Abstract
Ved å bruke et uttrykk sekvens tag bioinformatiske algoritme, identifiserte vi at
Lin28 homolog B
(
Lin28B
) kan ha en onkoføtal uttrykk mønster som kan legge til rette for å oppdage kreftceller hos voksne. Det er også rapportert å være en mulig markør for kreft stamceller. Derfor søkte vi å verifisere onkoføtal-stemness tegnene
Lin28B Hotell og teste sitt potensial som en sirkulerende kreftstamcelleliknende markør hos voksne HCC pasienter.
Lin28B
mRNA ble undersøkt i et panel av fosterets vev, voksen vev og svulster.
Lin28B
ble over uttrykt eller slått ned i HepG2 celler til å vurdere sitt potensial som en stamcelleliknende markør. RT-qPCR for
Lin28B
ble utført i de perifere mononukleære blodceller fra pasienter med HCC mottar kirurgi (n = 96) og ikke-HCC kontroller (n = 60) og analysert dens klinisk betydning.
Lin28B
viste en onkoføtal uttrykk mønster. Dens overekspresjon kan oppregulere stemness markører (OCT4, Nanog og SOX2) og forbedre tumorsphere dannelse
in vitro
.
Lin28B
knockdown hatt motsatt effekt. Sirkulasjons
Lin28B
ble oppdaget i perifere mononukleære blodceller i 3 tilfeller (5%) av ikke-HCC kontroller og 32 tilfeller (33,3%) av HCC pasienter. I HCC pasienter, sirkulerende
Lin28B
var assosiert med høy tumor Karakter (P = 0,046), stor størrelse (P = 0,005), høy AJCC scenen (P = 0,044) og BCLC scenen (P = 0,017). Sirkulasjons
Lin28B
var signifikant assosiert med redusert tilbakefall overlevelse (P 0,001). Sirkulasjons
Lin28B
skilles tidlig stadium HCC inn i 2 tilbakefall frie overlevelseskurver (P = 0,003). I multivariat analyse, sirkulerende
Lin28B
var en uavhengig variabel i forbindelse med tidlig tilbakefall (P = 0,045) og tilbakefall tidlig stadium HCC (P = 0,006). I konklusjonen, onkoføtal genet
Lin28B
er en potensiell onkoføtal kreftstamcelleliknende sirkulerende tumorceller markør som korrelerer med HCC tilbakefall etter hepatectomy. Sirkulasjons
Lin28B
kunne avgrense tidlige AJCC stadier. Våre funn understøtter mulig bruk av en TNMC (C for sirkulerende tumorceller) staging systemet i HCC
relasjon:. Cheng S-W, Tsai H-W, Lin Y-J, Cheng P-N, Chang Y-C, yen C-J, et al. (2013)
Lin28B
Er en onkoføtal Sirkulasjons Cancer Stem Cell-Like Marker Associated med Tilbakefall av leverkreft. PLoS ONE 8 (11): e80053. doi: 10,1371 /journal.pone.0080053
Redaktør: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, USA
mottatt: 11 april 2013; Godkjent: 30 september 2013; Publisert: 14.11.2013
Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette var støttet av tilskuddet DOH101-TD-C-111-003 fra Department of Health, Taiwan, gi NSC 97-2320-B-006 -027 -MY3 og gi NSC-99-2628-B-006-034-MY2 fra National Science Council, Taiwan, og NCKUH stipend (95) nr 67 fra National Cheng Kung universitetssykehus, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en viktig årsak til kreft dødsfall i Taiwan, og en av de vanligste kreftformene i verden [1]. Derfor er det viktig å identifisere biomarkører for å forutsi utviklingen av HCC og klinisk resultat. Alfaføtoprotein (AFP) og glypican-3 er aktuelle tumormarkører for HCC. Begge tilhører onkoføtal gener som er definert som gener uttrykt i embryoene eller fostre, slått av eller undertrykt i voksen vev, men gjen uttrykt i tumorceller [2,3]. Onkoføtal gener /proteiner pleier å være gode tumor markører på grunn av lav bakgrunn uttrykk i de voksne. I en tidligere studie, brukte vi en kombinert bioinformatiske og eksperimentell tilnærming for å søke etter nye onkoføtal gener [4]. Vi kategorisert 6118 uttrykte sekvens tag (EST) bibliotekene inn i 3 grupper: umoden (n = 483), modne (n = 1724), og tumor (n = 3911). Ved å bruke de beregnede frekvenser av AFP-genet i hver gruppe som referanser for å sette grensene for bioinformatikk analyse, vi får identifisert 44 ukjente gener med potensielle onkoføtal uttrykk mønstre. Et av genene, LRRC16B ble ytterligere studert [4]. Resultatet støtter at dette bioinformatiske algoritmen kan hente ut onkoføtal gener med viktige funksjoner. Også til stede i våre genet listen var genet
Lin28 homolog B product: (
Lin28B
), som var ukjent på det tidspunktet. De beregnede frekvenser av
Lin28B
gen i biblioteker av umodne, modne, og tumor grupper var 22, 5 og 28, henholdsvis, med forhold mellom svulst og modne grupper (svulst /modne) beregnet til 5,6 (tabell S1 ).
De pattedyr homologer av lin-28,
Lin28 Hotell og
Lin28B
er mikroRNA bindende proteiner. De regulerer brev
7
ved binding til terminalen løkke av
la-7
familie miRNA forløpere og blokkere deres behandling i modne mirnas, noe som resulterer i derepresjon av
la-7
mål, for eksempel
K-ras
og
c-myc product: [5,6].
Lin 28
er sterkt uttrykt i befruktede egg og embryonale stamceller [7]. Det kan omprogrammere menneskelige somatiske fibroblaster til pluripotency ved samtidig uttrykt med
OCT4
,
Nanog Hotell og
SOX2 product: [8]. Dermed
Lin28
kan innebære i den embryonale utvikling og vedlikehold av embryonale stamceller. Som for
Lin28B
, det er i stand til å fremme celleproliferasjon og transformasjon, men dens funksjon i fosterutviklingen er fortsatt uklart [9-11].
Lin28B
ofte uttrykt i HCC og er assosiert med dårlig pasient prognose, sammenlignet med
Lin28 product: [9-13]. Siden
Lin28
er kjent for å være en markør for stamceller, spådde vi
Lin28B
er også knyttet til mobilnettet stemness og er potensielt en markør for kreftstamceller. En slik forestilling ble støttet av nyere publikasjoner som
Lin28B
ble vist å være assosiert med stemness av prostata og tykktarm kreft cellelinjer [14,15].
Revers transkripsjon kvantitativ real-time PCR (RT-qPCR) av Ficoll-separerte celler eller buffy coat er blitt anvendt for å detektere tumorcelle transkripsjon som et surrogat for å detektere sirkulerende tumorceller (CTCs) [16-20] . For å redusere bakgrunnsnivå og øke differensieringen strømstyrke, bør den ideelle markørene har lav sannsynlighet for å bli uttrykt i hvite blodceller eller endotelceller. Det ville være enda bedre hvis de ikke kommer til uttrykk i noen voksen vev i det hele tatt. Derfor i teorien bør onkoføtal-genene være gode tumormarkører i perifere blodprøver. Siden
Lin28B
er kandidat onkoføtal gen som er muligens knyttet til stamcelle fenotyper, er det en potensiell surrogat svulst markør for å oppdage sirkulerende kreftstamceller som har vist seg å ha svært prediktiv verdi for kreft tilbakefall og metastase [ ,,,0],21,22].
Derfor hensikten med denne studien var å verifisere den doble onkoføtal og kreft-stamcelle karakteristikker av
Lin28B Hotell og å evaluere klinisk betydning når oppdages i sirkulerende celler i HCC pasienter. Hypotesen testet var som sirkulerer
Lin28B
påvist i perifere mononukleære blodceller er en onkoføtal-kreft-stamcellelignende markør assosiert med tilbakefall eller dårligere overlevelsen i HCC.
Materialer og Metoder
tumorcellelinjer
De cellelinjer brukt i denne studien var menneskelig lever (Huh-7, HepG2 og PLS /PRF /5), eggstokkene (PA-en, TOV-21G, SK-OV -3, BG-1, NIH: OVCAR-3, og ES-2), nyre- (786-O og ACHN), blære (T24 og TSGH-8301), bryst (MCF-7), pulmonal (A549), og kolon (SW480) kreft cellelinjer. Huh-7 ble hentet fra JCRB. HepG2, PLC /PRF /5, PA-en, TOV-21G, NIH: OVCAR-3, ES-2, MCF-7, SW480, T24 og TSGH-8301 ble hentet fra BCRC. A549 ble oppnådd fra ATCC. SK-OV-3 og BG-en var en slags gave fra Prof. Tzu-Hao Wang [23]. 786-O og ACHN var en slags gave fra Prof. Yeong-Shiau Pu [24]. A549, NIH: OVCAR-3, SK-OV-3, og BG-en ble opprettholdt i DMEM /F12. T24, TSGH-8301, Huh-7, HepG2, MCF-7 og SW480 ble opprettholdt i DMEM. 786-O og ACHN ble opprettholdt i RPMI1640. PLC /PRF /5 og PA-en ble opprettholdt i MEM. ES-2 ble opprettholdt i McCoys 5a. TOV-21G ble opprettholdt i MCDB105 og M199 (1: 1). Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) under 5% CO2 ved 37 ° C.
cDNA-biblioteker og sammenkoblet tumor og ikke-tumor vevsprøver
De foster cDNA bibliotekene kjøpt fra BioChain (Hayward, CA, USA) ble sammenlignet med normale menneskelige voksne cDNA bibliotek kjøpt fra Clontech (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ). Sammenkoblet svulst og ikke-tumor vev fra ulike organer ble samlet fra pasienter innlagt for operasjon i National Cheng Kung universitetssykehus, Tainan, Taiwan.
magnetisk cellesortering for å berike EpCAM + -celler
EpCAM-positive PLC /PRF /5, Huh-7, og HepG2-celler ble isolert ved magnetisk cellesortering (MCS) ved hjelp av monodispergerte magnetiserbare partikler ifølge produsentens instruksjoner (CELLection
TM Pan Mouse IgG kit) ved hjelp av anti-EpCAM antistoff (Epitomics, Burlingame, CA). EpCAM
+ og EpCAM
– PLC /PRF /5, Huh-7 og HepG2 cellene ble lysert for vestlige blot analyser
Retroviral Infeksjon
Vi brukte en retrovial system til. uttrykker
Lin28B
i HCC cellelinjer. pMSCVpuro (BD Clontech), pMSCV-LIN28B og pSUPERretro vektorer ble ko-transfektert inn i GP2-293T pakke celler med VSV-G-plasmider ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden i 48 timer. HepG2 celle ble sådd ut i 1 x 10
6-celler per brønn i en 6-cm plate og inkubert over natten under 5% CO
2 ved 37 ° C. Retroviral supernatant ble tilsatt med 8 ng /ml polybrene (Sigma, St. Louis, MO, USA), og brukes til å infisere HepG2 celle. Samlede HepG2 cellepopulasjon som uttrykker enten pMSCVpuro eller pMSCV-LIN28B ble valgt med 0.7μg /ml puromycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
shRNA lentivirus produksjon
Vi brukte en lentiviral shRNA system for å slå ned
Lin28B
i HCC cellelinjer. pLKO.1 plasmider uttrykker liten hårnål RNA (shRNA) ble kjøpt fra National RNAi Kjerne Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwan). Lentivirus partikler ble hentet fra RNAi Core, forskningssenteret for klinisk medisin, National Cheng Kung universitetssykehus. Å slå ned Lin28B uttrykk, shRNA av
Lin28B plakater (TRCN0000219860, målrette sekvens: 5’CATAACAGGTCTTCTTCATAT-3 «) ble vedtatt. Et plasmid pLKO_TRC005 ble anvendt som den negative kontroll.
Western blotting
oppsamlede celler ble oppløst ved lyseringsbuffer (Complete Lysis M EDTA-fri, Roche) på is og deretter sentrifugert ved 10 000 xg, 4 ° C i 20 minutter. Deretter, 100 ug protein ble lastet og separert ved 12% SDS-PAGE, og overført til en polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Lavere mengde protein (40μg) ble lastet inn i det magnetiske cellesorteringsanalyse på grunn av lavere totale celleantall oppsamlet. Primære antistoffer inkludert kanin anti-Lin28B (Cell signale teknologi), mus anti-OCT4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin anti-Nanog (Epitomics, Burlingame, CA), kanin anti-SOX2 (Epitomics, Burlingame, CA ), kanin-anti-EpCAM (Epitomics, Burlingame, CA) og muse anti-β-aktin (Millipore).
Sphere-analysen
Sphere-analysen ble utført som tidligere beskrevet [25]. Kort sagt ble HepG2 celler sådd ut på ubelagte 6-brønners kulturplater (BD Laboratorium, Bedford, MA) i DMEM /F-12 serumfritt medium (caisson) inneholdt 1% MEM NEAA, 1X N2, 20 ng /ml EGF, 10 ng /ml bFGF, 100 ug /ml penicillin G og 100 U /ml streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY). Etter 9 dagers kultur, ble brønnene undersøkt under et invertert mikroskop ved forstørrelse x20, og det antall av kuler av . 50 pm i diameter ble tellet under et lysmikroskop
Pasienter prøver og kliniske data
Etthundreognitten pasienter som hadde primær HCC gikk hepatectomy ved National Cheng Kung universitetssykehus fra januar 2006 til desember 2011, ble inkludert. Pre-kirurgi hele blodprøver ble sendt til perifert blod mononukleære cellesamling. Pasienter med en tidligere diagnose av kreft, fjernmetastaser før hepatectomy, positive kirurgiske marginer, ble diagnosen kombinert hepatocellur-kolangiokarsinom (CHC), eller dårlig prøve RNA kvalitet ekskludert. Ti pasienter ble ekskludert på grunn av en positiv kirurgisk margin eller en diagnose av CHC og 13 pasienter ble ekskludert på grunn av dårlig prøve RNA kvalitet. De resterende 96 pasienter ble inkludert for videre studier (figur S1). Oppfølgingen intervallet var hver 3. måned. Tilbakefall av HCC ble dokumentert på typiske funn av computertomografi eller magnetisk resonans imaging med eller uten forhøyet serum AFP nivå eller patologisk bekreftelse. Tilbakefall overlevelse (RFS) ble definert som tiden fra kirurgi til første forekomst av enten lokalt eller fjernmetastaser. Sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) ble definert som tiden fra kirurgi til HCC relaterte dødsfall. Forsøkspersonene ble sensurert i siste oppfølging avtale eller ved død uten tilbakefall. Pasienten profiler av 96 HCC pasienter ble vist i Tabell S2. Median varighet av oppfølgingen var 19,7 måneder (range, 0.1-41.5 måneder). Førti pasienter (41,7%) hadde tilbakevendende HCC (median varighet inntil tilbakefall, 7 måneder, utvalg, 1.5-31.6 måneder), inkludert lokale tilbakefall hos 32 pasienter, metastaser hos 5 pasienter, og både lokale tilbakefall og metastasering i 3 pasienter. Ti pasienter (10,4%) døde av HCC (median overlevelse, 13,8 måneder, utvalg, 1.6-21.9 måneder). For sammenligning ble 60 individer uten HCC (non-HCC gruppe) også inkluderes: 31 friske individer uten en leversykdom og 29 pasienter med viral hepatitt, inkludert 8 pasienter med cirrhose (16 HBV og HCV 13). Gjennomsnittsalderen på de friske individer uten leversykdom var 44,1 år (fra 20-75 år, 10 menn og 21 kvinner), og av pasienter med hepatitt var 49,4 år (range, 24-67 år, 20 menn og 9 kvinner ).
Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient og studieprotokollen dannet de etiske retningslinjene i 1975 Helsinkideklarasjonen som gjenspeiles i en priori godkjenning av human Eksperimenter og etikkomiteen av National Cheng Kung universitet Hospital i Tainan, Taiwan.
tilleggs~~POS=TRUNC blodprøve forberedelse
Hele blodprøver ble samlet inn i 10 ml pyrogenfrie rør som inneholder 0,12 ml K
3EDTA 15% (BD Vacutainer K
3EDTA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) og deretter lagvis på like volumer av Ficoll-Hypaque-tetthetsgradient (Histopaque-1077; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). Perifere blod mononukleære celler ble gjenvunnet fra den interfase. Cellepelletene ble vasket og oppsamlet for etterfølgende RNA-ekstraksjon.
RNA-ekstraksjon
Total RNA fra primære vev og cellelinjer ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA av blodprøver ble ekstrahert ved bruk av et kit (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen). I henhold til produsentens protokoller
revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og revers transkripsjon kvantitativ real-time PCR ( RT-qPCR)
2 mikrogram RNA ble omvendt transkribert ved hjelp av Super II (Invitrogen, Grand Island, New York). De semikvantitative RT-PCR-primer sekvenser ble vist i Tabell S3.
β-actin
ble anvendt som en intern kontroll-genet i RT-PCR. Den cDNA ble underkastet RT-qPCR ved hjelp av et system LightCycler (Roche, Mannheim, Tyskland). For RT-qPCR i forskjellige foster og normal voksen organer og blodprøver, nivåene av
Lin28B
ble normalisert til
GAPDH
som har vært brukt som en referanse-genet i påvisning av sirkulerende tumorceller [19 , 26]. For lever og HCC vevsprøver, nivåene av
Lin28B
ble normalisert til
tyrosin 3-monooksygenase /tryptofan 5-monooksygenase aktivering protein, zeta polypeptid product: (
PLA
) i stedet av
GAPDH
fordi det var et bredt spekter av variasjon i uttrykket nivåer av
GAPDH
blant prøvene leveren og HCC vev.
PLA
hadde en middels uttrykk nivå i levervev [27] og dens uttrykk nivåer var mer stabil blant HCC vevsprøver. Både RT-qPCR primere og prober ble kjøpt (Applied Biosystems, sekvenser ikke vist) eller syntetisert som designet av LightCycler Probe Design Software 2.0. Begge de fluorescerende TaqMan prober og de utformede forsterkning primersekvensene er oppført i tabell S4. Hver standardkurve ble beregnet med serielle fortynninger (10
0-10
6 eksemplarer) av plasmidtemplater. Terskelen syklus (Ct) av prøvene ble omdannet til kopiantallet av mRNA ved bruk av standardkurver avledet fra seriefortynninger av konstruksjoner av
Lin28B
og
GAPDH
, respektivt. Nukleinsyre ekstrahert fra HepG2-celler ble anvendt som en positiv kontroll. En negativ kontroll i hvilken mal total-RNA ble erstattet med sterilt vann var inkludert. Den dynamiske spekteret av RT-qPCR for
Lin28B
var 10-10
6 kopier av plasmidtemplater (Figur S2). En Ct-verdi som er mindre enn 38 og større enn null indikerer positivt uttrykk for
Lin28B
gen, mens en Ct-verdien er lik eller større enn 38 eller ingen Ct-verdien angir negative uttrykk for
Lin28B
genet.
Statistisk analyse
Forskjellen i tumorsphere dannelse mellom
Lin28B
-expressing og -knockdown cellelinjer ble testet for signifikans ved hjelp av studentens
t
-test.
Lin28B
mRNA uttrykk i perifert blod ble sammenlignet mellom grupper med Wilcoxon rank sum test og ble korrelert med clinicopathological indikatorer ved hjelp av khikvadrattest eller Fishers eksakte test. Overlevelseskurver og sannsynligheter ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og den log-rank test ble benyttet for å vurdere betydningen av forskjell mellom gruppene. En leave-one-out kryssvalidering ble benyttet for å bestemme en cutoff verdi knyttet til overlevelse. Univariat og multivariat Cox regresjonsmodell ble brukt til å bestemme betydningen av ulike prognostiske faktorer. De multivariate analysene ble justert samtidig for alder, kjønn, type virusinfeksjon, skrumplever, tumor klasse, status for multifokale svulster, satellitt knuter, vaskulær invasjon, tumorstørrelse,
American
Joint
komiteen
Kreft plakater (AJCC syvende utgave) scenen Barcelona-Clinic leverkreft (BCLC) scenen og serum AFP. Statistisk signifikans ble satt til
P
0,05. Analysen av perifere blodprøver fra 96 pasienter vil ha 80% strøm til å oppdage en hasardratio på 2,2 mellom
Lin28B product: (+) og
Lin28B product: (-) HCC pasienter. Den proporsjonale farer forutsetningene ble sjekket av Martingale og avvik diagnostiske plott og ingen signifikant avvik fra forutsetningene i proporsjonal fare regresjonsmodellen eksisterte.
Resultater
De onkoføtal kjennetegn Lin28B
for å teste om
Lin28B
er en onkoføtal genet, dens uttrykk ble undersøkt i et panel av menneskelig total RNA (Master Panel II, BD Clontech) ved hjelp av RT-PCR (figur 1A).
Lin28B
ble uttrykt i fosterets hjerne, fosterets lever, normal voksen morkaken, testis, hjerne og ryggmarg. Det ble ikke uttrykt i andre voksne vev. Endringen av uttrykk fra foster til voksen vev ble kvantifisert ved RT-qPCR ved hjelp av total RNA valgt fra human fetal normalt vev (BioChain) og vev paneler (Figur 1b) Master Panel II (BD Clontech).
Lin28B
ble uttrykt i føtale organer, men ble betydelig nedregulert i sine voksne kolleger, bortsett fra hjernen.
A, RT-PCR viste at
Lin28B
ble uttrykt i føtal hjerne og lever og i voksne testikler, hjerne, ryggmarg og placenta. Det ble ikke påvist i andre voksne vev. B, RT-qPCR viste at
Lin28B
ble markert downregulated fra foster (lukket bar) til voksen (åpen bar) vev unntatt for hjernen. C, RT-qPCR ble utført ved hjelp av par av HCC (lukket bar) og ikke-tumor (åpen bar) leveren vev. Overekspresjon av
Lin28B plakater ( 100 ×) ble observert i 8 HCC prøver (53,3%). NC, negativ kontroll; PC, positiv kontroll.
For screening mulig
Lin28B
uttrykk i ulike tumortyper, RT-PCR ble utført i ulike humane kreftcellelinjer.
Lin28B
kunne påvises i eggstokkene, lever, og kolorektal kreft cellelinjer (Figur S3). For å undersøke dens uttrykk i tumorer, ble RT-PCR utføres på fem tilfeller av sammenkoblede svulst og ikke-tumorvev fra 5 typer vanlige krefttyper (figur S4).
Lin28B
ble overuttrykt i noen av tumorene fra bryst (1/5), livmor (1/5), lunge (4/5), lever (1/5), og eggstokk (1/5) , men ble uttrykt ved svært lave nivåer i den ikke-tumorvevet. RT-qPCR for
Lin28B
uttrykk ble videre utført på 15 HCC svulst og ikke-tumor vev par (figur 1C). Over-uttrykk for
Lin28B plakater ( 100 ×) ble observert hos 8 tumor vevsprøver (53,3%). Disse resultatene bekreftet onkoføtal natur
Lin28B
. To ikke-tumorlever vevsprøver (13%) viste liten grad av
Lin28B
uttrykk. Mikroskopisk, en av disse to prøvene viste cirrhose med fokal stor celle endring og den andre viste kronisk hepatitt med mild grensesnitt aktivitet. De histologiske funn viste ingen åpenbar forskjell fra de av de 13 ikke-tumor leveren vevsprøver uten
Lin28B
uttrykk, der syv tilfeller viste skrumplever og 6 tilfeller viste kronisk hepatitt med grensesnitt aktivitet. Fire tilfeller viste stor celle forandring og ett tilfelle viste liten endring celle.
Forhøyet ekspresjon av Lin28B i EpCAM-anriket stamcelle-lignende populasjon
EpCAM er en overflatemarkør som ble rapportert å være i stand å berike leverstamcelleliknende befolkningen [28]. Derfor, for å undersøke om
Lin28B
er uttrykt i kreftstamceller, vi utførte magnetisk cellesortering (MCS) for å skille HCC cellelinjer inn EpCAM
+ og EpCAM
– populasjoner. Proteininnholdet av Lin28B ble økt i EpCAM
+ PLC /PRF /5 celler og Huh-7 celler (figur 2A, øvre panel), sammen med økte nivåer av stamcellemarkører, SOX2, Nanog og OCT4 i PLC /PRF /5 celler og SOX2 og OCT4 i Huh-7 celler (figur 2A, nedre panel). I motsetning til dette ble EpCAM-fangst ikke berike den stamcellelignende populasjon i HepG2-celler, siden det var ingen forskjell av SOX2, Nanog, eller OCT4 uttrykk mellom EpCAM
+ og EpCAM
– HepG2-celler (figur 2A, nedre panel). Lin28B viste heller ingen forskjell mellom disse to populasjonene (figur 2A, øvre panel). Til sammen våre funn støttet oppfatningen at Lin28B er uttrykt i kreftstamcelleliknende subpopulasjoner.
Western blot analyser viste at Lin28B ble overuttrykt i fanget EpCAM
+ PLC /PRF /5 celler og Huh- 7 celler, men ikke i EpCAM
+ HepG2 celler (A, øvre panel). EpCAM
+ PLC /PRF /5 celler viste forhøyede nivåer av SOX2, Nanog og OCT4; EpCAM
+ Huh-7 celler, SOX2 og OCT4; men EpCAM
+ HepG2 celler, ingen (A, nedre panel). Lin28B-pMSCV HepG2cells viste økt nivå av OCT4, Nanog, SOX2 og EpCAM i western blot (B) og dannet flere kuler enn vektorkontrollceller (P = 0,032) (C). sh-Lin28B HepG2 celler viste redusert nivå av OCT4, Nanog, SOX2 og EpCAM i western blot (D) og tendens til å danne færre kuler enn vektorkontrollceller (P = 0,059) (E). sh-Lin28B PLC /PRF /5-celler og Huh-7 celler også redusere ekspresjon av stamcellemarkører (F). Lavere mengde protein (40μg) ble lagt i MCS analysen enn at (100 ug) lagt i
Lin28B
-overexpression analysen på grunn av lavere total celle nummer samles i MCS analysen. Forskjellige virale systemer ble brukt i forsøkene: retrovirus i
Lin28B
over-uttrykk analyse og lentivirus i
Lin28B
knock-down analysen. Cellevekst var tregere når infisert med lentivirus. MCS, magnetisk cellesortering. Scale bar i C og E, 50 mikrometer.
Økt in vitro stemness med Lin28B overekspresjon
Fordi EpCAM ikke kunne berike
Lin28B
-expressing demme celle- som befolkningen i HepG2 celler, etablerte vi en
Lin28B
-overexpression HepG2 stabil pool av retrovirusinfeksjon å undersøke effekten av Lin28B på stamcelleliknende fenotyper. Representative stamcellemarkører ble analysert ved Western blotting. I forhold til vektor kontroll, Lin28B overekspresjon oppregulert stamcellemarkører: SOX2, Nanog, og EpCAM. En mild økning på OCT4 ble også observert (figur 2B).
For å bestemme effekten av
Lin28B
på tumor sfære-dannelse, både
Lin28B
-expressing og kontrollceller ble dyrket i suspensjon for å generere sfærer som en indikator på en kreft stilk-lignende eiendom
in vitro product: [25,29,30]. Som vist i figur 2C,
Lin28B
-expressing HepG2 celler viste en økt tumorsphere dannende evne sammenlignet med vektorkontrollcellene (P = 0.032).
Tvert imot, banket ned
Lin28B
i HepG2-cellelinje downregulated ekspresjonen av OCT4, Nanog, SOX2 og EpCAM (figur 2D) og en tendens til å redusere tumorsphere formasjon (P = 0,059) (figur 2E). Videre slå ned
Lin28B
i PLS /PRF /5 celler og Huh-7 celler også downregulated uttrykk for stamcellemarkører (figur 2F).
Påvisning av Lin28B mRNA i det perifere blodceller fra pasienter med HCC
RT-qPCR ble brukt for å undersøke ekspresjon av
Lin28B
i perifert blod sirkulerende celler. Reaksjonen var lineær 10-10
6 kopier av renset plasmid-maler (figur S2). Ekspresjonen av
Lin28B
kunne påvises når man HepG2 cellen ble slått sammen med 10
7 leukocytter i omtrent 3 ml av helt blod (fig S5). På denne basen,
Lin28B
mRNA ble oppdaget i 3 tilfeller (5%) av ikke-HCC kontroller (1 i sunn gruppe og 2 i hepatitt gruppe) og i 32 tilfeller (33,3%) av HCC gruppen (Figur 3A). Utvalget av Ct var 30,57 til 37,94 for de positive prøvene.
Lin28B
ble uttrykt i 3 tilfeller (5%) i de ikke-HCC kontroller (1 i sunn gruppe og 2 i hepatitt gruppe) og i 32 tilfeller (33,3%) i HCC gruppen. (Bar: gjennomsnitt, svart prikk: undetectable) (A). Pasienter med residiverende HCC hadde signifikant høyere uttrykk nivåer av
Lin28B
enn pasienter uten tilbakevendende HCC. (P 0,001). (Bar: gjennomsnitt, svart prikk: undetectable) (B). Kaplan-Meier analyse viste at
Lin28B
var signifikant assosiert med redusert tilbakefall overlevelse (P 0,001) (C). Forhold av
Lin28B Twitter /
GAPDH
mRNA høyere enn 10
-3 tendens til å assosiere med sykdomsspesifikk overlevelse (P = 0,094) (D).
Lin28B
var signifikant assosiert med redusert tilbakefall overlevelse i AJCC stadium I-II pasienter (p = 0,003) (E), men ikke i AJCC stadium IIIA-IVA pasienter (p = 0,419) (F).
Lin28B
var signifikant assosiert med redusert tilbakefall overlevelse i AJCC stadium I (P = 0,030) (G) og stadium II (P = 0,030) av pasientene (H).
pasienter med residiverende HCC hadde signifikant høyere uttrykk nivåer av
Lin28B
enn de uten tilbakefall (P 0,001) (figur 3B). Uttrykket av
Lin28B
i sirkulerende celler var signifikant assosiert med ikke-levercirrhose (P = 0,021), høy tumor Karakter (P = 0,046), stor svulst størrelse (P = 0,005), høy AJCC scenen (P = 0,044) og BCLC trinnet (P = 0,017) (tabell 1). Nivået av sirkulerende Lin28B hadde en signifikant sammenheng med høy BCLC trinn (trinn B til C sykdommer versus A1 til A4 sykdommer) (P = 0,022) (figur S6a) og hadde et grense betydning i forbindelse med høy AJCC stadium (trinn IIIC til IVA sykdommer versus jeg til IIIB sykdommer) (P = 0,066) (figur S6B). Kaplan-Meier analyse viste at sirkulerende
Lin28B
var signifikant assosiert med redusert RFS (P 0,001) (Figur 3C). Uttrykket av
Lin28B
i sirkulerende celler ble ikke signifikant assosiert med redusert DSS (P = 0,140). Ved hjelp av en la-en-out kryssvalidering fremgangsmåte, forholdet av
Lin28B /GAPDH mRNA
høyere enn 10
-3 (n = 15) en tendens til å være forbundet med redusert DSS (P = 0,094) ( Figur 3D).
Faktorer
Gruppe
Lin28B product: (-) (%)
Lin28B product: (+) (%)
P
-verdi
Age 60 år old35 (70) 15 (30) 0.470≥60 år old29 (63) 17 (37) SexMale46 (67) 23 (33) 1.000Female18 (67) 9 (33) Virus infectionNone10 (83) 2 (17) 0.551HBV34 (61) 22 (39) HCV16 (67) 8 (33) HBV + HCV4 (100) 0 (0) CirrhosisAbsent28 (56) 22 (44) 0.021
* Present36 ( 78) 10 (22) Tumor grade1-255 (71) 22 (29) 0,046
* 39 (47) 10 (53) multifokal tumorsAbsent53 (65) 28 (35) 0.551Present11 (73) 4 (27) Satellite noduleAbsent51 (67) 25 (33) 0.859Present13 (65) 7 (35) Tumor størrelse 5 cm45 (78) 13 (22) 0,005
* ≥ 5 cm19 (50) 19 (50) Vaskulær invasionAbsent35 (71) 14 (29) 0.312Present29 (62) 18 (38) AJCC stageI, II, HIA, IIIB62 (70) 27 (30) 0,044
* IIIC, IVA2 (29) 5 (71) BCLC stageA1-Smart A441 (77) 12 (23) 0,017
* B-C23 (53) 20 (47) Serum AFP nivåer 50 ng /ml44 (73) 16 (27) 0.074≥ 50 ng /ml20 (56) 16 (44) Tabell 1. Korrelasjon av sirkulerende
Lin28B
testresultater med clinicopathological indikatorer på leverkreft. Product: * P 0,05. Tumor klasse ved Edmondson og Steiner karakterskala. AJCC, amerikanske Joint Committee on Cancer 2010; BCLC, Barcelona-Clinic leverkreft; AFP, alfaføtoprotein. CSV Last ned CSV
Univariat analyse viste at svulsten Karakter (P = 0,047), vaskulær invasjon (P = 0,038), AJCC scenen (P 0,001), BCLC scenen (P = 0,030) og sirkulerende
Lin28B
(p = 0,001) var signifikant assosiert med redusert RFS (tabell 2). I multivariatmodell, cirrhose (P = 0,043), AJCC stadium (P = 0,001) og sirkulasjons
Lin28B plakater (p = 0,047) var uavhengige variabler knyttet til redusert RFS (tabell 2). Tumor Karakter (P = 0,035), AJCC scenen (P 0,001), serum AFP (P = 0,014) og sirkulerende
Lin28B product: (P = 0,001) var signifikant assosiert med tidlig tilbakefall mindre enn ett år i univariate modell (tabell 3). AJCC scenen (P = 0.004) og sirkulerende
Lin28B product: (P = 0.045) var signifikant assosiert med tidlig tilbakefall mindre enn ett år i den multivariate modellen (tabell 3). Som for DSS, satellitt nodule (P = 0,047) og AJCC scenen (P = 0,046) var uavhengige variable i multivariat analyse (tabell S5). Men
Lin28B /GAPDH
mRNA høyere enn 10
-3 var ikke et selvstendig parameter i DSS. years0.647(0.341-1.227)0.1820.470(0.218-1.016)0.055SexMale/female0.763(0.371-1.569)0.4620.970(0.439-2.140)0.939Viral /Both1.313(0.118-14.566)3.121(0.201-48.354)Cirrhosis-/+0.717(0.382-1.344)0.2990.419(0.181-0.971)0.043
*Tumor stage 0.001
*0.001
*I/II~IIIB3.421(1.396-8.385)4.929(1.293-18.785)I/IIIC~IVA36.35(3.731-353.236)50.281(4.202-601.720)BCLC stage0.030
*0.085A1/A2-A42.986(1.209-7.374)3.632(1.073-12.288)A1/B-C2.361(1.124-4.961)3.320(0.730-15.110)Serum ng/ml1.642(0.876-3.076)0.1220.778(0.323-1.873)0.575Lin28B-/+2.918(1.559-5.463)0.001
*2.248(1.012-4.995)0.047
*Table 0,05. years0.616(0.293-1.295)0.2010.479(0.189-1.215)0.121SexMale/female0.570(0.233-1.396)0.2190.742(0.276-2.000)0.556Viral /Both1.152(0.104-12.724)2.777(0.156-49.508)Cirrhosis-/+0.576(0.104-12.724)0.1470.437(0.153-1.250)0.123Tumor stage 0.001
*0.004
*I/II~IIIB3.782(1.521-9.405)4.040(0.948-17.221)I/IIIC~IVA37.631(3.860-366.894)47.592(3.692-613.500) stage0.0630.304A1/A2-A42.015(0.639-6.351)2.532(0.606-10.582)A1/B-C2.856(1.190-6.850)2.787(0.536-14.502)Serum ng/ml2.457(1.198-5.038)0.014
*0.964(0.344-2.698)0.944Lin28B-/+3.637(1.749-7.563)0.001
*2.649(1.022-6.862)0.045
*Table 0,05. β-actin ble den interne kontrollen.
