Abstract
Den store størrelsen på grisen og dens likhet i anatomi, fysiologi, metabolisme og genetikk til mennesker gjør det til en ideell plattform for å utvikle en genetisk definert, store dyremodell av kreft. For å oppnå dette har vi opprettet en transgen «oncopig» linjen koding ere rekombinase induserbare svin transgener som koder KRAS
G12D og TP53
R167H, som representerer en vanlig mutert onkogen og tumor suppressor i humane kreftformer, henholdsvis. Behandling av celler avledet fra disse oncopigs med adenovirus koding Cre (AdCre) førte til KRAS
G12D og TP53
R167H uttrykk, som gjengitt cellene transformert i kultur og tumorigent når innpodet i immunkompromitterte mus. Til slutt, injeksjon av AdCre direkte inn i disse oncopigs førte til en rask og reproduserbar tumorutvikling av mesenchymale opprinnelse. Transgene dyr som fikk AdGFP (grønt fluorescerende protein) ikke har noen svulst masse dannelse eller endret histopatologi. Dette oncopig linje kan således tjene som en genetisk formbare modell for potensielt et bredt spektrum av kreftformer, mens kontrollere for tidsmessig eller romlig genese, noe som skal vise seg å være uvurderlig til studier som tidligere hindret av mangelen på en stor dyremodell av kreft.
Citation: Schook LB, Collares TV, Hu W, Liang Y, Rodrigues FM, Rund LA, et al. (2015) En genetisk svinekjøtt Model of Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0128864. doi: 10,1371 /journal.pone.0128864
Academic Redaktør: Wilfried A. Kues, Friedrich-Loeffler-instituttet, TYSKLAND
mottatt: 15 desember 2014; Godkjent: 03.05.2015; Publisert: 01.07.2015
Copyright: © 2015 Schook et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir- og fulle RNA-seq data er tilgjengelige i ArrayExpress database (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) under deponeringsnummer E-mtab-3382
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av følgende: China Scholarship Council (CSC): WH; Brasilianske Scholarship Program «Science Without Borders» forfremmet av National Counsel av teknologisk og vitenskapelig utvikling (https://www.iie.org/Programs/Brazil-Scientific-Mobility): FMR, TVC og FKS; American Cancer Society (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): YL; American Cancer Society (https://www.cancer.org/research/applyforaresearchgrant/) (ACS178898): CMC; US National Institutes of Health (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm) (CA123031) og Edward Spiegel fond i Lymphoma Foundation (https://www.lymphomafoundation.org/): CMC; United States Department of Agriculture (USDA) (https://www.csrees.usda.gov/) (AG 58-5438-2-307), The US National Institutes of Health (https://grants.nih.gov/tilskudd /oer.htm) (CA 153 132), Edward William Jane Marr Gutgsell Foundation (https://provost.illinois.edu/about/chairs.html), og Cooperative Research Program for Landbruk Science Technology Development (https://www.csrees.usda.gov/)(PJ009103); Rural Development Administration, Republikken Korea (https://www.rda.go.kr/foreign/eng/): LBS; og US National Institutes of Health (U42 OD011140): RSP. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En stor dyremodell av kreft ville være fordelaktig i miljøer som krever størrelse, anatomi, metabolisme eller genetikk reflekterende av mennesker, slik som for studier av ikke-invasiv bildestyrt teknologier, stråling, legemiddelmetabolisme, kirurgiske trening, teknologisk utvikling (for eksempel, tidlig deteksjon screening), for å nevne bare noen få [1,2]. I denne forbindelse er det gris et ideelt stort dyr plattform for å utvikle en slik modell. Disse er store pattedyr med lignende anatomi på mennesker [1,2]. Både deres basal metabolic rate og deres xenosensor pregnan X reseptor som regulerer
CYP3A
uttrykk, som er ansvarlig for metabolismen av halvparten av alle reseptbelagte legemidler [3], er også svært lik mennesker [4,5]. Som mennesker, griser også kreve flere genetiske endringer for å utvikle kreft [6].
Å utvikle et svin modell av kreft, valgte vi å rekapitulere de mutasjoner oftest funnet i menneskelig kreft. Tidligere hadde vi vist at menneskelig mutasjoner når gitt i genuttrykk studier med autologe svin fibroblaster resulterte i onkogener molekylært lignende den som ble observert hos mennesker og med tilsvarende patologi [6]. I denne studien har vi målrettet
RAS
gen som er mutert i en fjerdedel av alle menneskelige krefttyper, med
KRAS
isoform å være den mest muterte [7] gir en konstitutivt aktiv, onkogent protein [7] som eksperimentelt induserer kreft hos mus [8] og humane celler [9], i tillegg til underliggende en rekke arvelige cancersyndromer [10]. Genet
TP53
er mutert i en tredjedel av kreft hos mennesker [11] for å slå denne svulsten undertrykkende vei, som på samme måte er kjent for å fremme kreft hos både mus [12] og svin [13] genetiske modeller samt i humane celler [9], og er assosiert med kreft predisposisjon Li-Fraumeni syndrom [14]. Mutasjoner i disse to genene opptrer i konsert i humane kreftformer (COSMIC) [15]. Videre mus genmodifisert for å gjennomgå rekombinasjon å konvertere sine villtype
Kras Hotell og
TP53
alleler til onkogene og dominant-negative eller null versjoner, henholdsvis raskt utvikle aggressiv kreft på nettstedene til rekombinasjon [16,17]. Med hensyn til griser, både onkogene
Kras Hotell og dominant-negative
p53
bidra til å fremme tumorigent konvertering av normale svin celler til tumorigent tilstand [6], og griser konstruert med en mutant TP53 allel er utsatt for å utvikle lymfomer og osteogene tumorer [13]. I det siste har en betinget aktivert onkogene KRAS mutasjon hos gris rapportert [18]. Som sådan, valgte vi å konstruere griser med induserbar uttrykk for disse ofte muterte og potente onkogen og tumor suppressor gener.
Resultater
Opprettelse av oncopigs koder induserbare onkogene KRAS og dominant-negative TP53
for å opprette en induserbar svin modell av kreft, som vi kaller «oncopig», må vi først klonet svin
KRAS Hotell og
TP53
cDNA fra Duroc (2-14, TJ Tabasco) som ble brukt for å sekvensere piggen genomet [19]. Seterettet mutagenese ble så brukt til å introdusere den onkogene G12D mutasjonen inn i svin
KRAS
cDNA. Denne mutasjonen ble valgt som en asparaginsyre substitusjons står for over en tredjedel av mutasjonene på G12 posisjon i kreft hos mennesker [7] og innføring av denne mutasjonen i den endogene muse
Kras
genet fremmer tumorigenesis [8,20] . På lignende måte ble det R167H mutasjon valgt som det humane ekvivalent (R175H) er ofte funnet i humane cancere [11], så vel som kreft predisposisjon Li-Fraumeni syndrom [14], og når det innføres i den endogene murin [12] eller porcint [ ,,,0],13]
TP53
genet, induserer svulster. Disse to cDNA ble deretter innført i en Cre-induserbar vektor, noe som ga et uttrykk konstruksjon inneholdende CAG promoteren, etterfulgt av den nevnte sekvens LSL,
KRAS
G12D
, en IRES-sekvens for å tillate bicistronisk uttrykk,
TP53
R167H Hotell og en poly en sekvens (fig 1a). Dette designet gjør for co-uttrykk for både
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
i forbilledlig noen celler av gris av forbigående infeksjon med AdCre, som i prinsippet bør tillate induksjon av et bredt spekter av kreft i bestemte vev områder og på hvilken som helst tidspunkt.
(
en
) Skjematisk fremstilling av vektor koding Cre-induserbar
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
. (
b
) PCR-analyse for tilstedeværelsen av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
i genomisk DNA isolert fra angitte klonet avkom.
Normal svin embryonale fibroblaster [21] ble transfektert med ovennevnte plasmid og stabilt transfektert cellekloner valgt i G418-supplert medium. Genomisk DNA fra cellekolonier ble brukt til å bekrefte tilstedeværelse av både transgener (
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
) ved PCR ble analysert ved anvendelse av primere spesifikke for disse transkriptene, og ble deretter ekspandert for kilden til kjerner for kjerneoverføring. Nuclei fra disse cellene ble deretter isolert og overført til utskrapte svin oocytter og embryogenese aktivert, en prosess kalt somatisk cellekjerneoverføring (SCNT) [21]. Totalt 100 slike embryoer ble overført til en surrogat purke, som ga fire mannlige oncopig avkom (63-1, 63-2, 63-3, 63-4). PCR-analyse av isolerte genomiske DNA ved hjelp av primere spesifikke for disse transgener bekreftet stabil integrering av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
cDNA (fig 1b).
Cre aktivering av
KRAS
G12D Hotell og
TP53R167H
transgener i fibroblaster avledet fra oncopigs forandrer
For å vurdere om
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
transgener kan være aktivert for å fremme tumorgenese, ble hud biopsier isolert fra den forannevnte fire oncopig avkom, og brukes til å etablere fibroblast linjer. Disse individuelle cellelinjer fra transgene oncopigs ble infisert med adenovirus som koder for enten det markør grønn fluorescens protein (AdGFP) eller adenovirus som koder for Cre rekombinase (AdCre), og den resulterende tilpasset par av infiserte kulturer ble undersøkt med hensyn til transformerte og tumorigene fenotyper. Som forventet, bare AdCre utsatt celler utstilt påvisbare nivåer av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
mRNA, som bestemt ved RT-PCR (figur 2a). I tillegg var det en klar forskjell i morfologi av AdCre celler sammenlignet med kontrollen AdGFP cellene. Spesielt, den tidligere tapte spindelen morfologi som er karakteristisk for enten de samme cellene før AdCre infeksjon eller når infisert med AdGFP kontrollvirus, og stedet var mindre, rundere mye mer løst festet til platen, og vil spontant danne foci (figur 2
B
). Denne forskjellen bebudet andre forvandlet fenotyper. Nærmere bestemt, FACS-analyse avslørte middel-cellesykluslengde av alle fire linjer ble forkortet fra 22 timer i AdGFP kontrollpopulasjon til 13 timer i AdCre populasjonen (figur 2c). AdCre celler oppviste også en midlere 2,8 gangers økning i celle migrasjon av alle fire linjer gjennom hele tidsforløpet av observasjons (figur 2d), vurdert ved en ripe-analyse, og produserte et gjennomsnitt på 143 kolonier når platet i bløt agar sammenlignet med ingen kolonier som oppdages i kontroll AdGFP celler (figur 2e). Vi konkluderte med at fibroblast linjer utviklet seg fra utledet uavhengig
KRAS
G12D Twitter /
TP53
R167H
oncopig kloner ble overtalt til å være transformert ved aktivering av ekspresjonen av disse transgener med Cre rekombinase. AdGFP behandlet transgene celler opprettholdt fenotyper som ligner de som ble observert for ikke-transgene cellelinjer.
(
en
) RT-PCR analyse av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
mRNA uttrykk i fibroblast cellelinjer fra hver av de 4 transgene kloner behandlet med AdCre eller AdGFP. (
b
) Sammenligning av celle morfologi mellom AdCre og ubehandlede kontrollceller i kultur, farget med H E. (
c
) Normalisert kopimaskiner målt ved FACS på tidspunkter følgende carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) fargestoff lasting av celler. (
d
) grafisk analyse av det midlere antall av migrerende celler fra tre eksemplarer plettering av hver av de 4 cellelinjer. (
e
) grafisk analyse av det midlere antall kolonier som vokser i soft agar for hver cellelinje fra triplikat plettering. (
ce
: alle datapunktene er gjennomsnittet av de 4 cellelinjer som stammer fra griser 63-1, 63-2, 63-3, 63-4, feilfelt = SD; * p-verdi ≤ 0,05 ; ** p-verdi ≤ 0,01)
Cre aktivering av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
transgener i fibroblaster avledet fra oncopigs er tumorigent
Oppmuntret av utviklingen av transformerte fenotyper, vi neste vurdert om AdCre kan indusere ovenfor fibroblaster å vokse i tumorigent mote. Dermed ble AdCre behandlet celler avledet fra fire uavhengig avledet transgene oncopigs injisert i immunkompromitterte hunnmus og injeksjonsstedet overvåkes for utvikling av svulster. Håndgripelig tumorer nådde 2000 mm
3 (maksimal tillatt størrelse) mellom 32 og 63 dager etter injeksjon-komplette penetrans dager (tabell 1). I motsetning til dette ble ingen tumorer detektert på de steder injisert med cellene fra de transgene oncopig celler behandlet med AdGFP over en 130-dagers observasjonsperiode (tabell 1). Vi konkluderer med at fibroblaster isolert fra uavhengige
KRAS
G12D Twitter /
TP53
R167H
oncopigs ble overtalt til å være tumorigent ved aktivering av ekspresjonen av disse transgener med Cre rekombinase. De tumormasser som følge av AdCre aktivering av celler fra transgene oncopigs (fig 3) viste under både høy og lav forstørrelse tegn på fast tumor (figur 3b), og var ikke et resultat av betennelse eller væskeansamling.
Lignende svulster (a) utviklet seg fra alle AdCre cellelinjer og ingen svulster utvikles fra AdGFP celle injeksjoner; Histologisk analyse (b) viste svulstene å være tett cellulær ikke innkapslet og infiltrerende svulst. 10x og sett 40X H . E Stain
svulstvev inkluderte ikke innkapslet, tett mobilnettet, og lokalt infiltrerende svulst. Neoplastiske celler ble arrangert i ark og bunter støttes av veldig fine fibrovascular stroma. Individuelle neoplastiske celler var rundt å spindeloid med mild til rikelig fibrillary til eosinofil cytoplasma. Nuclei var enkelt til flere, med rund til oval form og inneholder enkeltstående kjerne og spredt kromatin. Neoplastiske celler utstilt moderat til markert anisocytosis og anisokaryosis. Mitotiske tallene varierer 3-8 per 10 høye kraft felt (HPF). Områder av nekrose ble spredt inne i svulsten. Neoplastiske celler hadde invadert omkringliggende vev, inkludert skjelettmuskulatur, epidermis, nyre og eggstokk. Lite antall lymfocytter og sjeldne nøytrofile ble spredt i svulstene.
intramuskulær injeksjon av AdCre i oncopigs reproduserbart induserer svulster på injeksjonsstedet
Gitt de ovennevnte observasjonene vi neste testet om eksponering av AdCre
in vivo
ville indusere svulster på injeksjonsstedet i transgene oncopigs. For dette formål ble gris 63-3 anvendt for å produsere en kohort av transgene kull oncopigs for denne analysen. Pig 63-3 ble valgt følgende DNA-sekvensanalyse indikerer at transgenet konstruksjonen ble satt på et enkelt sted i intron 4 av den porcine CCDC-129-genet (kveil-spole domene som inneholder 129) som befinner seg på SSC18. Videre ble det innsetting orientert i en 3 «til 5» retning i forhold til kromosomet og det var ingen tegn på en concactomer. Dermed vil onkogen konstruksjon (fig 1a) fra villsvin 63-3 arves som en enkelt autosomal gen.
Den første av disse, oncopig-1, ble administrert AdCre intramuskulært i venstre bakbein. En svulst massen ble oppdaget av dag 10 etter injeksjon, som var godt synlig ved ultralyd (tabell 2 og figur 4
en
og 4
d
). Ikke bare var denne svulsten raskt etablert, men det også vokste raskt, og nådde et volum på 8 cm
2 innen 20 dager. Patologisk analyse av H (G-i) H . E farget avsnittene viser svulsten og tilstøtende normalt vev (2x) med en høy forstørrelse bilde inn (20x)
Mangel på noen påviselige endringer i injeksjonsstedet på d20 post-injeksjon er vist ved overflaten (a-c); i underliggende vev (d-f); eller ved histologisk undersøkelse (g-i).
Ulike typer svulster kan induseres i oncopig basert på injeksjonsstedet AdCre
For å undersøke om injeksjon av AdCre i andre vev kan føre til svulster, ble en testikkel av oncopig-en injisert med AdCre. Igjen ble en følbar masse oppdaget 10 dager etter injeksjon som raskt utviklet seg til en svulst (fig 4
c
, 4
f
, 4
i
og tabell 2) . Histopatologi av denne svulsten avslørte en dårlig differensiert tumor sannsynlig sex ledningen stromal opprinnelse. Tilsvarende ble det øret, magen og halsen oncopig-tre injisert subkutant med AdCre, som igjen førte til tumormasser på alle tre områder med patologi sarkom med regional glatt muskulatur differensiering (leiomyosarcoma) (figur 4
b
4
e
, 4
h Hotell og tabell 2). Således kan administrering av AdCre reproduserbart indusert tumorgenese i transgene oncopigs på hvert injeksjonssted. Administrasjonen av AdGFP inn ekstra oncopigs resulterte ikke i generering av tumormasse eller patologi (fig 5).
Diskusjoner
Grisen har mange egenskaper som gjør det en ideell plattform for å utvikle en genetisk definerte, stort dyremodell av kreft. Vi rapporterer nå etableringen av en transgen oncopig linje som koder for en Cre rekombinase induserbar transgen koding
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
, et vanlig mutert onkogen [7] og tumor suppressor [11], henholdsvis i humane kreftformer. Denne studien er en forlengelse på vår tidligere arbeid [6] hvor vi vist at mutasjoner i gener som er identifisert i studier på mennesker når de settes inn svin gener resultere i onkogenese og patologi som replikeres svulster observert klinisk.
I validere svin kreft dyremodell er det viktig at de resulterende tumormasser er validert med hva som er observert i humanmedisin. Dette behovet har blitt klart formulert av Cardiff [22-24] der neoplastisk progresjon ved hjelp av musen for brystkreft ved bruk av menneskelige mutasjoner ikke klarte å gjenskape svulster ble observert i klinikken. Dermed denne studien fokusert på viser at genmodifisert svin svulster resultere i histopatologiske fenotyper som spenner fra signatur fenotyper å etterligne menneskelige kreft [24].
Dermed svin modellen ble validert av demonstrasjonen som avledet fibroblaster fra transgen oncopigs behandlet med AdCre demonstrert aktivering av transgenet, som fører til alle de
in vitro
kjennetegnene til tumorer, inkludert en transformert celle morfologi, økt proliferasjon og migrasjon, og evnen til vekst i en forankrings-uavhengig måte. I avtalen, disse cellene var svært tumorigent når Eksplanterte inn immunkompromitterte mus. Denne effekten var svært reproduserbare, argumenterer mot oppkjøpet av en unik genetisk bakgrunn predisponerende en cellelinje for å bli forvandlet, som samme fenotyper ble observert i fibroblaster avledet fra totalt fire individuelle oncopigs. Til sammen utgjør disse data støtter konklusjonen om at den utledede oncopig fibroblaster er å indusere tumorigen.
I samsvar med muligheten for den avledede oncopig fibroblaster til å være tumorigen, en intramuskulær injeksjon av AdCre inn i transgene oncopigs har resultert i utviklingen av en mesenchymale svulst som tyder på leiomyosarcoma på injeksjonsstedet. Igjen, dette resultatet var meget reproduserbar, observeres ikke bare i et ulikt sete i den samme gris, men også i forskjellige littermate oncopigs. Som leiomyosarcoma er av glatt muskulatur opprinnelse, formodentlig disse svulstene oppsto fra infeksjon av denne muskelen typen, kanskje i blodkar eller piloerector muskler. AdCre injeksjon i testiklene ga opphav til en differensiert tumor sannsynlig sex ledningen stromal opprinnelse. I tillegg har ingen av kontroll ikke-transgene griser injisert med AdCre eller kontroll oncopigs injisert med AdGFP utviklet noen tumormasse eller patologiske forandringer. Samlet utgjør disse data støtter konklusjonen om at aktivering av celler in vivo ved AdCre induserer tumorigenesis. Videre disse dataene tyder også på at induksjon av rekombinasjon i andre vev,
vis-à-vis
levering av AdCre av ulike virkemidler enn foretatt her, eller i fremtiden ved vev-begrenset uttrykk for en Cre transgenet, kan føre til en rekke andre kreftformer. Som sådan, er dette «oncopig» linje gir en genetisk formbare modell for potensielt et bredt spektrum av krefttyper, som skulle vise seg å være uvurderlig til studier som tidligere hindret av mangelen på et stort dyr modell av kreft.
Materialer og Metoder
Alle dyr arbeidet ble gjennomført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer. Alle dyrestudier og prosedyrer ble godkjent av The University of Illinois Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC; Protocol nummer 11221 for gris og 12 170 for mus studier).
Kloning og sekvensering av svin
KRAS
og
TP53
gener i TOPO shuttle vektor
TJ Tabasco svin benmargceller ble isolert og frosset ved -80 ° C. Total RNA ble ekstrahert fra disse celler med RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA) 1 ug av dette ble revers transkribert til cDNA med QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, CA). Ensembl genom nettleser ble brukt til å designe PCR primer sekvenser for forsterkning av svin spesifikke
KRAS plakater (ENSSSCG00000000561) og
TP53
gener (ENSSSCT00000019534). Forover- og revers primer sekvenser for
KRAS
var 5′-CTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT-3 «og 5′-TTACATAATTATACACTTTGTCTTTGA-3», henholdsvis. PCR termiske betingelser for sykkel
KRAS
amplifisering var 94 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 3 min, og 65 ° C i 1 min med en endelig 72 ° C trinn i 10 min. Forover- og revers primer sekvenser for
TP53
var 5′-TGCAATGGCGGAGTCGCAG-3 «og 5′-TCAGTCTGAGTCAGGTCCTTC-3», henholdsvis. PCR termiske sykluser betingelsene var 94 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, og 68 ° C i 1 min med en endelig 72 ° C trinn i 10 min.
ACTB
ble brukt som en endogen kontroll. Forover- og revers primer sekvenser som ble anvendt var 5′-GACATCCGCAAGGACCTCTA-3 «og 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3», henholdsvis. PCR-betingelsene som ble brukt var den samme som for
TP53
. PCR forsterket
KRAS Hotell og
TP53
cDNA ble så klonet inn i pCR2.1-TOPO vektorer ved hjelp av TOPO TA kloning kit i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, CA) og cDNA bekreftet å ha 100% nukleotid identitet til svine
KRAS Hotell og
TP53 plakater (https://useast.ensembl.org/index.html).
Seterettet rettet~~POS=HEADCOMP mutagenese av
KRAS Hotell og
TP53
cDNA
QuikChange seterettet mutagenese Kit (Stratagene, CA) ble brukt til å innføre endringer i nukleotidsekvensen som tilsvarer G12D mutasjonen inn i klonet svin
KRAS
cDNA og R167H-mutasjonen inn i klonet svin
TP53
cDNA. Primere som brukes til å generere G12D mutasjon i
KRAS
var 5′-TGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAG-3 «og 5′-CTCTTGCCTACGCCATCAGCTCCAACTACCA-3». Primere som brukes til å generere R167H mutasjon i
TP53
var 5′-GAGGTGGTGAGGCACTGTCCCCACCAT-3 «og 5′-ATGGTGGGGACAGTGCCTCACCACCTC-3». Mutasjoner ble bekreftet ved sekvensering.
Kloning av
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
cDNA inn i Pires vektor
den nevnte
KRAS
G12D
cDNA ble PCR forsterket med primere 5′-CTAGCTAGCTAGCTGCTGAAAATGACTGAATAT-3 «og 5′-CCGCTCGAGCGGTTACATAATTATACAC-3» i 30 sykluser ved 94 ° C i 1 min, 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 1 min, og 68 ° C i 1 min, og den resulterende fragment klonet inn i NheI og Xhol områder av Pires (Clontech, CA. ). Den forannevnte
TP53
R167H
cDNA ble PCR-amplifisert med primerne 5′-ACGCGTGGACGTCTTGGCCATATGCAATGGAGGA3 «og 5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGTCTGAGTCAGGTCC-3» i 30 sykluser ved 94 ° C i 1 min, 94 ° C i 30 sek, 65 ° C i 1 min, og 68 ° C i 1 min, og den resulterende fragment klonet inn i
Sal
i og
Ikke
i områder av Pires inneholdende
KRAS
G12D
cDNA. cDNA sekvenser av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
ble bekreftet korrekt i den resulterende vektoren ved sekvensering.
Cloning CAG promoter inn i et loxP-STOP (polyA) -loxP inneholdende vektor
pkw15 plasmid inneholdende CAG promoteren og pkw13 plasmid inneholdende loxP-STOP (polyA) -loxP ble anvendt for vektoren konstruksjon. En CAG promoter ble isolert ved Spel /MfeI fordøyelsen og klonet inn i pkw13 plasmid ved Spel /EcoRI kloningsseter.
Byggingen av induserbare
KRAS
G12D
og
TP53
R167H
oncopig ekspresjonsvektor
KRAS
G12D Anmeldelser –
TP53
R167H
-pIRES vektor ble kuttet med Pvul og NheI, og det resulterende
KRAS
G12D
-IRES-
TP53
R167H
-polyA fragmenter var gel renset og klonet inn CAG-LSL-pkw13 vektorer på Paci /NheI nettsteder. cDNA sekvenser av
KRAS
G12D Hotell og
TP53
R167H
i den endelige vektor ble bekreftet korrekt i den resulterende vektoren sekvense
Generering av føtale fibroblast stammer
Herre føtale fibroblaster celler (FFCer) fra Minnesota minigriser (NSRRC: 0005). ble samlet inn som beskrevet [25] med noen modifikasjoner. I korthet, etter fjerning av hode og indre organer ble fosteret hakket og spaltet individuelt i 20 ml fordøyelse medium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 15% (v /v) føtalt bovint serum (FBS), 200 enheter /ml kollagenase og 25 enheter /ml DNaseI) i 4-5 timer ved 38,5 ° C og 5% CO
2 i luft. Digerert Cellene ble vasket med DMEM supplementert med 15% FBS (Hyclone, Logan, UT) og 10 ug /ml gentamicin, dyrket over natten, og deretter oppsamlet og frosset ved -80 ° C i FBS supplert med 10% dimetylsulfoksid (DMSO) ( volum /volum) og lagret i flytende nitrogen.
Produksjon av transgene celler
tidlig passasje tallfunksjonskodene (P1-2) ble dyrket i cellekulturmedium (DMEM supplert med 15% (v /v) FBS, 2,5 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor og 10 ug /ml gentamicin) over natten og dyrket til 75-85% konfluens. Media ble erstattet 4 timer før transfeksjon. Funksjonskodene som ble vasket i 1-2 min med fosfatbufret saltvann (PBS; Invitrogen) og høstet med 0,05% trypsin-EDTA (Invitrogen; 1 ml per 75 cm
2-kolbe). Celler ble resuspendert i cellekulturmedium, pelletert ved 600 x g i 10 minutter, resuspendert i 10 ml Opti-MEM (Invitrogen), og deretter kvantifisert ved hjelp av et hemocytometer og pelletert. Cellene ble resuspendert i transfeksjon media (75% cytosalts [120 mMKCl, 0,15 mM CaCl
2, 10 mM K
2HPO4, pH 7,6, 5 mM MgCl
2] [26] og 25% Opti-MEM [Gibco BRL, Grand Island, NY]). Cellekonsentrasjonen ble justert til 1 x 10
6 celler /ml og 200 ul celler ble ko-transfektert ved elektroporering med linearisert mutant
KRAS
og
TP53
konstruksjon inneholdende en selekterbar Neo kasett (2 mikrogram). Electroporation benyttet tre påfølgende 250-V, 1-ms firkantbølge pulser administreres gjennom en BTX ECM 2001 (BTX, San Diego, California) i en 2 mm gap kyvette. Etter elektroporering ble cellene sådd ut i en 100 mm skål ved 3000 celler pr tallerken i cellekulturmedium. Etter 36 timer ble celler utvalgt ved tilsetning av geneticin (G418, 400 pg /ml) i 10-14 dager inntil dannelsen av cellekolonier. Genomisk DNA fra cellekolonier ble benyttet for å bekrefte nærværet av begge transgener ved hjelp av PCR. Disse cellene ble deretter lagret i flytende nitrogen til det brukes som donorceller for SCNT.
oocytmodningen, SCNT, og embryo rekonstruksjon
fibroblast celler identifisert til å ha integrering av transgener (
KRAS
og
TP53
) ble anvendt som donorceller for SCNT til erte utskrapte oocytter, etterfulgt av elektrosmelting og aktivering som tidligere beskrevet [27]. I korte, cumulus-eggcelle cellekomplekser (kombinasjonspiller) ble mottatt i fase I modning medium fra ART Inc. (Madison, WI) ca 24 timer etter innhøsting. Kombinasjonspiller ble deretter dyrket i friskt Fase II modning medium for totalt 40 timer i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 38,5 ° C. Fase I og II medium ble levert av ART Inc. Expanded kombinasjonspiller ble deretter vortex-blandet i 0,1% hyaluronidase i Hepes-bufret Tyrodes medium inneholdende 0,01% PVA i 4 minutter for å fjerne de haug celler.
