Abstract
Aberrant Wnt signalisering er implisert i en rekke humane kreftformer, og å forstå virkningene av moduleringen av spredningsveier elementer kan føre til utvikling av nye terapeutiske midler. Uttrykk av utskilt frizzled relatert protein 4 (SFRP4), et ekstracellulært modulator av Wnt signalveien, er gradvis tapt i mer aggressive eggstokkreft fenotyper. Her viser vi at rekombinant SFRP4 (rSFRP4) behandling av en serøs eggstokkreft cellelinjen resultater i hemming av β-catenin avhengige Wnt signal målt ved TOP /FOP Wnt reporter analysen og redusert transkripsjon av Wnt målgener, Axin2, CyclinD1 og Myc. I tillegg rSFRP4 behandling økt betydelig evne eggstokkreft celler til å overholde kollagen og fibronectin, og redusert evne til å migrere over en påført sår. Vi konkluderer med at disse endringene i celle atferd kan være mediert via mesenchymale til epitel overgang (MET), som rSFRP4 behandling førte også til økt uttrykk av epitel markør E-cadherin og redusert uttrykk for vimentin og Twist. Til sammen indikerer disse resultatene at modulering av en enkelt oppstrømsgatekeeper av Wnt signalering kan ha en innvirkning på nedstrøms Wnt signalering og eggstokk-kreft-celle oppførsel, som formidles gjennom epiteliale til mesenchymal plastisitet (EMP). Dette øker muligheten for at SFRP4 kan brukes både diagnostisk og terapeutisk i ovarialcancer
Citation. Ford CE, Jary E, Ma SSQ, Nixdorf S, Heinzelmann-Schwarz VA, Ward RL (2013) The Wnt Gatekeeper SFRP4 modulerer EMT, cellemigrasjon og Nedstrøms Wnt Signale i Serous eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (1): e54362. doi: 10,1371 /journal.pone.0054362
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 26. juli 2012; Akseptert: 11. desember 2012; Publisert: 11 januar 2013
Copyright: © 2013 Ford et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert delvis med tilskudd fra Cure Cancer Australia Foundation (# 1008633, CEF), National Health and Medical Research Council CJ Martin Fellowship (# 466005, CEF), Cancer Institute NSW (# 09 /CRF /2-02, VHS) William Maxwell Trust (VHS) og den australske og New Zealand College of Fødselsleger og Gynekologer (VHS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer har høyest dødelighet av alle kvinnelige gynekologisk kreft [1], [2]. Til tross for nylige innsikt i den heterogeniteten av denne sykdom [3] – [6], og en diskusjon over cellen opprinnelses [7], [8], de epiteliale kreftpasienter ovarian får samme systemisk behandling (karboplatin, Paclitaxel [5] . Videre forskning i de molekylære reaksjonsveier ligger til grunn for denne sykdommen er nødvendig for å identifisere nye tumor-markører og mål for terapeutisk intervensjon Et reaksjonsvei som er blitt identifisert som av potensiell betydning i eggstokkreft er Wnt signalveien [9] -. [11 ].
Wnt signalveien er en viktig utviklingsveien involvert i differensiering, polaritet, migrasjon, invasjon, heft og overlevelse [12]. Disse samme cellulære prosessene er viktige komponenter i tumorgenesen og metastasering, og dermed rollen av Wnt signal i kreft hos mennesker er i økende grad undersøkt sammen med terapeutiske strategier for å målrette sti komponenter. dysregulering av Wnt signalveien har vært innblandet i en rekke kreftformer, inkludert de med høy forekomst og /eller dårlige resultater som kolorektal, bryst, eggstokk, og prostatakreft (oversikt i [13]).
Dette mangesidige signaleringsnett er tradisjonelt forenkles ved å dele den inn i nettverket kanoniske (β-catenin avhengig) og ikke-kanoniske (β-catenin uavhengige) veier. Kanonisk Wnt signalering involverer binding av Wnt ligand til en ti frizzled reseptorer (Fzd) i nærvær av en lav tetthet lipoprotein-reseptor-relatert protein (LRP) ko-reseptoren. Dette genererer en kaskade av hendelser som førte til demontering av Axin /APC /GSK3p ødeleggelse kompleks og stabilisering av β-catenin. Akkumulering av β-catenin i cytoplasma resulterer i translokasjon til kjernen og TCF /LEF formidlet aktivering av målgener som er involvert i celledifferensiering og proliferasjon. Nøkkel nedstrøms mål aktivert kanoniske Wnt signal inkluderer C-myc (
MYC
), CyclinD1 (
CCND1
) og Axin2 (
AXIN2
) [12].
wnt veien er regulert på flere nivåer, med wnt antagonister eller «gatekeeper proteiner» som får oppmerksomhet de siste årene, på grunn av deres hyppige inaktivering i kreft. Denne gruppen av Wnt modulatorer omfatter Dickkopf familien (DKK1-4), WIF-en og familien til utskilte frizzled reseptor proteiner (SFRP1-5). SFRPs er oppløselige ekstracellulære proteiner preget av sin frizzled lignende cystein rik domene (CRD), som antas å være ansvarlig for deres evne til å modulere Wnt signal ved å binde seg direkte til Wnt ligander eller frizzled reseptorer. SFRPs har blitt vist å fungere som tumor-suppressorer i andre krefttyper [14] – [17]. Vi har tidligere vist at en av disse portvakter, SFRP4, utskilles i blodet og gradvis mistet i mer aggressive eggstokkreft fenotyper, slik som Type II kreft [18]. Videre pasienter mangler SFRP4 uttrykk hatt en dårligere prognose enn de som uttrykker SFRP4 [18].
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er en viktig utviklingsprosess at kreftceller kapre å øke sin aggressivitet og invasive potensiell [19] . Selv komplekse, og celletype bestemt, kan cellene gjennomgår EMT generelt være preget av tapet av E-cadherin og gevinst på vimentin, Twist og Snail. Overgangsprosessen kan også forekomme i motsatt retning (mesenchymale til epitel overgang (MET).) Det er nå enighet om at MET er av like stor betydning i organogenesen og metastasering, og at mange mellomliggende eller «metastabile» celle stater eksistere som celler overgang mellom de to ytterpunktene [20], [21]. Denne dynamiske prosess har blitt kalt epiteliale til mesenchymale plastisitet, eller EMP. Mange signalveier har vært knyttet til EMP, særlig TGF β, Notch og Wnt trasé.
I denne studien undersøker vi de funksjonelle effekter av modulering av en nøkkel Wnt vei gatekeeper, SFRP4 på Wnt signalering, celle atferd og EMT. Vi rapporterer for første gang at gjen uttrykk for SFRP4 i en epitelial eggstokkreft cellelinje hemmer Wnt signal, øker vedheft, hemmer cellemigrasjon og hemmer EMT. Siden SFRP4 uttrykk har vist seg å være tapt i et stort flertall av eggstokkreft pasienter [18], øker dette muligheten for at modulering av Wnt signalering gjennom SFRP4 eller andre oppstrøms Wnt pathway medlemmer kan representere en ny vei for målrettet terapi i eggstokkreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
menneske~~POS=TRUNC serøs ovarialcancer OVCAR3 celler hentet fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ble dyrket i RPMI inneholder 10% føtalt kalveserum. Mediet ble supplert med penicillin /streptomycin (90 enheter /ml penicillin, 90 ug /ml streptomycin) og 1,8 mM Glutamax (Life Technologies). Alle celler ble dyrket i en fuktig atmosfære med 5% CO
2, ved 37 ° C og ble vist å være fri for mycoplasma forurensning.
Wnt reporter analyser
OVCAR3 celler ble sådd ved en konsentrasjon på 5000 celler /brønn på hvit bunn 96-brønners plater. Celler ble serumsultede natten og co-transfektert med 0,2 mikrogram av enten TOPflash (3 × TCF4 bindingssteder) eller FOPflash (3 × muterte TCF4 bindingsseter) ekspresjonsplasmider (Millipore, Temecula, CA, USA), og 0,1 pg PRL-TK (Renilla-luciferase TK-vektor, Promega) som en kontroll, ved hjelp av Lipofectamine2000. Celler ble deretter behandlet med økende doser av rSFRP4 og /eller rekombinant Wnt3 en (rWnt3 en 0,1 ug /ml) i 48 timer før luciferase-aktivitet blir målt ved hjelp av en Glomax 96 Microplate luminometer (Turner Biosystems instrument, Sunnyvale, CA, USA). Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert for transfeksjonseffektivitet ved å dividere med den Renilla luciferaseaktivitet. TOP /FOP-forholdet ble anvendt som et mål på β-catenin drevet transkripsjon. Gjennomsnittlig aktivitet og standardavvik ble utledet fra octopulate transfektert prøver.
Kvantitativ revers-transkriptase PCR (qPCR)
Etter DNAse behandling, en mikrogram total RNA ble transkribert til cDNA ved hjelp av Quantitect RT kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Kontroller som inneholder RNA, men uten revers transkriptase ble inkludert for alle prøver. qPCR ble utført i tre eksemplarer på en Stratagene MxPro 3005 P maskinen med 25 ng av cDNA mal og SYBR grønn /Rox mester mix (Qiagen). Expression var normalisert til tre ulike husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA) ved hjelp av Vandesompele normalisering metoden [22]
Primer sekvenser som brukes for qPCR var SFRP4. Forover (F) 5 «TGTGTTACGAGTGGCG 3», reverse ( R) 5 «GGGGGATTACTACGACTG 3», CDH1: F 5 «AGGCCAAGCAGCAGTACATT 3» R 5 «ATTCACATCCAGCACATCCA 3», VIM F 5 «CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC 3» R 5 «GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA 3», TWIST F 5 «GCCAATCAGCCACTGAAAGG 3» R 5 «TGTTCTTATAGTTCCTCTGATTGTTACCA 3» , AXIN2 F 5 «TCAAGTGCAAACTTTCGCCAACC 3» R 5 «TAGCCAGAACCTATGTGATAAGG 3», MYC F 5 «CGTCTCCACACATCAGCACAA 3», R5 «CACTGTCCAACTTGACCCTCTTG 3», CCND1 F 5 «GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3» R 5 «TGGCACAAGAGGCAACGA 3», JNK F 5’TCTGGTATGATCCTTCTGAAGCA 3 «R 5» TCCTCCAAGTCCATAACTTCCTT, RHOA F 5 «GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT 3» R 5 «GGCTGTCGATGGAAAAACACAT 3», Rac1 F 5 «TGTAGTCGCTTTGCCTATTGATG 3» R 5 «CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3», PRKCA F 5 «GCTTCCAGTGCCAAGTTTGC 3» R 5 «CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3», SDHA F 5 «CTTGAATGAGGCTGACTGTG 3» R 5 «ATCACATAAGCTGGTCCTGT 3», HSPCB F 5 «TCTGGGTATCGGAAAGCAAGCC 3» R 5 «GTGCACTTCCTCAGGCATCTTG 3», YWHZA F 5 «ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3» R 5 «CCGCCAGGACAAACCAGTAT 3».
Western Blot
Cellelysater ble fremstilt ved å lysere cellene i lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM natriumortovanadat, 50 mM natriumfluorid, 0,27 M sukrose, 1 x komplett protease-inhibitor (Roche, Basel, Switzerland)). Lysatene ble sentrifugert, og supernatanten ble samlet opp for proteinkonsentrasjonsanalyse ved hjelp av BCA-kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Atomprotein lysater ble fremstilt ved lysing av celler i iskald Nuclei buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA og 0,5% NP-40, proteasehemmere) og inkubering på is i 10 minutter . Cellekjernene ble utvunnet ved sentrifugering ved 900 g i 3 minutter, vasket i kjerner vaskebuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 og 0,1 mM EDTA inneholdende proteaseinhibitorer) og resuspendert i lyseringsbuffer. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. For Western blotting, antistoffer mot SFRP4 (ab32784, Abcam, Cambridge, MA, USA), E-cadherin (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), vimentin (# 5741, Cell Signaling Technology), Twist (# sc15393, ble Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), β-catenin (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), Histone H3 (# 9715s, Cell Signal) og α-Tubulin (# 3873, Cell Signaling Technology) som brukes. Proteinbånd ble påvist og kvantifisert ved hjelp av bilde Quant LAS 4000 (GE Healthcare).
Migrasjon analyser
OVCAR3 celler ble sådd ut på IBIDI Kultur-Setter (IBIDI GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried , Tyskland) og ble behandlet i 24 timer med rSFRP4 (5 ug /ml). IBIDI inserts ble fjernet og lukking av den resulterende såret ble overvåket i løpet av de neste 48 timene. Bilder av såret ble tatt ved ulike tidspunkt ved hjelp av Leica DMIL mikroskop system (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).
Adhesjonstester analyser
vevskulturplater ble belagt med løsninger av 10 mikrogram /ml type i kollagen (Sigma, Castle Hill, Australia), 5 mg /ml fibronektin (Millipore, Bedford, MA, USA) eller 3% BSA i PBS og ble inkubert over natten ved 37 ° C. Platene ble skylt med 80% etanol, inkubert i 3% BSA i serumfritt medium i 30 minutter ved 37 ° C og skylles igjen med PBS. Cellesuspensjoner ble tilsatt til de belagte plater og tillatt å følge i 4 timer ved 37 ° C. Plater ble forsiktig vasket med PBS, fiksert med 96% etanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Overskudd av flekken ble fjernet ved omfattende vasking av platene med sterilt vann. Etter platene hadde tørket ble cellene lysert med 50% eddiksyre og absorbans ble avlest ved 595 nm ved hjelp av en SpectraMax Plus384 absorbans mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistikken ble utført ved hjelp av en to-tailed students t-test. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001
diskusjon
Resultater og br >
SFRP4 hemmer Wnt signal i en serøs eggstokkreft cellelinje
Etter på fra vår tidligere arbeid indikerer at SFRP4 tap var en hyppig hendelse i ovarialcancer [18] vi bestemt om tilsetting av humant rekombinant SFRP4 (rSFRP4)
in vitro
kunne hemme β-catenin avhengige Wnt signalering. Vi valgte serøs eggstokkreft cellelinje OVCAR3 for disse eksperimentene som det mangler noen påviselig SFRP4 uttrykk og ble tidligere rapportert å vise konstituerende Wnt signal (som dokumentert av opphopning /nærvær av kjernefysisk β-catenin, [23]). Stimulering av OVCAR3 celler med rekombinant Wnt3a (rWnt3a) resulterte i en signifikant økning i β-catenin avhengig Wnt signalering, målt ved hjelp TOP /FOP FLASH luciferase reporter Wnt analysen (figur 1A), noe som bekrefter at det var faktisk en Wnt responsiv cellelinje. Vi testet deretter økende konsentrasjoner av rSFRP4, og fant at 5 ug /ml rSFRP4 var nødvendig for å inhibere β-catenin avhengig Wnt signalering (figur 1A). Denne konsentrasjonen av rSFRP4 ble også vist å hemme proteinnivåer β-catenin i kjernen (figur 1B). Denne konsentrasjonen ble deretter anvendt for alle påfølgende eksperimenter.
(A) OVCAR3 celler ble ko-transfektert med PRL-TK (Renilla) og enten TOPflash eller FOPflash ekspresjonsplasmider. Celler ble deretter behandlet med økende doser av rSFRP4 og /eller rekombinant Wnt3 en (rWnt3a 0,1 ug /ml) i 48 timer før luciferase-aktivitet blir målt ved anvendelse av en Microplate Glomax 96 luminometer. Gjennomsnittlig aktivitet og standardavvik ble utledet fra octopulate transfekterte prøver. Resultatene representerer gjennomsnittet av 3 eksperimenter og Stolpene representerer standardavviket (s.d) av gjennomsnittet. *
P
0,05. (B) Representative immunoblot som viser øket SFRP4 og redusert atom β-catenin protein ekspresjon i OVCAR3 celler etter 72 timers behandling med rSFRP4 (5 ug /ml). Topplate SFRP4 uttrykk (SFRP4, ab32784, Abcam, Cambridge, UK), andre felt α-tubulin uttrykk (α-tubulin # 3873, Cell signale Technologies, Danvers, MA, USA), tredje panel kjernefysisk β-catenin (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), bunnpanelet Histone H3 (# 9715s, Cell Signal). (C) Densitometrisk analyse av SFRP4 protein ekspresjon i 3 separate eksperimenter. Barer representerer s.d av gjennomsnittet. *
P
0,05. (D) Relativ SFRP4 RNA-ekspresjon ble øket i OVCAR3 celler behandlet med rSFRP4 (5 ug /ml) i 48 timer. QRT-PCR ble utført i tre eksemplarer og normalisert til tre forskjellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA). Resultatene representerer et gjennomsnitt av 6 eksperimenter. Barer representerer s.d av gjennomsnittet. *
P
0,05. (E) Relativ ekspresjon av β-catenin uselvstendige wnt målgener ble redusert i OVCAR3 celler behandlet med rSFRP4 (5 ug /ml) i 48 timer. QRT-PCR ble utført i triplikat og normalisert til tre forskjellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA) ekspresjon av AXIN2, MYC og CCND1 ble redusert i rSFP4 behandlede celler, sammenlignet med kontrollgruppen. Resultatene representerer et gjennomsnitt på 4 forsøk og barer representerer s.d av gjennomsnittet. *
P
0,05. (F) Relativ ekspresjon av β-catenin uavhengige wnt målgener var uforandret i OVCAR3 celler behandlet med rSFRP4 (5 ug /ml) i 48 timer. QRT-PCR ble utført i triplikat og normalisert til tre forskjellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA) Ekspresjon av JNK, RHOA, Rac1 og PRK2A var uendret i rSFP4 behandlede celler sammenlignet med kontrollgruppen. Resultatene representerer et gjennomsnitt på 3 eksperimenter og barer representerer sd av gjennomsnittet.
Førti åtte timers behandling med rSFRP4 (5 mikrogram /ml) føre til en omtrentlig to gangers økning i SFRP4 mRNA og protein som tilsetning av ekstracellulære rekombinante proteiner wnt øker endogen proteinproduksjon. (Figur 1 B-D). Uttrykket av tre nedstrøms Wnt målgener CyclinD1 (CCND1), C-myc (MYC) og Axin2 (AXIN2) ble redusert etter rSFRP4 behandling (figur 1E). Men av disse 3 genene, ble bare AXIN2 uttrykk reduseres betraktelig (
P
= 0,03). I motsetning til CCND1 og MYC er AXIN2 vel akseptert som en bestemt Wnt mål genet, og hittil har ikke vært knyttet til andre signalveier [24] – [27]. Økt uttrykk for AXIN2 ble rapportert i alle serøs eggstokkreft pasienter i en fersk studie [10], noe som indikerer at avvik Wnt signal kan være mer utbredt i epitelial eggstokkreft enn tidligere antatt. Både MYC og CCND1 er kjent for å fungere i andre viktige signalveier innblandet i eggstokk karsinogenese [28] – [31] som kan forklare hvorfor de viste svakere uttrykk endringer enn AXIN2 i respons til SFRP4 behandling. Det er imidlertid å merke seg at tilsetningen av SFRP4 i vårt system var i stand til å redusere transkripsjonen av tre nedstrøms gener fra Wnt signalveien, men hadde ingen effekt på nedstrøms mål for den β-catenin uavhengig Wnt signalering (figur 1F) og heller på en oppstrøms-reseptor for veivalget (FZD7) og tre andre reseptorer (EGFR, ErbB3, AKT, data ikke vist).
kombinert disse innledende forsøk viser at tilsetningen av en enkel Wnt bane modulator kan modulere gen transkripsjon i en modell serøs ovarian cancer cellelinje. Basert på den øverste /FOP Wnt reporter-analyse, Western Blot og wnt mål-genet resulterer Våre data antyder også at i tilfelle av kreft i eggstokkene, betyr SFRP4 faktisk fungerer som en antagonist av den kanoniske eller β-catenin avhengig Wnt signalveien. Det viser seg også at SFRP4 ikke virke til å inhibere β-catenin uavhengig Wnt signalering, som fire målgener var upåvirket ved behandling med SFRP4. Dette er av interesse, da det er uklart på området Wnt signale nøyaktig som wnt ligander inhiberes av hvilke spesifikke medlemmer av SFRP familien, og enten det er i enkelte tilfeller SFRPs kan faktisk øke snarere enn å hemme Wnt signalering [32] – [34 ].
SFRP4 behandling redusert migrering og økt adhesjon av eggstokkreft celler
SFRP4 behandling hadde ingen virkning på celleformering (figur 2A), men i betydelig grad hemmet evnen til OVCAR3 celler til å migrere over en påført sår (figur 2B). Det ble også vist at tilsetning av SFRP4 øket evne til eggstokkreft celler til å følge kollagen og fibronektin belagt vevskulturplater (figur 2C). Disse dataene antyder at SFRP4 har evnen til å hemme metastatisk potensial for eggstokkreft celler
in vitro
, som passer med våre tidligere kliniske data rapporterer at pasienter uttrykker SFRP4 hatt bedre progresjon og total overlevelse sammenlignet med de som mangler SFRP4 uttrykket [18]. Det legger til økende bevis for at Wnt signalveien kan først og fremst spille en rolle i kreftmetastaser i stedet for kreft start.
(A) 24 timer rSFRP4 behandling (5 mikrogram /ml) hadde ingen effekt på cellen spredning, som målt via trypanblått celletelling ved hjelp av grevinne systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Resultatene representerer gjennomsnittet av 3 eksperimenter og stolpene representerer s.d av gjennomsnittet. (B) SFRP4 hemmet celle migrasjon. OVCAR3 celler ble sådd ut på IBIDI Kultur-innlegg, og behandlet i 24 timer med rSFRP4 (5 mikrogram /ml). IBIDI inserts ble fjernet og lukking av den resulterende såret ble overvåket i løpet av de neste 24 timene. Forsøket ble gjentatt tre ganger, og resultatene representerer gjennomsnittlig prosent av åpne sår og stolpene representerer S.D. **
P
0,01. (C) SFRP4 øket adhesjon til kollagen og fibronektin. SFRP4 (5 ug /ml, 48 timer) behandlede celler ble tillatt å holde seg i 4 timer ved 37 ° C i enten 10 ug /ml type I kollagen eller 5 pg /ml fibronektin, deretter vasket, lysert og absorbansen målt ved 595 nm ved å bruke den SpectraMax Plus384 Absorbance Micro Reader. Resultatene representerer gjennomsnittet av 6 eksperimenter og stolpene representerer s.d av gjennomsnittet. *
P
. 0,05
SFRP4 hemmer EMT i eggstokkreft celler
Som endringer i mobilnettet atferd er knyttet til EMT, vi også undersøkt om SFRP4 ville påvirke celle morfologi og uttrykk for den viktige EMT markører, E-cadherin (CDH1), vimentin (VIM), og Twist1 (TWIST1). Selv om ingen åpenbare endringer i cellen morfologi ble observert 48 timer etter SFRP4 behandling (figur 3A), behandling med rSFRP4 økt uttrykk av E-cadherin (figur 3B-D), og redusert uttrykk for vimentin og Twist (figur 3B-D) både transkripsjons og translasjonsforskning nivå, tyder på initiering av MET.
(A) SFRP4 behandling (5 mikrogram /ml, 48 timer) ikke fører til noen åpenbare endringer i cellen morfologi av serøs eggstokkreft cellelinje , OVCAR3 (10 x forstørrelse). (B) E-cadherin (CDH1) uttrykk ble betydelig økt, og vimentin og Twist redusert i SFRP4 (5 mikrogram /ml, 48 timer) behandlet OVCAR3 celler. QRT-PCR ble utført i tre eksemplarer og normalisert til tre forskjellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA). Resultatene representerer et gjennomsnitt av 6 eksperimenter og stolpene representerer s.d av gjennomsnittet. **
P
0,01, ***
P
0,001. (C) Representative immunoblot som viser økt CDH1, og redusert VIM og TWIST1 protein ekspresjon i OVCAR3 celler etter 72 timers behandling med rSFRP4 (5 ug /ml). Topplate CDH1 uttrykk (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), andre panel VIM uttrykk (# 5741, Cell Signaling Technology), tredje panel TWIST1 uttrykk (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ), og bunnfelt α-tubulin uttrykket (α-tubulin # 3873, Cell Signal Technology). (D) Densitometrisk analyse av CDH1, VIM og TWIST1 protein uttrykk i 3 separate eksperimenter. Barer representerer s.d av gjennomsnittet. **
P
0,01, *
P
. 0,05
EMT, som Wnt veien, er sterkest knyttet til utvikling, men nylig har fått stor interesse for sitt potensial som et mål for kreftbehandling. Generaliserte prosesser som skjer i alle kreftceller er et attraktivt avenue for kreftbehandling, som potensielle behandlinger vil ha utbredt anvendelse. I tillegg har avvikende Wnt signalering er sterkt knyttet til kreft med en dårlig prognose [12], [35], slik at ytterligere belysning av rollen til denne veien og dens naturlige portvakter vil gi viktig innsikt inn i human sykdom. Det har vært kjent i mange år at Wnt signalering kan påvirke kreftcellemigrering og adhesjon, og denne undersøkelsen gir noen bevis for at disse effektene kan bli ledet gjennom prosessen med EMT. Våre resultater gir støtte til en fersk undersøkelse knytte AXIN2 og EMT i kolorektal kreft [27]. I tillegg hypothesise vi at SFRP4 hemmer evnen til spesifikke ligander wnt til å binde seg til frizzled reseptorer. Basert på to tidligere studier, en som indikerer at Wnt7a er overuttrykt i eggstokkreft [11], og en som tyder SFRP4 kan hemme Wnt7a binding til Fzd5 i livmorkreft [36], spekulerer vi at under normale forhold SFRP4 binder og sequesters bort Wnt7a. Men i epitelial eggstokkreft, er SFRP4 forstummet, slik Wnt7a å binde Fzd5 og aktivere β-catenin avhengige Wnt signalering, og kjøre TCF /LEF mediert transkripsjon av Wnt reporter gener som AXIN2, MYC og CCND1.
Wnt signalveien er en svært kompleks og sammenvevd vei knyttet til mange menneskelige sykdommer. Ettersom veien er hovedsakelig involvert i embryogenese og voksen vev reparasjon, narkotika målrettet mot denne veien ikke forventes å forårsake betydelige bivirkninger eller toksisitet [37]. Men forsøk på å målrette Wnt signalveien i kreft har vært stort sett mislykket, uten klinisk godkjente legemidler til dags dato. Dette kan være på grunn av valg av narkotika mål bosatt lenger ned i Wnt signalveien (nylig anmeldt i [38]). Tallrike studier har nå rapportert inaktivering av oppstrøms komponenter av Wnt pathway in cancer, inkludert medlemmer av SFRP og DKK familier, som indikerer en nøkkelrolle for disse gatekeeper proteinene i onkogenesen [14] – [17], [34], [39] . Disse ekstracellulære proteiner har også sterk potensial som narkotika mål på grunn av sin oppstrømsposisjon i veien. Denne artikkelen viser potensialet av oppstrøms veien modulering ved hjelp av en enkelt Wnt antagonist. Ettersom det er minst ti ekstracellulære antagonister av Wnt veien i dag identifisert, kombinasjoner av disse kan gi enda sterkere effekter [40] og er verdig til videre utforskning.
