Abstract
Bakgrunn
Både mage og kolorektal kreft (CRC) er den hyppigst forekommende maligniteter over hele verden med den totale overlevelsen av disse pasientene er fortsatt misfornøyd. Identifisering av tumorsuppressorgener (TSG) forstummet av arrangøren CpG metylering avdekker mekanismer for tumordannelse og identifiserer nye epigenetiske biomarkører for tidlig diagnose av kreft og prognose vurdering. Cystationin-beta-syntase (CBS) funksjoner i folatmetabolismen veien, noe som er intrikat knyttet til metylering av genomisk DNA. Feilregulering av DNA metylering bidrar vesentlig til kreftutvikling.
Metodikk /hovedfunnene
For å identifisere potensielle TSGs forstummet av avvikende promoter metylering i CRC, vi analysert tumor og tilstøtende vev fra CRC tilfeller bruker Illumina menneskelig Methylation45 BeadChip. Vi identifiserte hypermethylation av
CBS
genet i CRC prøvene, sammenlignet med tilstøtende vev. Metylering og redusert mRNA ekspresjon av
CBS
ble påvist i de fleste CRC-cellelinjer ved metylering-spesifikk PCR og semikvantitativ RT-PCR, så vel som i magekreft. Behandling med 5-aza-2′-deoxycytidine og /eller trichostatin en omvendt metylering og restaurert
CBS
mRNA uttrykk som indikerer en direkte effekt. Aberrant metylering ble videre påvist i 31% av primær CRC (29 av 96), og 55% av mage-tumorer (11 og 20). I motsetning til dette ble metylering som sjelden finnes i normale vev tilstøtende til tumoren.
CBS
metylering var assosiert med
KRAS
mutasjoner i primær CRC (
P
= 0,04, ved χ
2-test). Men ingen sammenheng ble funnet mellom
CBS
metylering eller
KRAS
mutasjoner med kreft tilbakefall /metastase i Stage II CRC pasienter.
Konklusjon
En roman finne fra denne studien er at folatmetabolismen enzym
CBS
mRNA nivåer er ofte nedregulert gjennom CpG metylering av
CBS
genet i magekreft og CRC, noe som tyder på at
CBS
fungerer som et tumorsuppressorgen. Disse funnene tilsier videre studier av
CBS
som en epigenetisk biomarkør for molekylær diagnostikk av gastrointestinale kreft
Citation. Zhao H, Li Q, Wang J, Su X, Ng KM, Qiu T, et al. (2012) Hyppig epigenetisk stanse av den Folat-metaboliserende Gene
cystation-Beta-syntase
i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49683. doi: 10,1371 /journal.pone.0049683
Redaktør: Anthony WI. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 27 juli 2012; Godkjent: 11 oktober 2012; Publisert: 13.11.2012
Copyright: © 2012 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 30801344), Nova program (No. 2009A70) Beijing og staten Key Laboratory program (nr 2060204). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Både mage og kolorektal kreft er de hyppigst forekommende kreftformer over hele verden som har forekomsten har økt de siste årene [1], [2]. Selv om diverse nye behandlingsmetoder, inkludert kirurgisk, medisinsk og radiologisk har blitt innført, det kliniske forløpet av mage og tykktarmskreft (CRC) er variabel og den generelle prognosen er fortsatt ikke tilfredsstillende. Derfor identifikasjon av viktige gener som er involvert i den molekylære patogenesen av magekreft og CRC er sannsynligvis føre til nye og mer effektive terapeutiske strategier.
Inaktivering av multiple tumorsuppressorgener (TSG) er en nøkkel molekylær hendelse i flertrinns genetisk patogenesen av CRC [3]. I tillegg til genetiske endringer, spiller epigenetisk inaktivering av TSGs en viktig rolle i karsinogenese [4]. Epigenetisk lyddemping gjennom avvik metylering av CpG øyer (CGI) i TSG promotorområdene forekommer i nesten alle krefttyper [4]. Spesielt har en voksende liste av abnorme metylert TSGs blitt rapportert i CRC, inkludert
APC
,
MGMT
,
MLH1
,
p16
INK4A
,
VHL
,
RASSF1A
,
HIC1
,
CHFR
,
ADAMTS18
,
PCDH10 Hotell og
DLEC1 product: [5] – [10] samt i magekreft [11], [12]
i denne studien har vi undersøkt for TSGs forstummet av avvikende promoter metylering i CRC. og fant hypermethylation av
cystationin-beta-syntase product: (
CBS
) genet som koder for et viktig enzym i folatmetabolismen [13], [14]. Nyere arbeider har fokusert på enzymer som er involvert i folatmetabolismen, ettersom metylering av DNA er avhengig av disse reaksjonsveier [15] – [19]. Genetisk ustabilitet med karakteristiske kromosom ubalanser er et karakteristisk trekk ved kreftutvikling. Homocystein og folat stoffskiftet er relatert til DNA integritet, og genetiske varianter som funksjonelt påvirke homocystein og folat stoffskifte er forbundet med ulike typer kreft som CRC, non-Hodgkins lymfom, etc [20], [21]. Målet med dette arbeidet var å undersøke om
CBS
var en ny potensiell TSG og for å teste om
CBS
mRNA uttrykk ble nedregulert av arrangøren hypermethylation i CRC, samt i magekreft. Vi undersøkte også den potensielle rolle
CBS
genet hypermethylation som en biomarkør for å forutsi tumor tilbakefall eller metastaser i stadium II (T
3N
0M
0) CRC pasienter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til Helsinki retningslinjer for menneske fag studier og ble godkjent av Institutional Review Board of Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CAM), Beijing, Kina. Signert informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne for prøvetaking og analyse.
Cellelinjer
Fire CRC (HCT116, HT29, LoVo og SW480) og 16 magekreft (Kato III, YCC1, YCC2, YCC3, YCC6, YCC7, YCC9, YCC10, YCC11, YCC16, SNU719, AGS, MKN28, MKN45, SNU1 og SNU16) cellelinjer ble brukt [10]. Cellelinjer ble rutinemessig opprettholdt i RPMI-1640 medium med 10% FBS. Den HCT116 cellelinje med genetisk knockout av DNA metyl-transferase gener
DNMT1 Hotell og
DNMT3B plakater (dobbelt knockout, HCT116
DKO) var en gave fra Dr. Bert Vogel, Johns Hopkins University [22] og dyrket i nærvær av 0,4 mg /ml genecitin eller 0,05 mg /ml hygromycin.
tumorprøver
Alle hoved prøvene, inkludert fire sammenkoblede frisk CRC og normale vev, 96 primære formalin fast parafin innebygd (FFPE) CRC vev og 20 FFPE magekreft av vev, ble hentet fra Avdeling for patologi, Cancer Hospital, CAMS, Beijing, Kina. I tillegg, for metylering studien ble tilsvarende tumorfrie marginer fra 20 magekreft og 17 CRC-pasienter som ble analysert. Alle pasientene fikk ikke gjennomgå tidligere kjemoterapi eller strålebehandling siden de presenteres med resektable svulster. Friske prøver ble hurtigfrosset i flytende N
2 og deretter lagret ved -80 ° C inntil behandling. Diagnosen ble bekreftet gjennom hematoxylin og eosin (HE) -staining og histopatologiske analyser ble utført for å definere representative tumor regioner. Klinisk informasjon var tilgjengelig for alle CRC pasienter, inkludert kjønn, alder, differensiering og oppfølgingsdata. Median alder for CRC pasienter var 68 år (range 37-93), og mann til kvinne ratio var 1.4:1 (56:40). Antall brønn, moderate og dårlig differensiering tilfeller var 14, 56 og 26, respektivt. Kreft iscenesettelse (pTNM) ble definert i henhold til 7
th utgaven av amerikanske Joint Committee of Cancer [23]. Alle CRC pasienter er på stadium II (PT
3N
0M
0).
DNA og RNA Utvinning
Total RNA og DNA ble ekstrahert fra cellelinjer som bruker TRI Reagens (Molecular Research Centre). For friske tumorvev, ble frosne snitt innhentet og gjennomgått for å sikre at svulsten innholdet var mer enn 80% av seksjon området. DNA ble ekstrahert fra frisk vev og FFPE-prøver ved hjelp av QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) etter produsentens anvisninger.
Farmakologisk Demety
To mage kreft cellelinjer (YCC10 og SNU719) og en CRC (HCT116) cellelinje med taushet
CBS
ble behandlet med 5 uM av 5-aza-2′-deoksycytidin (aza) (Sigma) i tre dager, og fulgte med 100 nM trichostatin A (TSA, Cayman) for en dag som tidligere beskrevet [24]. Etter behandling, total DNA og RNA ble ekstrahert.
DNA Metylering Analyse
Alle DNA-prøver ble utsatt for sulfitt modifikasjon bruke EZ DNA Metylering Kit (Zymo Research) i henhold til produsentens instruksjoner. Ett pg av genomisk DNA fra hver prøve ble bisulfitt konverterte og eluert i 18 ul elueringsbuffer, og 5 ul av hver prøve ble analysert med Illumina infinium DNA-metylering analyse ved hjelp av Menneskelig Methylation45 BeadChip (infinium Metylering 450 K, Illumina), som er en allel-spesifikk analyse med 480000 CpG loci som dekker hele genomet [25]. Protokollene og sonde informasjon er tilgjengelig på www.illumina.com. Resultatene av DNA-metylering analysen ble samlet for hvert locus ved bruk av Illumina Bead Studio programvare (Illumina) og er rapportert som beta (p) verdier som er DNA-metylering poengtall i området fra 0 til 1, noe som reflekterer den fraksjonelle DNA-metylering nivå av et enkelt CpG stedet [25].
Semi-kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT-PCR)
RT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [9], ved hjelp av
GAPDH
som kontroll. Primerne for
CBS
er oppført i tabell 1. PCR-programmet anvendes en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, 35 sykluser (94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s), og en avsluttende utvidelse skritt ved 72 ° C i 10 min.
KRAS
mutasjonsdeteksjons av real-time PCR
De syv hotspot mutasjoner i kodon 12 og 13 av
KRAS
genet ble undersøkt ved hjelp av human
KRAS
Mutation Kvalitativ Detection Kit (ACCB Biotech Ltd.). Fluorescerende prober ble designet spesielt oppdage 7 ulike punktmutasjoner (G12V /S /R /D /A /C og G13D). Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll ved hjelp av MX3000P real-time PCR-system (Stratagene). Nærvær eller fravær av mutasjoner ble bestemt kvalitativt fra fluorescensen amplifikasjonskurve.
bisulfitt Behandling og Metylering-spesifikke PCR (MSP) Analyse
bisulfitt modifikasjon av DNA ble utført som beskrevet tidligere ved bruk av 2.4M natriummetabisulfitt [26]. MSP ble utført som tidligere beskrevet [9]. MSP primere er oppført i tabell 1. MSP PCR-primer spesifisitet ble bekreftet som de ikke forsterke ikke-bisulfitt-behandlede genomiske DNA-templater. De MSP produkter av utvalgte prøver ble bekreftet ved direkte sekvensering.
Statistical Analysis
χ
2 tester ble brukt til å analysere mulige sammenhenger mellom kliniske parametre,
KRAS
mutasjon og
CBS
metylering status for tumorprøver. Alle analyser ble utført ved anvendelse av SPSS for Windows.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Identifikasjon av
CBS
som Hypermethylated Gene i CRC
analysert svulst og nærliggende vev fra fire kinesiske CRC tilfeller ved hjelp av Illumina metylering matrise som skjermen for 480.000 CpG
loci
dekker hele genomet. Blant alle CpG områder som ble hypermethylated i tumorprøver (data ikke vist), fire CpG områder som ligger var i
CBS
genet (figur 1A). Analyse av genomisk sekvens av
CBS
genet, avslørte at den antatte promoter, exon 1 og intron 1 var en typisk CGI og dermed utsatt for epigenetisk lyddemping (figur 1A) [27].
En
, prinsippskisse av
CBS
promoter CpG island (CGI), med ekson 1 (sort rektangel), CpG nettsteder (korte vertikale linjer), MSP region vises. Transkripsjonsstartsetet er angitt med en buet pil. De fire CpG områder som ligger i
CBS
genet region identifisert av Illumina metylering array å bli betydelig hypermethylated i tumor sammenlignet med ikke-tumorvev (CT /CN) er vist.
B
, Expression of
CBS
lett ble oppdaget i normalt vev.
C
, Expression og metylering av
CBS
i kreftcellelinjer ble undersøkt ved RT-PCR og MSP, med
GAPDH
som en kontroll. M, denaturert, U, unmethylated.
Hyppig stanse av
CBS
av arrangøren Metylering i flere CRC og magekreft cellelinjer
Tidligere
CBS
har vist seg å være sterkt uttrykt i hjernen, så vel som lever, bukspyttkjertel, nyre og føtale vev [13]. For ytterligere å undersøke sammenhengen mellom
CBS
metylering og mRNA uttrykk, må vi først undersøkt et panel av normale menneskelige vev ved semikvantitativ RT-PCR. Våre resultater viste at
CBS
ble uttrykt i alle normale vev inkludert tykktarm, endetarm og mage, men på forskjellige uttrykk nivåer. Den høyeste uttrykk nivået ble funnet i bukspyttkjertelen og luftveiene vev (strupehodet, luftrøret og lungene), mens lav uttrykk var i beinmarg vev (figur 1B).
Til kontrast
CBS
uttrykk i normal vev til ondartede celler, analyserte vi gastrointestinale tumorcellelinjer. Semikvantitativ RT-PCR viste at
CBS
uttrykk ble redusert eller brakt til taushet i 56,3% (9/16) av magekreft og 75,0% (3/4) av CRC cellelinjer (figur 1C).
CBS
metylering status ble også analysert ved MSP i disse cellelinjene. Vi fant at cellelinjer med redusert eller taushet
CBS
uttrykk hadde metylert arrangører, mens ingen metylering ble funnet i normal
CBS
uttrykk cellelinjer (figur 2B) som indikerer at
CBS
promoter metylering er en viktig mekanisme for transkripsjonen stanse av dette genet i de fleste av de undersøkte CRC og mage kreft cellelinjer.
en
, Farmakologisk eller genetisk demetylering bruker Aza med TSA induserer
CBS
uttrykk i denaturert og forstummet cellelinjer. A + T: Aza og TSA behandling.
B
, representant MSP resultatene av
CBS
metylering i grunnskolen magekreft (GC) og tykktarmskreft (CRC). U: MSP for unmethylated promoter, M:. MSP for metylert arrangøren
Restaurering av
CBS
Expression ved Farmakologisk og Genetic Demety
For å avgjøre om metylering formidler direkte reduksjon av
CBS
mRNA uttrykk, en metylert CRC (HCT116) og to denaturert magekreft (YCC10 og SNU719) cellelinjer ble behandlet med Aza, en DNA metyltransferase inhibitor, og TSA. Etter behandling,
CBS
ekspresjon ble gjenopprettet i denaturert cellelinjer sammen med en markert økning av unmethylated promotor alleler (figur 2A). Vi fant også at
CBS
kan bli reaktivert i HCT116
DKO CRC cellelinje som er genetisk demetylert gjennom dobbelt knockout av både DNMT1 og DNMT3B. Samtidig, unmethylated
CBS
alleler ble påvist i Aza-behandlet og HCT116
DKO celler, noe som indikerer at metylering av
CBS
arrangøren fører direkte til sin taushet i CRC og mage kreft.
Hyppig
CBS
Metylering i primær CRC og Gastric Svulster
Vi undersøkt videre tilstedeværelsen av
CBS
promoter metylering i 96 primær CRC og 20 mage kreftprøver bruker MSP analyse.
CBS
promoter metylering ble påvist i 30% av CRC (29/96) og 55% av mage svulster (11 av 20), men ble i enkelte tilfeller funnet i normal mage (1/20, 5%) eller kolon vev (0/17, 0%) prøver (figur 2B). Det var ingen signifikant sammenheng med
CBS
metylering med kjønn, alder eller svulst differensiering i CRC pasienter (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at hypermethylation av
CBS
promoter er en vanlig hendelse i CRC og mage kreft.
Korrelasjonen av
CBS
Metylering og
KRAS
Mutation i primær CRC Svulster
Vanlige mutasjoner av kodon 12 og 13 på ekson 2 av
KRAS
genet ble undersøkt i 96 primær CRC, der
CBS
metylering status var tidligere analysert (tabell 2).
KRAS
mutasjon ble påvist hos 45% (13/29) av
CBS
metylert og 24% (16/67) av
CBS
-unmethylated primære CRC indikerer en positiv korrelasjon mellom
CBS
metylering og
KRAS
mutasjoner (
P
0,05). Videre analyser viste ingen korrelasjon på
CBS
metylering og
KRAS
mutasjon med kreft tilbakefall /metastase i fase II CRC pasienter (tabell 2).
Diskusjoner
så vidt vi vet, er dette den første rapporten til å identifisere
CBS
som en metylert kandidat TSG i gastrointestinale kreftformer. Vi viste at
CBS
mRNA uttrykk var fraværende i flere kolorektal og mage kreft cellelinjer som følge arrangøren metylering. Videre
CBS
genet ble ofte metylert i CRC og mage kreftpasienter, og dermed tyder på at
CBS
fungerer som en TSG i CRC og magekreft blir ofte inaktivert ved metylering.
genet
CBS
, som ligger på kromosom 21q22.3, koder et viktig enzym som er involvert i transulfuration av homocystein produseres under metyl-gruppe metabolisme [27]. Spesielt,
CBS
mangel forårsaker økte plasmanivåene av metionin og redusert cystein nivåer [14], [28] som igjen er kjent for å korrelere med homocystinuri, hjerte- og karsykdommer og leverkreft [14], [21]. Den transulfuration veien forbinder metionin metabolisme til biosyntesen av cellulære redoks-kontrollerende molekyler slik som cystein, glutation, og taurin [18]. Cystein generert gjennom transulfuration sti avgjør cellulære redoks-kontrollerende molekyl nivåer, for eksempel glutation og taurin å beskytte celler mot reaktive arter indusert skade [29] av DNA gjennom base og sukker modifikasjoner, basefrie områder, DNA-protein tverrbindinger og strand leiligheter [30], [31]. Dermed downregulated uttrykk for
CBS
kan svekke produksjonen av glutation og dermed tilrettelegge tumorigenesis [16]. I tillegg stimulerer redox ubalanse proteinkinase og poly (ADP ribosylering) reaksjonsveier som fører til hemming av apoptose og resulterer i nekrotisk celledød, etterfulgt av inflammatoriske responser og tumorutvikling [32]. Det er noen studier som har vurdert sammenhengen mellom ondartet svulst mottakelighet og polymorfismer i
CBS
genet (844ins68) i CRC [19], [33] men ikke i spiserøret eller magekreft [15]. I tillegg
CBS
844ins68 polymorfisme er assosiert med redusert overlevelse i hode og nakke plateepitelkreft [34].
I tillegg til tap av
CBS
uttrykk kan føre til akkumulering av homocystein, som vil bli resirkulert til metionin ved metionin systhase via remetylering veien [14]. Som metionin virker som kilde for metylgruppedonor for DNA-metylering, dens økning forårsaket av manglende
CBS
ekspresjon kan dysregulate DNA-metylering. Våre resultater viste hyppig metylering av
CBS
i gastrointestinale kreftcellelinjer og primære svulster. Således undertrykkelse av
CBS
av promoter metylering, i stedet for genetiske forandringer, vil også resultere i en forstyrrelse av metyl-gruppe metabolisme og bidrar til kreftutvikling med økt DNA-skade av oksidativt stress, svekke antioksidant kapasitet, og dysregulating DNA metylering. Men
CBS
metylering var ikke assosiert med tilbakefall i vår kohort av pasienter med stadium II CRC. Vi foreslår at større kohorter av pasienter er nødvendig å studere dette potensialet sammenheng med tilstrekkelig statistisk styrke.
Den prognostiske verdien av
KRAS
mutasjoner hos pasienter med CRC fortsatt kontroversielt. En studie av Roth
et al.
Antydet at prognostisk verdi for
KRAS
mutasjonsstatus for PFS og OS manglet hos pasienter med stadium II og III resected tykktarmskreft [35]. Imidlertid har det blitt rapportert at stadium III pasienter har
KRAS
mutasjoner vises betydelig verre sykdomsfri overlevelse sammenlignet med de som har villtype
KRAS product: [36]. Enda viktigere, har få studier differensiert
KRAS
mutasjoner i kodon 12 fra dem ved kodon 13 med hensyn til clinicopathological funksjoner og overlevelse [37] – [40]. I denne studien, kan vi ikke identifisere
KRAS
mutasjonsstatus som en prognostisk faktor for tilbakefall eller metastaser hos pasienter med stadium II resected CRC. I stedet fant vi at
CBS
metylering var signifikant assosiert med
KRAS
mutasjoner. Denne funksjonen er i tråd med en tidligere rapport som viser at CpG island methylator fenotype (CIMP) er assosiert med
KRAS
mutasjoner [41].
I sammendraget, er fremtredende funn fra denne studien at
CBS
er undertrykt av arrangøren metylering i tykk- og mage kreft. Vi fant ut at metylering-mediert stanse av
CBS
kan reverseres ved genetisk eller farmakologisk demetylering, noe som tyder på at
CBS
fungerer som en tumor suppressor i disse krefttypene. Dereguleringen av
CBS Hotell og sin tilknytning til en ondartet svulst fenotype kan assosieres til den avgjørende rollen CBS i metionin metabolisme og vedlikehold av intracellulære redoks homeostase. Vår studie garanterer videre analyse av
CBS
som en epigenetisk biomarkør for molekylær diagnostikk av CRC og magekreft.
Takk
Vi takker Professorene Qian Tao og Jing Wang for nyttig kommentarer og teknisk support og Drs Sergio Rey og Yuan Qiao for kritisk redigering for dette manuskriptet. Vi takker også Dr. Bert Vogel for HCT116
DKO cellelinje og Dr. Keith Robertson for DNA-prøver av noen CRC cellelinjer.
