjer ble MzChA-1_GR og TFK-1_GR cellekloner etablert av begrensende fortynning.
Analyse av HDAC aktivitet
MzChA-1-celler ble dyrket med eller uten 5 ng /ml TGF-β1 og 300 nM vorinostat i 72 timer. Deretter ble kjerneproteiner ekstrahert med Nuclear Extract Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Deretter ble aktiviteten av HDAC målt med HDAC aktivitet assay kit (BioVision, Palo Alto, USA). I dette forsøk brukte vi HeLa kjerneekstrakt som en positiv kontroll og destillert vann som en negativ kontroll. Alle prosedyrer ble utført i henhold til produsentens anbefalinger.
Immunocytochemistry
Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyde i 15 minutter ved romtemperatur, permeabilized med 0,1% Triton X-100, og blokkert med en % BSA i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene farget med de angitte antistoffer.
kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komplementært DNA ble syntetisert fra 3,0 mikrogram av total RNA Superscript med den første-tråd-syntese systemet (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Kvantitative real-time polymerase kjedereaksjoner (QRT-PCR) ble utført med LightCycler-Fast-Start DNA Master SYBR Grønn Jeg kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) med genet spesifikke oligonukleotid primere, som vist i S3 tabell . Amplifikasjoner ble utført in triplo ved å bruke LightCycler System (Roche Applied Science) i henhold til produsentens protokoll. En smeltekurve analyse ble utført for å skille spesifikke produkter fra ikke-spesifikke produkter og primer-dimerer. Den relative ekspresjon ble beregnet som forholdet mellom spesifikk mRNA til endogen β-aktin (ACTB) mRNA i hver prøve. Alle QRT-PCR ble utført in triplo, og resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.
vekstinhibering analyser med GEM terapi
Hver cellelinje (5 x 10
3 celler /brønn) ble sådd ut i en 96-brønnplate og inkubert i 24 timer. Deretter ble mediet skiftet til serumfritt medium. Deretter ble cellene eksponert for GEM (1-120ng /ml) med de angitte midler (TGF-β1, vorinostat eller dimetylsulfoksyd) i 72 timer. Disse analyser ble gjentatt minst tre ganger, og lignende resultater ble oppnådd hver gang. Andelen av MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) -positive celler inkubert uten medikamenter ble definert som 100% levedyktighet.
Transfeksjon av små interfererende RNA (siRNA)
Vi brukte TGF-s siRNA (Invitrogen) og egge oligonukleotid siRNA (Sc) som en negativ kontroll. Vi utførte siRNA transfeksjon med Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) i følge produsentens protokoller [28]. Transfeksjonseffektiviteten ble bekreftet ved QRT-PCR.
Western blot-analyse
Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [28]. Kort fortalt ble en hel cellelysat hentet fra BTC celler med RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) og kjerneproteiner ble hentet med EpiQuick Nuclear Extraction Kit I (Epigentek Group Inc., Brooklyn, NY, USA), i henhold til produsentens protokoll. Aliquoter (12 ^ g) av total eller kjerneproteiner ble underkastet elektroforese på natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-geler inneholdende 10% Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). De separerte proteinene ble overført til polyvinylidendifluorid membraner (Millipore) og inkubert med hver primær antistoff over natten ved 4 ° C.
Chromatin immunoprecipitation (chip)
chip Analysen ble utført med hjelp av en chip -IT Express Enzymatisk kit (Active Motif) som tidligere beskrevet [29]. I korthet, en x 10
7-celler ble kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og stoppet ved tilsetning av glycin. For å høste kromatin-DNA komplekser, ble cellelysatet ble behandlet med en enzymatisk skjærsett (Active Motiv), i henhold til produsentens spesifikasjoner. For immunoprecipitation, ble 120 mikrogram av kromatin-DNA komplekser inkubert med Protein G magnetiske kuler knyttet til anti-SMAD4 antistoff (10 ug, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA), eller anti-IgG antistoff (10 mikrogram, Aktiv Motif) . Eluatene ble anvendt som templater for PCR. Like mengder av anti-IgG eller pre-immun kromatin-DNA-kompleks ble anvendt som kontroller. Primersettene anvendt for PCR-amplifikasjon var: SNAI1: 5′-GCTGTCACACCCGGCACCAAG-3 «og 5′-GGCGGCTTGAAATGCCACGG-3′, SNAI2: 5»-ATGCGTGTGAAGTGCTTAGCATAGT-3 «og 5′-CACTCAGTGCCCAACAGTGTGT-3′, ZEB1: 5»- TTTCGGGAAGTTAAAATGTTTG-3 «og 5′-ATCCTGCTTCATCTGCCTGA-3′, ZEB2: 5»-TACGCCTGCGCTGTGACCTA-3 «og 5′-ACTCACTGGACCCGCCTCAG-3′, og VRI: 5»-AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG-3 «og 5′-CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG-3».
mus xenograft tumor modell
MzChA-en eller MzChA-1_GR celler (1,0 × 10
6 celler per mus) ble injisert i subkutant vev på baksiden av fem til seks uker gamle hann nakne mus (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan), og tumorene ble tillatt å utvikle seg. Når tumorene vokste til volumet av 200 mm
3, GEM (125 mg /kg, en gang i uken) med eller uten vorinostat (60 mg /kg, 5 påfølgende dager pr uke) ble administrert ved intraperitoneal injeksjon. For å undersøke effekten av vorinostat på overlevelsestid, behandling ble fortsatt inntil passende eutanasi. Resected eksemplarer av svulster ble brukt for immunhistokjemi å undersøke uttrykket av SMAD4.
Immunohistochemistry
Immunohistokjemiske studier på 10 resected vevsprøver fra musene xenopodet med MzChA-1_GR celler. Kort sagt ble formalinfikserte, parafininnstøpte vev deparaffinized, kokt for antigen gjenfinning, inkubert med en SMAD4 antistoff i 1 time ved romtemperatur, deretter visualisert med avidin-biotin kompleks reagenser (Vector Laboratory Inc., Burlingame, CA, USA) og diaminobenzidin. Alle deler ble kontra med hematoksylin. Alle immunhistokjemiske studier ble evaluert i seriesnitt med hvert antistoff.
Etiske uttalelser
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til de Institutional Animal Care og bruk komité ved Osaka University (godkjenningsnummer : 20-087), og studiene ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. I dyreforsøk ble alle invasive behandlinger som xenograft transplantasjon, sonde, og aktiv dødshjelp utføres under generell anestesi med sevofluran. Musene ble avlivet ved starten av kliniske symptomer så som alvorlig cachexia, signifikant vekttap eller inaktivitet.
Statistisk analyse
Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av t-test eller Fishers eksakte test for kategoriske data. Den uparet t-test ble brukt for å undersøke forskjeller i veksthemmende effekter
in vitro
.
P
-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Etablering av Mz-Cha-1_GR og TFK-1_GR cellelinjer
Vi etablerte GEM-resistente cellelinjer, MzChA-1_GR og TFK-1_GR, for å undersøke effekten av HDAC hemmere på chemoresistance. De MzChA-1_GR celler var resistente mot GEM (IC
50 for GEM 100 ng /ml,
P
0,01 versus foreldre MzChA-1 celler, S1A figur) og TFK-1_GR celler resistente mot GEM (IC
50 for GEM 100 ng /ml,
P
0,01 versus foreldre TFK-1 celler, S1B Fig). Disse GEM-resistente celler hadde spindel-lignende figurer.
Microarray analyse
Et microarray analyse ble utført ved hjelp av Toray 3D-Gene
® å sammenligne uttrykk profiler av MzChA-1 celler med de av MzChA-1_GR celler og undersøke forhold knyttet til epigenetikk. Resultatene viste at ekspresjon av klasse I HDACs (HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, og HDAC-8) var høyere i MzChA-1_GR celler enn foreldre MzChA-1-celler (Tabell 1). Vorinostat hemmer disse klasse I HDACs, så vi vurderte at vorinostat kan være effektive i kjemoresistent BTC celler.
Den mRNA uttrykk for klasse I HDACs og HDAC aktivitet i MzChA-en og MzChA-1_GR celler
for å validere microarray analyseresultatene, QRT-PCR for klasse i HDACs ble utført for MzChA-1 og MzChA-1_GR celler. Alle klasse I HDACs viste høyere uttrykk i MzChA-1_GR celler sammenlignet med MzChA-1 celler (
P
0,05, figur 1A). Den HDAC aktivitet var signifikant høyere i MzChA-1-celler utsatt for TGF-β1 i 72 timer og MzChA-1_GR-celler sammenlignet med foreldre MzChA-1-celler (
P
0,05, figur 1B). I tillegg vorinostat undertrykt HDAC aktivitet både MzChA-1 celler eksponert for TGF-β1 og MzChA-1_GR celler (
P
0,05, figur 1C).
Verdier representerer gjennomsnittet ± SD *
P
0,05. Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger. (A) sammenligning av ekspresjon av klasse I HDACs i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler ved QRT-PCR. (B) Effekten av TGF-β1 på HDAC aktivitet i MzChA-1-celler og den HDAC aktivitet i MzChA-1_GR-celler, ble målt med HDAC aktivitet assay kit. (C) Endringene i HDAC aktivitet i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler behandlet med TGF-β1 og vorinostat. I forsøkene for panelene (B) og (C) ble cellene inkubert med eller uten 5 ng /ml TGF-β1 eller 100 nM vorinostat i 72 timer.
Forholdet mellom TGF-β1 uttrykk og chemoresistance
for å klargjøre betydningen av TGF-β1 i EMT og chemoresistance undersøkte vi uttrykket av TGF-β1 i foreldrenes MzChA-en og MzChA-1_GR celler. Resultatene viste at uttrykket nivået av TGF-β1 var signifikant høyere i MzChA-1_GR celler enn foreldre MzChA-1-celler (figur 2A). Så, vi tilført med si
TGF-β
å undersøke om EMT og chemoresistance kan undertrykkes av TGF-slå ned i MzChA-1_GR celler. Resultatet viste at MzChA-1_GR celler transfektert med si
TGF-β
hadde økt mRNA uttrykk for CDH1 og redusert mRNA uttrykk for CDH2, vimentin, og SNAI1 (Fig 2B). Videre transfeksjon med si
TGF-β
svekket chemoresistance i MzChA-1_GR celler (figur 2C). Disse resultatene antydet betydningen av TGF-β i EMT og chemoresistance i BTC.
MzChA-1_GR celler ble transfektert med egge oligonukleotid siRNA (negativ kontroll) eller TGF-β1 siRNA. Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. *
P
0,05. (A) sammenligning av ekspresjon av TGF-β1 i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler. (B) De forandringer av EMT-relatert mRNA-ekspresjon som et resultat av TGF-S siRNA transfeksjon i MzChA-1_GR celler. (C) Virkningen av TGF-B siRNA transfeksjon på chemoresistance i MzChA-1_GR celler. Veksthemming ble utført for transfektert og ikke-transfekterte celler behandlet med GEM.
Effekten av vorinostat på TGF-β1-indusert EMT og chemoresistance
Vi undersøkte effekten av vorinostat på TGF-β1-indusert EMT og chemoresistance i BTC celler. I MzChA-1-celler, TGF-β1 forårsaket morfologiske forandringer av cellene, fra valvate lignende former til spindel-lignende former. Videre TGF-β1 nedregulert ekspresjon av CDH1 som bestemt ved immunofluorescens-farging (figur 3A). I motsetning til dette, vorinostat hindret disse endringer forårsaket av TGF-β1 (figur 3A). Videre redusert TGF-β1 mRNA ekspresjon av CDH1 og øket mRNA-ekspresjon av CDH2, vimentin (VIM), og SNAI1. I motsetning til dette hemmet vorinostat endringer i mRNA-ekspresjon forårsaket av TGF-β1 (
P
0,05, figur 3B). I tillegg vorinostat svekket GEM motstand indusert av TGF-β1 (
P
0,05, figur 3C). I TFK-1-celler, vorinostat forhindret morfologiske endringer og nedregulering av CDH1 forårsaket av TGF-β1 (figur 3D). Vorinostat også hemmet endringer i mRNA uttrykk knyttet til EMT (
P
0,05, figur 3E), og svekket chemoresistance til GEM forårsaket av TGF-β1 (
P
0,05, fig 3F). Således vorinostat trykkes EMT og dempes chemoresistance forårsaket av TGF-β1.
I hvert forsøk ble cellene inkubert med eller uten 5 ng /ml TGF-β1 og 100 nM av vorinostat for MzChA-1-celler og 300 nM av vorinostat for TFK-1-celler i 72 timer. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. *
P
0,05. Skala barer: 100 mikrometer. Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger. (A) Representative celle morfologiske endringer indusert av TGF-β og vorinostat i MzChA-1-celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) ble utført i MzChA-1-celler. Nuclear farging (blå) ble utført med Hoechst. (B) Effekten av vorinostat på EMT-relaterte mRNA uttrykk i MzChA-1 celler. (C) Effekten av vorinostat på chemoresistance indusert av TGF-β1 eksponering i MzChA-1-celler. De veksthemming ble utført for MzChA-1-celler behandlet med GEM. (D) Representative celle morfologiske endringer indusert av TGF-β og vorinostat i TFK-1-celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) ble utført i TFK-1-celler. Nuclear farging (blå) ble utført med Hoechst. (E) Effekten av vorinostat på EMT-relaterte mRNA uttrykk i TFK-1 celler. (F) Effekten av vorinostat på chemoresistance indusert av TGF-β1 eksponering i TFK-1-celler. Veksthemming ble utført for TFK-1 celler behandlet med GEM.
Påvirkningen av vorinostat på MzChA-1_GR og TFK-1_GR celler
I MzChA-1_GR celler, vorinostat endret morfologien fra spindelignende former til valvate lignende former og forbedret farging av CDH1, som bestemt ved immunofluorescens-farging (figur 4A). Den CDH1 mRNA uttrykk tendens til å øke, og CDH2, VIM, og SNAI1 ble betydelig redusert etter vorinostat (
P
0,05, figur 4B). I tillegg vorinostat svekket GEM chemoresistance i MzChA-1_GR celler (
P
0,05, fig 4C).
I hvert forsøk ble MzChA-1_GR celler inkubert med eller uten 100 nM vorinostat og TFK-1_GR celler med eller uten 300nm vorinostat i 72 timer. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. *
P
0,05. Skala barer: 100 mikrometer. Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger. (A) Representant morfologisk endring indusert av vorinostat i MzChA-1_GR celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) ble utført i MzChA-1-celler. Nuclear farging (blå) ble utført med Hoechst. (B) Effekten av vorinostat på EMT-relaterte mRNA uttrykk i MzChA-1_GR celler. (C) Effekten av vorinostat på chemoresistance i MzChA-1_GRcells. Veksthemming ble utført for MzChA-1_GR celler behandlet med GEM. (D) Representative morfologiske endringer indusert av vorinostat i TFK-1_GR celler. Immunfluorescens for CDH1 (rød) ble utført i TFK-1_GR celler. Nuclear farging (blå) ble utført med Hoechst. (E) Effekten av vorinostat på EMT-relaterte mRNA uttrykk i TFK-1_GR celler. (F) Effekten av vorinostat på chemoresistance i TFK-1_GR celler. Veksthemming ble utført for TFK-1_GR celler behandlet med GEM.
TFK-1_GR celler, vorinostat endret morfologi og forbedret farging av CDH1, målt ved immunofluorescens farging lik MzChA-1_GR celler (figur 4D). I tillegg vorinostat økt ekspresjon av CDH1 mRNA, og redusert mRNA-ekspresjon av CDH2, VIM, og SNAI1 (
P
0,05, figur 4E). GEM motstand ble også svekket av vorinostat i TFK-1_GR celler (
P
0,05, figur 4F). Disse resultatene antydet at vorinostat trykt EMT og svekket chemoresistance i GEM resistente BTC celler.
Effekten av vorinostat på SMAD4 atomtrans i MzChA-1 celler
I vår forrige undersøkelse, SMAD4 var nøkkelen molekyl som regulerer TGF-β1-indusert EMT [10]. Derfor, undersøkte vi effekten av vorinostat på ekspresjon av SMAD4 ved western blot-analyse. I helcellelysater, var det ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av SMAD4 protein mellom TGF-β1 gruppe og TGF-β1 plus vorinostat gruppe (Fig 5A, til venstre). Imidlertid TGF-β1 oppregulert ekspresjonen av SMAD4 nukleoprotein sammenlignet med kontrollgruppen, og vorinostat inhiberte denne oppregulering av den SMAD4 nukleoprotein forårsaket av TGF-β1 (figur 5A, til høyre). Videre brukte vi chip metode for å analysere den molekylære mekanismen for SMAD4. Mens TGF-β1 forbedret bindingsaffiniteten SMAD4 til CDH1-relaterte transkripsjonelle faktorer SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, og vri, vorinostat inhiberte TGF-β1 forbedret bindingsaffiniteten SMAD4 til disse transkripsjonelle faktorer (figur 5B).
i hvert forsøk ble celler inkubert med eller uten 5 ng /ml TGF-β1 og 100 nM av vorinostat i 72 timer. Skala barer: 100 mikrometer. Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger. (A) Endringen i SMAD4 ekspresjon i helcellelysater (venstre panel) og i kjernen (høyre panel) forårsaket av TGF-β og vorinostat. (B) ChIP analysen viser uttrykk for SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, og TWIST, som er regulerende elementer av CDH1. (C) Immunofluorescens av SMAD4 (grønn) ble utført i MzChA-1-celler. Effekten av TGF-β1 og vorinostat på SMAD4 nukleær translokasjon ble undersøkt. Nuclear farging (blå) ble utført med Hoechst.
Immunocytochemistry vist at SMAD4 farget sterkt i kjernen etter behandling med TGF-β1 (Fig 5C). I motsetning til dette ble SMAD4 svakt farget i kjernen etter behandling med TGF-β1 plus vorinostat (figur 5C). Basert på disse resultatene, vorinostat regulert EMT gjennom hemming av SMAD4 kjernefysisk translokasjon.
Effekten av vorinostat på TGF-beta signal faktorer, SMAD2, SMAD3, og Jun N-terminal kinase (JNK)
Vi undersøkte også effekten av vorinostat på SMAD2 og SMAD3 fordi de er nært knyttet til SMAD4 atomtrans i TGF-β signalering. Vi fant TGF-β1 indusert SMAD2 og SMAD3 fosforylering i begge helcellelysater og nukleære proteiner (fig 6). I tillegg vorinostat inhiberte TGF-β1-indusert nukleær translokasjon av fosforylert SMAD2 (p-SMAD2) og SMAD3 (p-SMAD3); mens, vorinostat hadde ingen effekt på den nukleære translokasjon av SMAD2 og SMAD3 (figur 6). Disse resultatene tyder på at vorinostat kan hemme nukleær translokasjon av p-SMAD2, p-SMAD3, og SMAD4 samtidig. Vi har også undersøkt aktivering av JNK fordi de siste rapportene viste at JNK-aktivering spiller en sentral rolle i TGF-β mediert EMT. Resultatet viste TGF-β1 oppregulert ekspresjonen av fosforylert JNK; imidlertid, vorinostat hadde ingen effekt på JNK (figur 6). Følgelig synes effekten av vorinostat på EMT for å være uavhengig av JNK-reaksjonsveien i BTC.
I hvert forsøk ble celler inkubert med eller uten 5 ng /ml TGF-β1 og 100 nM av vorinostat for 72 h. Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger. Endringene i SMAD2, p-SMAD2, SMAD3, og p-SMAD3 uttrykk i helcellelysater (venstre panel) og i (høyre panel) kjernen vises. Uttrykket av JNK og p-JNK i helcellelysater er også vist (venstre panel).
Effekten av vorinostat på musen xenopodet tumormodell
For å bekrefte
in vitro
resultater, vurderte vi effekten av vorinostat på mus xenopodet med MzChA-1 eller MzChA-1_GR celler. I mus xenopodet med MzChA-1 celler, kombinasjonsbehandling med vorinostat og GEM ble ikke bedre overlevelsestiden sammenlignet med en enkel administrasjon av GEM (Fig 7A). I motsetning til kombinasjonsbehandling med vorinostat og GEM forbedret overlevelsestiden sammenlignet med en enkel administrasjon av GEM i mus xenopodet med MzChA-1_GR celler (log-rank test,
P
0,01, figur 7B).
NOD /SCID-mus xenopodet med MzChA-1 og MzChA-1_GR celler ble ansatt som
in vivo
modeller. Når tumorvolumet var over 200 mm
3, ble musene behandlet med de angitte midler (GEM [125 mg /kg, en gang i uken] og /eller vorinostat [60 mg /kg, 5 påfølgende dager pr uke]) . Den prognostiske verdien ble evaluert av Kaplan-Meier-metoden og en log-rank test. (A) Survival kurve for mus xenopodet med MzChA-1 celler. (B) Survival kurve for mus xenopodet med MzChA-1_GR celler. (C) Immunhistokjemi for SMAD4 på resected vevsprøver av musene xenopodet med MzChA-1_GR celler.
Deretter vi utført immunhistokjemi på resected vevsprøver av mus for å behandle uttrykket av SMAD4
in vivo
. Resultatet viste at SMAD4 var sterkt farget i kjernen av tumorceller når musene ble behandlet med en enkelt administrering av GEM. I motsetning til dette ble SMAD4 svakt farget i kjernen av tumorceller når musene ble behandlet med GEM og vorinostat (figur 7C). Disse resultatene var de samme i begge primære og metastaser (lunge). Dermed vorinostat forbedret overlevelsestiden i mus xenopodet med kjemoresistent celler når de ble behandlet med GEM.
Diskusjon
I mange kreftformer, er flere gener knyttet til tumorigenesis og tumorprogresjon oppregulert, og gener relatert til tumor undertrykkelse er nedregulert. En av de faktorer som regulerer ekspresjon av dette genet er posttranslasjonell modifisering av histoner. Metylering og acetylering av histoner er velkjent posttranslasjonelle modifikasjoner [30-32]. Nylig har mye oppmerksomhet er betalt til metylering og acetylering av histoner for behandling av kreft [33,34]. I denne studien har vi fokusert på evnen til HDAC hemmere å regulere EMT. Vi brukte vorinostat, som hemmer klasse I HDACs og blir ofte brukt som en HDAC-inhibitor hos kreft kliniske forsøk, som vist i tabell S4 [35-39]. I flere kreftformer, som ikke-småcellet lungekreft og brystkreft, kombinasjonskjemoterapi med vorinostat var trygg og viste potensial for å forbedre effekten [38,40].
Vi har fokusert på SMADs, spesielt SMAD4 som er en signaleringsfaktor TGF-β1, som en av de mekanismer som regulerer vorinostat EMT. Det er ofte rapportert at TGF-β induserer EMT og chemoresistance [10]. Aktiverte type I-TGF-ß1-reseptorer fosforylere SMAD2 og SMAD3, som danner et heteromert kompleks med SMAD4 [41,42]. Dette komplekset translocates til kjernen og er rettet mot en rekke DNA-bindende proteiner for å regulere transkripsjons svar [41,42]. Dermed transcriptional regulatorer av CDH1 som Snai, ZEB, og TWIST, er oppregulert [42]. Deretter CDH1 downregulated og EMT oppstår [43,44]. Således inhibering nukleær translokasjon av SMAD2, SMAD3, og SMAD4 komplekser kunne regulere TGF-β1-relaterte EMT. Først undersøkte vi om vorinostat endrer mRNA uttrykk av disse SMADs ved QRT-PCR. Det ble ikke observert endringer i disse SMADs etter eksponering for vorinostat (S2 fig). Imidlertid har noen studier vist aneffect av HDAC hemmere på SMAD4 [22,23]. Kaimori et al. *
P
0,05. *
P
0,05.
