Abstract
antiapoptotic BCL-2 familiemedlem Mcl-en er en PEST protein (inneholder sekvenser anriket på prolin, glutaminsyre, serin og treonin) og er underlagt rask nedbrytning via flere veier. Nedsatt nedbrytning som fører til opprettholdelse av Mcl-1-ekspresjonen er en viktig determinant for legemiddelresistens i cancer. Fosforylering ved Thr 163 i PEST-regionen, stimulert av 12-O-tetradekanoylforbol eddiksyre (TPA) -indusert aktivering av ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), er forbundet med Mcl-en stabilisering i BL41-3 Burkitts lymfomceller. Dette står i kontrast med den observasjon at Thr 163 fosforylering i normale fibroblaster primer glykogen syntase kinase (GSK3) -indusert fosforylering i Ser 159, som produserer en phosphodegron som er rettet mot Mcl-en for nedbrytning. I dagens oppfølgingsstudier i BL41-3 celler, ble Mcl-en degradering funnet å være uavhengig av GSK3p-mediert veien, noe som gir en parallell til nye funn som viser at Mcl-en degradering gjennom denne veien er tapt i mange forskjellige typer av kreft. Funn i Mcl-en-transfekterte CHO-celler bekreftet de i BL41-3 celler i at gsk3 målrettede phosphodegron ikke spille en viktig rolle i Mcl-en degradering, og en phosphomimetic T163E mutasjon førte til markert Mcl-en stabilisering. TPA-behandlede BL41-3-celler, i tillegg til å utvise Thr 163 fosforylering og Mcl-en stabilisering, oppviste en ~ 10-ganger økning i resistens mot flere kjemoterapeutiske midler, inkludert Ara-C, etoposid, vinblastin, eller cisplatin. I disse kreftceller hvori Mcl-1 degradering er ikke avhengig av GSK3p /phosphodegron rettede bane, ERK-aktivering og Thr 163 fosforylering er assosiert med utpreget Mcl-en stabilisering og medikamentresistens – effekter som kan undertrykkes ved hemning av ERK-aktivering .
Citation: Nifoussi SK, Vrana JA, Domina AM, De Biasio A, Gui J, Gregory MA, et al. (2012) Thr 163 Fosforylering Årsaker Mcl-en Stabilisering når Nedbrytning er uavhengig av tilknytning gsk3-målrettet Phosphodegron, Fremme Drug Resistance in Cancer. PLoS ONE 7 (10): e47060. doi: 10,1371 /journal.pone.0047060
Redaktør: Justin L. Mott, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 25 juni 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 09.10.2012
Copyright: © Nifoussi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Institutes of Health (R01 CA 057 359 til RWC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Økt ekspresjon av Mcl-1, stimulert av vekstfaktorer og andre miljøsignaler, fremmer levedyktighet og tillater amplifikasjonen og funksjon av celletyper og linjene som kreves av organismen [1] – [4]. Mcl-en nedregulering, på sin side, demper disse prosessene og fremkaller død hos skadet, ikke-funksjonelle, eller senescent celler [1], [5] – [7]. Opprettholdelse av forhøyede Mcl-1-ekspresjon er assosiert med medikamentresistens og dårlig prognose i en rekke kreftformer [8] – [15]. Midler som induserer Mcl-en omsetning, og hemmere er utformet for å målrette protein, kan fremme tumor celledød [16] -. [20]
Mcl-en ble identifisert basert på økt transkripsjon i ML-en menneskelig myeloblastisk leukemicellene indusert til å differensiere ved eksponering for TPA [21], [22]. Mcl-1 er også regulert post-translasjonelt (fig. 1A), som observert i BL41-3 Burkitts lymfom cellelinje hvori endogen pl-1 forsterkes og overuttrykt [1], [23], [24]. MCL-en er en PEST protein og er normalt gjenstand for rask omsetning. Imidlertid eksponering av BL41-3 celler til TPA resulterer i aktivering av mitogen-aktivert protein (MAP) kinase ERK, sammen med en ERK-avhengig økning i Mcl-1 fosforylering ved Thr 163 og markant redusert nedbrytning av Mcl-1-proteinet [25], [26].
fosforyleringsseter på Thr 163 og Ser 159 i menneske Mcl-1 protein er tegningen. Thr 163 er underlagt fosforylering av MAP kinaser, som sett på TPA-indusert ERK-aktivering i BL41-3 celler. Ser 159 er underlagt fosforylering av GSK3p. MCL-en er en PEST protein lagt rask omsetning, er halveringstiden av forfall være ~3 timer i BL41-3 celler (stipling av mindre versus større tetthet indikerer dårlig PEST og potensielle PEST-sekvenser, PESTFIND). Imidlertid Mcl-1 utstillinger slående stabilisering på TPA-indusert ERK-aktivering og Thr 163 fosforylering i disse cellene. MCL-en er også gjenstand for en annen posttranslational modifikasjon som involverer avkutting av den ekstreme N-terminale ([28] indikert med en pilspiss). Dette resulterer i en liten avstand 42/40 kD-dublett, hvor den nedre 40 kd bånd mangler ~16 aminosyrerester og er den mest tallrike bandet til stede i BL41-3 celler. Den dublett er best visualisert på store format elektroforese gels (Fig. S1B), men kan noen ganger bli oppdaget på standard gels (Fig. 1C). Som Thr 163 fosforylering ikke er til hinder for N-terminal trunkering, er Mcl-en stabilisering i nærvær av denne fosforyleringen sett på som bremset nedbrytning av den 40 kD-båndet. B: BL41-3 celler var enten venstre ubehandlet eller utsatt for TPA (5 nM) i de angitte tidsrom, og overvåkes for uttrykk for Thr 163 fosforylert Mcl-en (Mcl-en pT163), total Mcl-en, fosforylert ERK (perk ), og GAPDH (ChemiDoc). Alle prøver ble kjørt samtidig og underkastet den samme autoradiografisk eksponering, hvor det svarte vertikale linje i denne og etterfølgende figurer viser at banene har blitt omarrangert for å lette sammenligning. Thr 163 fosforylering ble også indusert ved lavere konsentrasjoner av TPA (f.eks, 1 nM, Fig. S1C), og ble inhibert ved U0126 (Fig S1D.). m C: BL41-3 celler ble enten ubehandlet eller utsatt for TPA (1 nM). Noen celler ble umiddelbart utsatt for CHX å overvåke Mcl-1-proteinet nedbrytning på dag 0. Andre TPA-behandlede celler ble inkubert i 24 timer (dag 1 etter TPA Addisjon) og deretter utsatt for CHX, hvor en del av disse cellene ble behandlet på nytt med TPA på dette tidspunktet. Den ubehandlede celleprøve (tid 0) er identisk for hvert par av Western blot. Blottet nederst bekreftet at perk ble redusert med 24 timer
Mcl-en er også gjenstand for fosforylering av GSK3p [20], [27] -. [34]. Faktisk, MAP kinase-indusert fosforylering ved Thr 163 tilveiebringer en tenn område for GSK3-indusert fosforylering i Ser 159, som har vært vist i normale mus-fibroblaster som er utsatt for ultrafiolett (UV) bestråling [27]. I dette systemet blir fosforylering ved MAP-kinase fosforyleringssetet (Thr 163) utføres av c-Jun N-terminal kinase (JNK); påfølgende fosforylering ved GSK3 fosforyleringssetet (Ser 159) resulterer i dannelse av en phosphodegron som er rettet mot Mcl-en for nedbrytning av E3-ubiquitin-ligaser inneholdende F-boks-proteiner [28], [32] – [34]. Mcl-1 kan også bli degradert ved en rekke andre reaksjonsveier, for eksempel via den BH3-holdige E3 ubiquitin ligase MULE (også kalt Arf-BP /Lasu1 /Huwe1 [35], [36]), det anaphase fremme komplekset [37 ], og ubiquitin-uavhengig mekanismer [38].
Emerging funn tyder på at en reduksjon i Mcl-en degradering via ovenfor gsk3-indusert vei bidrar til resistens i kreft. For eksempel er GSK3p inaktivering i brystkreftpasientprøver i forbindelse med tallrike Mcl-1-ekspresjonen og dårlig resultat [20], [32]. Tilsvarende redusert Mcl-1 degradering via GSK3p /phosphodegron rettede reaksjonsveien har vært implisert i kronisk lymfatisk leukemi [13], [39], [40]. En rekke legemiddelresistente krefttyper oppviser inaktivering av F-boks-protein FBW7, som ligger nedstrøms for fosforylering arrangementer slik som de som er indusert av GSK3p [33], [34]. I andre tilfeller utviser kreftceller øket ekspresjon av et deubiquitinase [41].
På grunn av betydningen av Mcl-1 i kreft, vi videre studert Mcl-en stabilisering som oppstår ved TPA-indusert ERK-aktivering i BL41-3 celler. Vårt formål var å bedre forstå det funn at Thr 163 fosforylering er forbundet med Mcl-en stabilisering i disse og andre kreftceller [42], men primer Mcl-1 for GSK3 /phosphodegron rettet nedbrytning i normale fibroblaster [27]. Selv fosforylering på flere nettsteder kan være involvert (f.eks Thr 92 [20]), dette synes ikke å være tilfelle i BL41-3 celler [25]. Resultatene fra våre studier viste at GSK3p-mediert banen ikke spille en viktig rolle i Mcl-en degradering i BL41-3 celler. Dette i motsetning til det som er observert hos normale fibroblaster, men paralleller de nye funnene viser at Mcl-en degradering via denne veien er ofte svekket i kreft. Foreningen av Thr 163 fosforylering med Mcl-en stabilisering i denne situasjonen ble rekapitulert i transfekterte CHO-celler, hvor Mcl-en degradering ikke ble påvirket av en ikke-phosphorylatable T163A mutasjon, men ble nesten helt blokkert av en phosphomimetic T163E mutasjon. Sammen med ERK-aktivering, Thr 163 fosforylering, og Mcl-en stabilisering, TPA-behandlede BL41-3 celler utstilt betydelig økt resistens mot apoptose-induksjon ved eksponering for cellegifter. Imidlertid medikamentsensitivitet ble delvis gjenopprettet av en inhibitor av ERK-aktivering. I motsetning til normale celler hvor Thr 163 fosforylering kan fremme GSK3p /Ser 159 phosphodegron rettede Mcl-en nedbrytning og død, i kreftceller hvori Mcl-1 ikke er degradert gjennom denne reaksjonsveien, ERK-aktivering og Thr 163 fosforylering er forbundet med redusert MCL-en degradering og slående stoffet motstand. Hemming av ERK-aktivering /Thr 163 fosforylering representerer en lovende tilnærming for å fremme Mcl-en degradering og narkotika følsomhet i disse kreftcellene.
Metoder
Cellelinjer og behandlinger
BL41 -3-celler ble avledet som en sublinje av BL41 Burkitt lymfoma-celler som beskrevet [23], og ble opprettholdt i RPMI 1640-medium inneholdende 7,5% FBS. De 5A-HSmyc CHO-celle-derivater [43], [44] ble opprettholdt i alfaMEM medium inneholdende 5% FBS. Musen AKR-2B embryonale fibroblast linjen var fra M. J. Getz (Mayo Foundation, Rochester, Minnesota) [45], og ble dyrket i McCoys 5A medium som inneholder 5% FBS. TPA var fra Alexis Biochemicals, LiCl, cycloheximide, LY294002, etoposid, vinblastin, cis-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin), Wortmannin, og cytosinarabinosid (Ara-C) var fra Sigma, U0126 var fra EMD Chemicals, og NaCl fra Fisher Scientific.
Mcl-en konstruerer og Transfeksjon
Mcl-1 uttrykk konstruerer var i pcDNA 3,1 vektor [25] inneholder en neo motstand markør. WT-Mcl-en, Mcl-en-T163A, og Mcl-en-T162A konstruksjoner har blitt beskrevet, og Mcl-en-T163E og Mcl-en-S159A ble utarbeidet etter de samme metoder [25], med følgende primere . For MCL-1-T163E (øvre primer) 5′- GGTCACTACCCTCGGAGCCGCCGCCAGCAG-3 «og (lavere primer) 5′-CTGCTGGCGGCGGCTCCGAGGGTAGTGACC-3′, og for MCL-1-S159A (øvre primer) 5»-CGGACGGGGCACTACCCTCGACGCCGCCGC-3 «og ( lavere primer) 5»-GCGGCGGCGTCGAGGGTAGTGCCCCGTCCG-3 «. Transfeksjon ble gjennomført med Effectene (Qiagen) eller Lipofectectamine 2000 (Invitrogen), ved hjelp av celler belagt på gårsdagen.
Western Analyse
Western blotting forhold som oppdager den menneskelige Mcl-1 protein har blitt beskrevet [25], [43], hvor ingen kryss-reaktivitet med den kinesiske hamster-proteinet er sett. Standard størrelse elektroforese gels ble brukt, unntatt som angitt hvor stort format gels som skiller Mcl-en dublett ble brukt. For overvåking av Mcl-en nedbrytning i CHO-celler, ble cellene på ny sådd ut til friskt medium på dagen etter transfeksjon og utsatt for CHX (20-25 mikrogram /ml) 24 timer senere [30]. For BL41-3 celler en konsentrasjon på 2,5 mikrogram /ml CHX ble anvendt [25]. En ChemiDoc Molecular Imaging System (BioRad) ble tilgjengelig og ble brukt for noen eksperimenter, som tillot for estimering av endringer i Mcl-1 uttrykk. Disse endringene ble beregnet som en reduksjon i Mcl-1-ekspresjonen i forhold til parallelle ubehandlede kontrollceller. Mens en nyttig antistoff rettet mot Mcl-1 phosphoThr 163 er ikke kommersielt tilgjengelig, en liten mengde av antistoffet som er beskrevet tidligere var tilgjengelig, [46].
Pulse /chase
35S-Met merking
Tidligere beskrevne fremgangsmåter ble anvendt for [24] – [26]. I korte trekk, en dag etter plating ble cellene vasket 3 ganger med og inkubert i metionin-fritt RPMI-medium inneholdende 5% dialysert FBS og 25 mM HEPES-buffer. Cellene ble puls-merket med over-
35S-Met i 2 timer, og deretter renset med alfaMEM medium inneholdende 5% FBS og en ytterligere 15 mg /ml L-metionin. Etter høsting og vasking to ganger med PBS på is, ble pelleten lysert ved passasje gjennom en sprøyte i lyseringsbuffer [vaskebuffer (142,5 mM KCl, 5 mM MgCl
2, 1 mM EGTA i 20 mM Tris-Cl, pH 7,4 ) inneholdende 0,2% Nonidet P-40 og Sigma protease og fosfatase-inhibitor cocktail]. Pelleten ble inkubert over natten i kulden med antiMcl-1-antistoff (Santa Cruz S-19) konjugert til Dynabeads (Dynal, Norge), vasket to ganger med lyseringsbuffer, en gang med vaskebuffer, og underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese. Gelen ble fiksert i 10% eddiksyre.: 30% metanol, dynket i NAAMP 100 forsterke (Amersham Biosciences, UK), tørket og utsatt for røntgenfilm og en PhosphorImager skjerm, idet sistnevnte blir analysert ved anvendelse av Imagequant programvare
flowcytometrisystemer
Flowcytometri ble utført ved hjelp av en FITC-konjugert antiMcl-1 antistoff med Caltag Fix . Perm kit (10.000 celler analysert for hver prøve)
Cell Død analyser
apoptotiske celler som opprinnelig definert morfologisk ble scoret ved hjelp av Wright Giemsa farget cytospin (Shandon) glidemidler [17], [47], [48]. PARP-spaltning ble analysert ved Western blot-analyse ved å bruke den totale PARP-antistoff (Cell Signaling), og kjemiluminescens scanning av membranene ved hjelp av ChemiDoc system. Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av Fiji-programmet (NIH ImageJ).
Statistical Analysis
Halveringstiden for nedbrytning av MCL-1-kodede proteiner (analysert ved hjelp av ChemiDoc system) ble anslått av non -lineære regresjon ved hjelp Prism 5 (GraphPad Software). Andre statistiske analyser ble utført ved hjelp av SigmaStat programvare.
Resultater
ERK aktivering, Thr 163 Fosforylering, og stabilisering av den endogene Mcl-1 Protein oppstå tidlig etter Eksponering av BL41-3 Cells til TPA og senere blir nedregulert
BL41-3 celler stille rikelig konstitutiv ekspresjon av endogent Mcl-en (~ 5 ganger høyere enn ML-1 celler stimulert med TPA [23]), og har vist seg svært nyttig for studier av sin posttranslational regulering. TPA-indusert ERK-aktivering resulterer i liten ytterligere økning i Mcl-1-ekspresjon i disse cellene (fig. S1A, B), i motsetning til i ML-1 og andre celler [17], [21], [22], [25], [26]. BL41-3 celler er således spesielt nyttig for studier av TPA /ERK-indusert fosforylering Thr 163 [24], fordi effekter på stabiliteten av proteinet kan bli undersøkt i fravær av vesentlig Mcl-1-induksjon.
våre innledende forsøk karakteriseres ytterligere timingen av effektene indusert av TPA, ettersom ERK-aktivering er ofte forbigående [17], [49]. ERK-aktivering og øket Thr 163 fosforylering var påvisbare i løpet av 0,5 timer etter TPA-tilsetning [24], [25] og opprettholdt i ca. 6 timer, deretter avtar som overvåkes i opptil 24 timer (fig. 1B og fig. S1A). For å avgjøre om nedgangen i ERK-aktivering og Thr 163 fosforylering observert etter langvarig TPA eksponering vil bli reflektert i en nedgang i Mcl-en stabilisering, overvåket vi Mcl-en forfall både umiddelbart etter TPA tillegg og 24 timer senere. Når CHX ble brukt til å hemme proteinsyntesen, Mcl-en degradering var nær komplett i løpet av 7 timer (Fig. 1C, øverst til venstre), men ble bremset ved samtidig bruk av TPA (Fig. 1C, øverst til høyre), som i tidligere studier [ ,,,0],25]. Imidlertid, når CHX ble påført 24 timer etter TPA, ble Mcl-en stabilisering svekket (fig. 1C, nederst til venstre), selv om det kan bli gjenopprettet ved anvendelse av ytterligere TPA på dette tidspunkt (fig. 1C, nederst til høyre). I sum, ERK-aktivering, Thr 163 fosforylering, og Mcl-en stabilisering skje så tidlig hendelser ved eksponering av BL41-3 celler til TPA, og er alle senere nedregulert. Disse resultatene forsterket tidligere funn, som hadde foreslått en nær sammenheng mellom disse TPA-indusert effekter i det hele tatt ble hemmet av ERK pathway inhibitor U0126 ([25] og Fig. S1D).
Mcl-en Nedbrytning i BL41-3 Cells er LiCl-insensitive
Mcl-1 kan være målrettet for degradering av GSK3p, og eksponering for TPA resulterer i GSK3p-inaktivering i enkelte celler [29], [31], [32], [50 ], [51]. Det virket derfor mulig at TPA-indusert gsk3 inaktivering og hemming av Mcl-en degradering gjennom denne veien kan konto for stabilisering sett i BL41-3 celler. Som et middel for å undersøke denne mulighet, vi probet for en effekt av TPA på ekspresjon av GSK3p target beta-catenin. Effekten av GSK3p-inhibitor LiCl ble overvåket i parallell. Sistnevnte agenten fungert som en positiv kontroll stand til å forårsake en økning i beta-catenin uttrykk (Fig. 2A spor 3, midt fotografi). Vårt formål var å finne ut om TPA lignet effekten av LiCl for å produsere en økning i p-catenin uttrykk, da dette ville være tyder på en virkning på GSK3p. . Men TPA så ikke ut til å ha en slik effekt i at det ikke øke beta-catenin uttrykk i fravær av LiCl (Fig. 2A lane 2, midt fotografi)
A: BL41-3 cellene enten ubehandlet eller utsettes for TPA (20 nM) og /eller LiCl (20 mM, NaCl eller som en kontroll). Etter 18 timer, ekspresjon av Mcl-1, beta-catenin, og GAPDH og ble analysert ved Western blotting. Sammenlignbare resultater ble observert når cellene ble eksponert for TPA i 30 minutter i stedet for 18 timer (ikke vist). B: BL41-3-celler ble utsatt for de angitte konsentrasjoner av LiCl (eller KCl eller NaCl som kontroll), og analysert for ekspresjon av Mcl-1 og beta-catenin etter 24 timer. Et stort format gel som skiller de Mcl-1 doublet båndene ble anvendt. Svak inhibering av cellevekst ble sett ved 10-20 mM LiCl (13 og 27%, respektivt, sammenlignet med 5% med 20 mM NaCl). Resultater tilsvarende de som er vist ble oppnådd med en eksponeringstid på 12 timer eller en LiCl-konsentrasjon på 40 mM (ikke vist). C: BL41-3 cellene ble inkubert i fravær eller nærvær av LiCl (20 mM) i 0,5 timer, ved hvilken tid CHX ble brukt. Uttrykk for Mcl-1, beta-catenin, og GAPDH ble analysert etter de angitte tider. Ingen vesentlig forskjell ble sett i parallelle celler eksponert for NaCl (20 mM, ikke vist) i stedet for LiCl.
Mcl-1-ekspresjon ble også overvåket i den ovennevnte eksperiment, og ble ikke funnet å være økt i nærvær av LiCl (fig. 2A, øvre fotografi). Faktisk ble ingen endring i Mcl-1 uttrykk sett selv ved LiCl konsentrasjoner som forårsaket en maksimal økning av beta-catenin uttrykk og ved undersøkelse ved hjelp av stort format gels (Fig. 2B). Denne observasjonen var interessant som LiCl stabiliserer Mcl-en i en rekke celler, og vi hadde opprinnelig antatt at en GSK3p-mediert, LiCl-sensitive reaksjonsvei kan være involvert i BL41-3 celler. Imidlertid ytterligere observasjoner var også i samsvar med mangel på en rolle for denne bane i Mcl-1 degradering i BL41-3 celler. Dermed eksponering av disse cellene til Wortmannin eller LY294002, PI3K hemmere som kan hindre hemmende fosforylering av GSK3p og dermed øker nedbrytningen av sine mål, ikke merkbart påvirker uttrykket av Mcl-en samtidig redusere det av beta-catenin (Fig. S2A ). I tillegg ble LiCl ikke funnet å påvirke Mcl-1 degradering i nærvær av CHX (Fig. 2C). I sum, Mcl-1 degradering i BL41-3 celler viste seg å være stort sett LiCl-ufølsom, og TPA ikke virke ved å etterligne effekten av denne GSK3p-inhibitor. Disse resultatene, tatt sammen med tidligere funn (Fig. 1 og [25]) foreslo at Thr 163 fosforylering kan være assosiert med Mcl-en stabilisering i celler hvor gsk3 målrettet degradering ikke spiller en stor rolle. Dette punktet ble vurdert nærmere nedenfor, ved hjelp av transfectable CHO-cellesystem i hvilket fosforyleringssete-mutanter kan bli undersøkt.
Mcl-1 degradering er ikke avhengig av den GSK3p-målrettede Phosphodegron og er vesentlig forsinket av en T163E Mutasjon i transfekterte CHO-celler
CHO-celler tilveiebringe et lett transfectable system som er nyttig for å studere mutasjoner i områder funnet å gjennomgå post-translasjonell modifikasjon endogent i BL41-3 celler [24], [25], [30], [43] . CHO-celler inneholder basal aktivert ERK motsetning BL41-3 celler. Følgelig oppstår Thr 163 fosforylering ved transfeksjon med WT-Mcl-1, og er ikke ytterligere økes ved tilsetning av TPA [25]. Vi har derfor satt ut for å undersøke effekten av en ikke-phosphorylatable T163A mutasjon, såvel som et phosphomimetic T163E mutasjon, ved transfeksjon av mutante konstrukter inn i CHO-celler. Interessant, foreløpige resultater viste at LiCl ikke påvirker ekspresjonen eller nedbrytning av WT-Mcl-1 i CHO-celler, selv om beta-catenin ekspresjon ble øket (fig. 3A og S2B fig.). Dette ga en parallell til funnene i endogent uttrykker BL41-3 celler (fig. 2C), og foreslo at Mcl-en degradering kan heller ikke bli formidlet via gsk3 i transfekterte CHO-celler. I dette tilfellet ville en T163A mutasjon ikke forventes å påvirke Mcl-1 degradering. Dette vil avvike fra det som er sett i normale fibroblaster, hvor en T163A mutasjon bremser Mcl-en degradering fordi Thr 163 fosforylering primtall gsk3-indusert Ser 159 fosforylering og degradering [27]. Faktisk Mcl-en-T163A-kodet protein gikk rask nedbrytning ved eksponering av transfekterte CHO-celler til CHX (Fig. 3B), som gjorde WT-Mcl-1-, Mcl-en-S162A- og Mcl-en-S159A -kodet proteiner (fig. 3B, C). MCL-en-S162A representerer en ekstra kontroll som fosforylering ikke har blitt observert på dette stedet [25]. Vi merker oss at, som i tidligere rapporter [27], en S159A /T163A dobbel mutant ble ikke undersøkt, fordi en nesten fullstendig tap av Mcl-en fosforylering er sett med T163A mutasjon i CHO-celler [25] og dette priming nettstedet mutasjon hindrer Ser 159 fosforylering i fibroblaster [27]. Samlet utgjør disse resultatene med ikke-phosphorylatable mutasjoner samt LiCl tyder på at gsk3 målrettede phosphodegron ikke spiller en viktig rolle i Mcl-en degradering i transfekterte CHO-celler. I denne situasjonen, Mcl-1-T163E kodede protein oppviste slående stabilisering [fig. 3B (se lysere eksponering inngår i bunnen på grunn av den omfattende stabilisering sett med denne konstruksjonen) og fig. 3C]. Lignende resultater ble oppnådd med AKR-2B-celler (figur 3D.)
A:. CHO-celler ble transfektert med WT-Mcl-1 og inkubert i nærvær av LiCl (+ LiCl, 20 mM) eller i sin fravær (-LiCl), hvor 20 mM NaCl ble tilsatt i det siste tilfellet. Etter 10 timer ble CHX påført og ekspresjon av det innførte WT-Mcl-1-genproduktet, og endogen p-catenin og GAPDH ble analysert etter de angitte tider (ChemiDoc). Halveringstiden av Mcl-en nedbrytning ble beregnet til å være ~4 timer i celler eksponert for LiCl, og 3,7 timer i kontrollene utsatt for NaCl. Ingen vesentlig forskjell ble sett i parallelle celler ikke utsettes for NaCl eller LiCl. Blottet vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. B-C: CHO-celler ble transfektert med de angitte konstruksjoner, utsådd på den følgende dag, og inkubert i en 24-timers periode for å tillate ekspresjon. CHX ble deretter tilsatt, og ekspresjon av det innførte Mcl-1-genproduktet og endogen beta-tubulin ble analysert etter de angitte tider ved hjelp av Western blotting. I panel B, nedgangen i Mcl-1 uttrykk ved 3 timer på 2 uavhengige eksperimenter varierte 53-66% med WT-Mcl-1, 25-54% med Mcl-en-S162A, og 25-50% med Mcl- 1-T163A. Mens nedgangen i uttrykk med WT-Mcl-en dukket være litt større enn det som ble sett med Mcl-en-T163A, dette var ikke et gjennomgående funn. En kort autoradiografisk eksponeringen er også vist fordi flere band ble påvist ved de høye nivåer av uttrykk oppnådd med Mcl-en-T163E. Ved slutten av 12-timers observasjonsperiode, ekspresjon av Mcl-1-T163E ble redusert med ~15% i panel B og ~27% i felt C, som beregnet fra korte autoradiografiske eksponeringer. D: AKR-2B-celler transfektert med de angitte konstruksjoner ble utsådd på følgende dag, på hvilket tidspunkt cellelevedyktigheten (trypan blå fargestoff eksklusjon) var 88-92% i utransfekterte samt transfekterte kulturer. En dag senere ble cellene eksponert for 25 ug /ml CHX og analysert etter de angitte tider for ekspresjon av det innførte Mcl-1-genproduktet eller endogen aktin ved Western blotting. Duplicate platene er vist i tilstøtende gater
Mcl-en-T163E utstillinger Forhøyet Opphopning. Og Hindrer utvekst av Stabile G418-resistente Transfektanter
I eksperimentet over, Mcl-1- T163E oppviste forhøyet akkumulering i løpet av uttrykket perioden før påføring av CHX (fig. 3B, tid 0). Undersøkelse av tidsforløpet for akkumulering bekreftet at en dramatisk økning skjedde etter transfeksjon med Mcl-1-T163E sammenlignet med WT-Mcl-1 (fig. 4A, baner 4-5 versus banene 1-2).
A: CHO-celler ble ko-transfektert med enten WT-Mcl-1 eller Mcl-1-T163E sammen med pEGFP, og analysert ved de angitte tider for ekspresjon av det innførte Mcl-1-genproduktet og EGFP ved Western blotting. Hastigheten for økning av Mcl-1-T163E protein ble estimert til å være minst 10 ganger større enn den til WT-Mcl-1. Omtrent ekvivalent ekspresjon av EGFP i WT-Mcl-1- og Mcl-1-T163E-transfekterte kulturer ble også observert ved analyse ved strømningscytometri (ikke vist). B: CHO-celler ble transfektert med WT-Mcl-1 eller Mcl-1-T163E og utsatt for en to-timers puls eksponering til
35SMet, ved hvilket tidspunkt en «tids 0» prøve ble høstet. En jage med medium som inneholder ikke-radioaktivt metionin ble deretter utføres og
35SMet- merket Mcl-1 proteiner ble analysert etter de angitte ganger (øvre bilde). En ikke-spesifikke bånd av ~32 kd er inkludert på figuren (*) for sammenligningsformål og en separat aliquot av hver prøve ble analysert for totalt Mcl-1-ekspresjon ved Western blotting (lavere fotografi). Halveringstiden av forfall ble anslått av PhosphorImager å være, 2,5 ganger lenger med
35S-Met Mcl-en-T163E enn med
35S-Met-WT-Mcl-en.
ved puls /jage metabolsk merking,
35S-Met-Mcl-en-T163E og
35S-Met-WT-Mcl-en viste tilsvarende syntese under den innledende puls (fig. 4B, tid 0 ). Etter jakten, forfallet av
35S-Met-Mcl-en-T163E ble redusert i forhold til at av
35S-Met-WT-Mcl-1 (Fig. 4B), selv bremse her var ikke like merket som hadde blitt sett ved å overvåke den totale Mcl-1-T163E protein ved Western blotting (fig. 3B). Dette kan reflektere det faktum at puls /jage merking analysene den nylig syntetisert protein (vanligvis en brøkdel av den totale), eller andre forskjeller mellom disse metodene [52], [53]. Sett under ett, de ovennevnte funnene forsterket og utvidet de i BL41-3 celler, som viser at T163E mutasjon førte Mcl-en stabilisering i CHO-celler, hvor degradering var i stor grad uavhengig av gsk3 målrettede phosphodegron på S
159LPST
163P.
Den omfattende stabilitet og forhøyet akkumulering sett med Mcl-en-T163E kan forholde seg til en videre observasjon, som var at vi ikke var i stand til å utlede stabilt transfekterte cellelinjer med denne konstruksjonen. Denne observasjonen var opprinnelig noe uventet, fordi stadig økende transfekterte cellelinjer ble oppnådd tidligere med WT-Mcl-en etter valg med G418 (på grunn av den neo
R markør [43]), og kan også oppnås med Mcl-1- T163A. Mcl-1-ekspresjon i disse stabilt transfekterte cellelinjer var i området sett i celler som uttrykker MCL-1 endogent, slik som BL41-3 celler og TPA-behandlede ML-1-celler ([43] og øvre panel og legende).
i lys av det ovennevnte observasjon, undersøkte vi Mcl-1-T163E-transfekterte kulturer ved tidlige tidspunkter etter transfeksjon og seleksjon med G418. Direkte etter transfeksjon, ble en rekke Mcl-1 ekspresjonsnivåene observert (fig. S3A nedre panel). Når G418 ble deretter brukt til å eliminere utransfekterte celler, gjorde levedyktige celler ikke vokse ut fra Mcl-en-T163E-transfekterte kulturer, i motsetning til hva som skjedde med WT-Mcl-1 [Fig. S3b (fylte symboler i riktig forhold til midtpanelet), hvor cellene vokste i fravær av G418 i begge tilfeller, men tapte Mcl-1-ekspresjonen (åpne symboler)]. G418-resistente celler som vokste ut med WT-Mcl-en viste mye lavere nivåer av uttrykk enn den opprinnelige bulk tilført befolkningen (Fig. S3C, baner 10-12). I motsetning til dette ble rikelig ekspresjon opprettholdt i Mcl-1-T163E-transfekterte kulturer (fig. S3C, kolonnene 16-18). Samlet, utvalg med G418 resulterte i utvekst av transfektant linjer stiller uttrykk i den endogene serien med WT-Mcl-en samt Mcl-en-T163A, men ikke med Mcl-en-T163E.
I tillegg til dens antiapoptotic virkning, har Mcl-1 er rapportert å inhibere celleproliferasjon i noen systemer [54], [55]. Denne effekten ble ikke observert i stabile transfektanter som uttrykker proteinet i nivåer i den endogene området [56]. Imidlertid inhibering av proliferasjon har blitt sett ved forbigående transfeksjon eller andre metoder som er i stand til å produsere høye nivåer av ekspresjon. Det faktum at WT-Mcl-1-transfekterte CHO-cellelinjer viste ekspresjon i det endogene området (fig. S3A øvre panel) antyder at slike celler kan ha hatt en vekstfordel fremfor de med høyere nivåer av ekspresjon. Stabile transfektanter med en annen mottaker linjen også utstilt uttrykk i den endogene rekkevidde, men ikke høyere [56]. Total, mens WT-Mcl-1 fremmer levedyktighet i stabilt transfekterte kloner som uttrykker endogene nivåer i serien, gjenstår det ikke bestemt om høyere ekspresjonsnivåer resultere i ytterligere effekter som for eksempel hemming av celleproliferasjon.
I lys av de ovennevnte hensyn, er det kanskje ikke overraskende at stabilt transfekterte linjer ikke ble oppnådd med Mcl-en-T163E. Vi merker oss at ekspresjon av endogen tubulin ble redusert i kulturer transfektert med denne konstruksjon (fig. S3C), som kan forholde seg til forhøyet ekspresjon av det transfekterte protein og /eller tilstedeværelsen av det ikke-fjernbare Glu mutasjon. Vi merker oss også at enkelte celler i den innledende bulk Mcl-en-T163E-transfektert befolkningen utstilt lavere uttrykk (Fig. S3A nedre panel).
