Abstract
Chrysotile er en av de seks typer asbest, og det er den eneste som fortsatt kan kommersialiseres i mange land. Eksponering for andre typer av asbest har vært forbundet med alvorlige sykdommer, slik som lungekarsinomer og pleural mesotheliomas. Foreningen av chrysotile eksponering med sykdom er kontroversielt. Men
in vitro
studier viser mutagene potensialet i chrysotile, som kan indusere DNA og celleskader. Foreliggende arbeid rettet for å analysere endringer i lunge småcellet karsinom kulturene etter 48 timer av krysotil eksponering, etterfulgt av 2, 4 og 8 dager av utvinning i fiberfritt kulturmedium. Noen endringer, slik som aneuploid celledannelse, ble det observert øket antall celler i G2 /M fase og celler i mitose multipolar selv etter 8 dager med utvinning. Tilstedeværelsen av krysotiltypen fibre i cellekulturer ble påvist og cellemorfologi ble observert ved laser scanning konfokal mikroskopi. Etter 4 og 8 dager for utvinning, bare noen få krysotiltypen fragmenter var tilstede i noen celler, og den cellulære morfologi var lik den for kontrollceller. Celler transfektert med GFP-merket α-tubulin plasmid ble behandlet med chrysotile i 24 eller 48 timer og celler i multipolar mitose ble observert av time-lapse mikroskopi. Skjebnene til disse cellene ble etablert: oppbevaring i metafase, celledød, progresjon gjennom M fase genererer mer enn to datterceller eller cellefusjon under telophase eller cytokinese. Noen av dem var knyttet til dannelsen av aneuploide celler og celler med unormalt antall centrosomes
Citation. Cortez BDA, Quassollo G, Caceres A, Machado-Santelli GM (2011) The Fate of Chrysotile-Induced multipolar mitose og Aneuploid Befolkning i Cultured lungekreft celler. PLoS ONE 6 (4): e18600. doi: 10,1371 /journal.pone.0018600
Redaktør: Robert Qi, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong
mottatt: 30 november 2010; Godkjent: 07.03.2011; Publisert: 05.04.2011
Copyright: © 2011 Cortez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Brasil og med tilskudd fra Agencia Córdoba Ciencia og MINCyT (PICT 815 og PME), Argentina. BAC var en kar fra Røde de MacroUniversidades de America Latina y el Caribe, under sitt opphold i Argentina. GQ er en doktorgradsstipendiat av FONCyT (Argentina). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Asbest er et silikat mineral delt i to store grupper – serpentiner og amphiboles. Amfibol fibre ble ofte brukt i kommersielle programmer til foreningen av amfibol eksponering med flere alvorlige sykdommer, som asbestose, bronkial kreft og ondartet mesothelioma av pleura og peritoneum [1], [2]. Foreløpig kan amfibol fiber ikke brukes i mange land og har blitt erstattet av chrysotile, en serpentin asbest som regnes som mindre skadelig for menneskers helse.
Chrysotile består av buede silkefibre med en liten tverrsnitt (80 til 130 Å) og en rørformet struktur. Dens avstand fra lungevev er raskere enn den av amfibol fibre, og krysotil akkumuleres ikke i lungene på grunn av en mekanisme som involverer fragmentering av fibrene i korte stykker [3].
Mekanismene som fører til utvikling av sykdommer som karsinomer og mesotheliomas etter eksponering for asbest er ikke godt forstått. Imidlertid har de mutagene og cytotoksiske effekter av asbest blitt vist i studier ved bruk av dyrkede celler eksponert for forskjellige asbestfibre i tidsrom varierende fra 1 time til 72 timer.
Eksponering av dyrkede celler til asbest fører til dannelse av oksyradikaler og frie radikaler som skader DNA [4], [5], [6]. Det er blitt vist at eksponering av dyrkede celler til krysotil kan forårsake dobbeltstrengbrudd i DNA etter 3 og 24 timer [7], [8] og kan også føre til intrachromosomal slettinger og DNA mutasjoner [9]. Krysotil-indusert DNA-skade kan utløse apoptose i forskjellige celletyper etter 3 til 4 timer etter eksponering [8], [10].
Mikrokjerner blir også observert etter behandling krysotil [11]. Disse kromatin organer, som inneholder et asentrisk kromosom fragment eller et helt kromosom som løsrevet fra metafase plate, kan genereres etter kromosombrudd og mitotiske forstyrrelser, som for eksempel multipolar spindler. Derfor dataene tyder på at chrysotile kan forårsake DNA kjedebrudd og forstyrre mitosetråder.
Cell syklus forstyrrelser i celler eksponert for chrysotile ble undersøkt ved flowcytometri, og ble observert komplekse endringer. Celler behandlet med krysotil i 4 til 48 timer viste G2 /M oppbevaring og et redusert antall S-faseceller, identifisert av BrdU-inkorporering [12].
Mitotisk divisjon følgende asbest eksponering ble også observert av time-lapse og konfokalmikroskopi. Noen endringer ble funnet, for eksempel defekter i spindeldannelse og svikt av cytokinese i nærvær av internaliserte fibre. Disse forsøk viser at lange fibre kan være plassert mellom dattercellene ved telophase og føre til svikt cytokinese, genererer multinucleated og aneuploide celler [13], [14]. Lignende resultater ble observert i celler eksponert for karbon nanorør. Disse cellene viste forstyrrelser av centrosomes og mitosetråder som tyder på at nanorør kan forstyrre mikrotubuli og motor proteiner [15].
aneuploid celler er karakterisert ved unormal DNA innhold på grunn av tap eller gevinst på hele kromosomer eller deler av kromosomer, og et flertall av faste tumorer inneholde aneuploide celler [16], [17], [18]. Aneuploidy kan skyldes feil i cellesyklusen, feil i mitotiske sjekkpunkter som gjør at DNA skade eller replikering feil å bli gitt videre til datterceller, feil i kromosom segregering og cytokinese, som kan oppstå på grunn av sentrosomen forsterkning og dannelsen av multipolar spindler [19 ].
i 1914, Boveri sitert Aneuploidy som en årsak til kreft, men den etterfølgende oppdagelsen av onkogener og tumorsuppressorgener ført til en ny teori, karakterisert ved at akkumuleringen av mutasjoner i slike gener var årsaken til malign transformasjon [20]. Diskusjonen har fortsatt, og for tiden Aneuploidy regnes for å være involvert i tumorprogresjon, undertrykkelse eller initiering [21], [22], [23]. Det er imidlertid klart at Aneuploidy kan innføre mutasjoner som gir opphav til malign transformasjon og fører til genetisk ustabilitet [24].
Den foreliggende arbeid fokuserer på dannelsen av aneuploide celler etter eksponering for tre ulike konsentrasjoner av krysotiltypen fibre etterfulgt av lange utvinning ganger i fiber-fritt medium. Vi analyserte cellesyklusforstyrrelser som kan være involvert i celle aneuploid formasjon, ved å sammenligne endringer ble funnet i normale og kreftceller eksponert for krysotil. Multipolar mitoser ble også spores for å bestemme skjebnen til disse cellene og deres bidrag til aneuploid celle formasjon.
Materialer og metoder
Cell Kultur
HK2 celler (en cellelinje etablert fra humant ikke-småcellet lungekarsinom) [25] og Vero-celler (en epitelial linje som stammer fra grønn ape nyre – ATCC nummer CCL-81) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles Minimum Essential Medium (Sigma), supplert med 10% føtalt bovin serum, i en fuktig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C.
Chrysotile Behandling
Chrysotile 5R (Quebec Standard) hentet fra SAMA Mineração de Amianto Ltda (Minaçu, GO, Brasil) ble vennlig levert av Dr. Flavia M. Cassiola. Fibrene ble vasket med vann fra springen og aktivert ved sonikering ved kontrollert pH (7,4) som beskrevet andre steder [26]. For behandling, ble cellene enzymatisk fjernet fra kolbene og belagt i diameter retter 35 mm (2,10
5 celler /skål). Etter 24 timer i kultur ble mediet endret til 2 ml ferskt medium med krysotiltypen fibrene ved en tilnærmet sluttkonsentrasjon på 250 ug /ml, 125 pg /ml eller 62,5 ng /ml, område som er lavere enn de fleste
in vivo
studier (10-17 mg /m
3). Fibrene forble i kontakt med cellene i perioder på 24 timer eller 48 timer, hvoretter mediet ble endret. Etter flere perioder på 2, 4 eller 8 dager i normale mellom celler ble vasket med fosfatbufret saltløsning (PBSA) og fikseres. Under hele behandlingen kulturmediet var supplert med 10% føtalt bovint serum, og endret etter 2 dager under utvinning tid.
DNA kvantifisering
nukleær DNA innhold av krysotiltypen behandlede og kontrollcellene HK2 ble kvantifisert ved bildeanalyse med programvare CIRES (Cell Bilde Retrieval and Evaluation System-Kontron Eletronik) installert i Axioskop mikroskop (Zeiss). For analysen ble kjerner farget av Feulgen reaksjon [16]. Krysotil behandlinger ble utført ved anvendelse av tre forskjellige fibre konsentrasjoner (250 ug /ml, 125 ng /ml, 62,5 ug /ml), og etter 48 timers behandling ble anvendt tre forskjellige tider for utvinning i fiberfritt kulturmedium: 2, 4 og 8 dager. Fire hundre kjerner av mononukleærerte, binucleated og multinucleated ble uavhengig analysert i kontroll og chrysotile behandlede celler. Tumorceller vanligvis har genetiske forandringer og de fleste av dem er hyperdiploid. Siden HK2 er en
in vitro
etablert cellelinje, diploid gruppen ble definert i henhold til toppen av G0 /G1 i histogrammet, og den tetraploid gruppe ble bestemt med dobbelt DNA-innhold.
flowcytometri
cellesyklus ble analysert ved flowcytometri hjelp av Guava System. Ble analysert kontroll og krysotil (125 ug /ml) behandlede celler i 48 timer og gjenvunnet i normalt medium for 2, 4 og 8 dager. For analyse celler ble behandlet med trypsin, spunnet ned (1000 rpm i 10 min), vasket med PBSA og fiksert med metanol: PBSA (03:01) i 1 time ved 4 ° C. Deretter ble cellene spunnet ned og vasket med PBSA og inkubert med en oppløsning av 200 pl PBSA, 20 ul av RNAase og 20 ul av propidiumjodid i 1 time. Det ble analysert 5.000 celler for hver eksperimentell tilstand
Immunoflurescence:. Mitotisk indeks, Cell, morfologi og Nærvær Fibers
HK2-celler ble behandlet med 125 ug /ml av krysotil i 24 t og 48 t , og også behandlet i 48 timer og gjenvunnet for 2, 4 og 8 dager i normalt medium; og Vero-celler ble behandlet med 125 ul /ml av krysotil i 48 timer og gjenvunnet i normalt medium i 24 timer. Kontroll og behandlede celler ble fiksert med formaldehyd 3,7% i 30 minutter og behandlet med Triton X-100 0,1% i 10 min. Deretter ble cellene sendt til immunofluorescens med anti-α og p-tubulin-antistoffer (Sigma, fortynnet 1:200) og med det andre antistoff anti-mus-Cy5 (Invitrogen, fortynnet 1:200). Etter dette ble cellene behandlet med RNAase i 30 min, ble kjernene farget med propidiumjodid og aktin filamenter med FITC-phalloidin. Cellen morfologi og tilstedeværelsen av chrysotile fibre ble fotografert av laser scanning konfokalmikroskopi (LSM 510, Carl Zeiss). Disse preparater ble også anvendt for å kvantifisere nærværet av mikro, multinucleated og mitotiske celler: Preparatene ble observert ved fluorescens mikroskopi. Minst 1.000 celler /sklie og 100 mitotiske celler ble talt opp i tre forskjellige bakker for hver behandling og kontroll.
Time-Lapse Mikros
HK2 ble transfektert med GFP-tagget alpha-tubulin plasmid for å tillate sporing av mikrotubuli i løpet av mitose. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 Invitrogen) i overensstemmelse med fremstillingen protokollen. Etter 24 timer med transfeksjon, ble mediet forandret til medium med krysotiltypen fibre. Cellene forble med fiber i 24 eller 48 timer, og deretter observert av time-lapse roterende disk konfokalmikroskopi hjelp av en DSU X-81 invertert mikroskop (Olympus), utstyrt med MT20 belysning og Osis oppkjøp systemer, et CCD-kamera (Hamamatsu, ORCA AG), og et varmekammer (Harvard Apparatus). Celle ble plassert på spesielle kammere inneholdende 2 ml av opptaksmedium (5% Hanks balanserte saltløsning, 0,5% glukose, 1% føtalt bovint serum, 20 mM Hepes, og 2 mM Glutamax, pH 7,3) og avbildes med DSU systemet ved hjelp av en 60x 1,42 NA oljeneddyppingsobjektivet. Maksimale projeksjonsbildene ble innhentet og behandlet ved hjelp Metamorph programvare og Adobe Photoshop
Statistiske analyser
Resultatene ble analysert ved χ2 test og P .. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
chrysotile konsentrasjonsavhengig Aneuploidy følgende bedring i fiberfritt medium
Dyrkede HK2-celler ble behandlet med tre forskjellige konsentrasjoner av krysotil, og fikk deretter komme seg i fiber-fritt medium for 2, 4 og 8 dager. Nukleær DNA-innhold ble kvantifisert ved bildeanalyse og kjerner ble gruppert i de følgende fem klasser: hypodiploid (DNA-innhold ≤1.49 C), (innhold DNA mellom 1,5 C og 2,39 C) diploid, (innhold DNA mellom 2,4 C og 3,59 C) hyperdiploid , tetraploid (DNA innhold mellom 3.6C og 5.1C) og hypertetraploid (DNA innhold 5.1C). (tabell 1)
Chrysotile behandling førte til en konsentrasjonsavhengig dannelsen av hypertetraploid kjerner (også kalt aneuploide kjerner). Etter 48 timer av krysotil behandling etterfulgt av 2 dager til bedring i fiber-fritt medium, ble frekvensen av Aneuploidy målt. I celler behandlet med den høyeste konsentrasjon krysotil (250 ug /ml), 7% av cellene var aneuploid, mens de som ble behandlet med den mellomliggende konsentrasjon av krysotil (125 ug /ml) viste 4,5% Aneuploidy; den laveste krysotil konsentrasjon (62,5 ug /ml) resulterte i 3,5% Aneuploidy, som var større enn frekvensen av Aneuploidy i kontrollceller (0,25%). Når analysert etter lengre utvinning ganger, hyppigheten av aneuploide kjerner økt, og nådde 10,5% i celler behandlet med 250 mikrogram /ml chrysotile etterfulgt av 8 dager med oppgang. Celler ble behandlet med 125 pg /ml og 62,5 pg /ml av krysotil og fikk komme seg etter 8 dager presentfremkalle aneuploidi hastigheter på 5,9% og 4,67%, respektivt (tabell 1, fig. 1).
Nuclear DNA innhold av HK2 kontroll og krysotil (250 ug /ml, 125 pg /ml eller 62,5 ug /ml)-behandlede celler (i 48 timer) er tillatt å utvinne i fiber-fritt medium for 2, ble 4 eller 8 dager kvantifisert, og kjerner med DNA-innhold 5.1 C ble vurdert aneuploid. Prosentandelene som vises er bakgrunnen (prosentandelen Aneuploidy i kontrollceller, 0,25%) – subtraheres. Chrysotile behandling førte til Aneuploidy som vedvarte etter 8 dagers restitusjon (P 0,001).
Etter 48 timer av chrysotile eksponering etterfulgt av 2 dager med oppgang, ble aneuploid befolkning består hovedsakelig av bi og multinukleære celler. Men etter lengre utvinning ganger i fiberfritt medium (4 og 8 dager), aneuploide kjerner var for det meste i mononukleære celler (tabell 2).
Cell sykkel endringer etter chrysotile behandling
Den cellesyklus i HK2 kontrollceller og i celler behandlet med krysotil i 48 timer etterfulgt av 2, 4 og 8 dager av bedring i fiberfritt medium ble analysert ved flow-cytometri. Behandlingene ble utført med bare en krysotil konsentrasjon (125 ug /ml).
Cell syklus hendelser ble klassifisert som hypodiploid /apoptotisk, G1, S, G2 /M og hypertetraploid celler. I likhet med forsøkene med DNA-kvantifisering ble diploide gruppe bestemt i henhold til toppen av G0 /G1 celler i histogrammene.
i histogrammene, den første bemerkelsesverdige krysotil-indusert endring i cellesyklusen var en økning i hypodiploid /apoptotisk celle formasjon. Imidlertid hyppigheten av disse cellene ble redusert etter en lang periode med utvinning og nådde kontrollverdien etter 8 dagers restitusjon (tabell 3).
Chrysotile-behandlede celler viste en 12% lavere antall G1 -celler sammenlignet med kontrollceller, og viste også en 5% større antall av G2 /M-celler enn gjorde kontrollceller (tabell 3). Disse forskjellene skjedde uavhengig av varigheten av utvinning perioden, og ble mer uttalt etter lengre perioder med oppgang. Når antallet celler i S-fasen ble undersøkt ble det ikke observert noen forskjell mellom kontroll og krysotiltypen-behandlede celler (Fig. 2, A).
Celler behandlet med krysotil og fikk komme seg etter 2, 4 eller 8 dager i fiber-fritt medium ble analysert ved hjelp av strømningscytometri og ved immunfluorescens. A) Histogrammer i lineær (rød) og log (farget) skalerer fra flowcytometri viser effektene av chysotile på cellesyklusen, nærmere bestemt en økning i antall av G2 /M og hypertetraploid celler; B) krysotiltypen-behandlede celler utvunnet for 2 og 4 dager viser en økning i antallet av celler i metafase og en reduksjon i celler i anafase og telophase sammenlignet med kontrollceller (p 0,01 til 48 timer og P 0,001 i 4 dager) .
mitotisk indeks av kontroll og chrysotile behandlet HK2 celler ble kvantifisert ved hjelp av immunfluorescens. Analyse av mitotisk indeks viste at det totale antall celler i M fase var lik i kontroll og krysotiltypen-behandlede celler. Men i kontrollceller, antall celler i anafase og telophase var større enn antallet av celler i metafase, mens etter 48 timer med krysotil behandling etterfulgt av 2 til 4 dager for utvinning, antallet av celler i metafase var større enn antallet celler i anafase og telophase. Etter 8 dager med oppgang, antall celler i metafase var lik i chrysotile-behandlede og kontrollceller (fig. 2, B).
HK2 og VERO celle morfologi og tilstedeværelsen av chrysotile fiber
Kontroll og chrysotile behandlet HK2 celler ble analysert ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi, etter immunfluorescens merking av mikrotubuli, aktin filamenter og kjerner. Chrysotile Fibrene ble visualisert ved sin autofluorescence (se detaljer i [13]). Tilstedeværelsen av multinucleated og mikroceller, unormal celledeling og fiber ble analysert og kvantifisert
Etter 24 timer og 48 timer av chrysotile behandling, ble lange fibre observert samspill med HK2 celleoverflaten og aktin filamenter.; noen små fiberfragmenter ble også påvist inne celler (Fig. 3, A). Endringer i cellekultur ble observert, for eksempel større antall bi- og multikjerneinneholdende, med mikro og apoptotiske celler. Antall celler med multipolar mitose også øket, og nådde 7,23% av alle delende celler etter 48 timers eksponering av krysotil (kontroll 2,37% av alle celledelinger var multipolar) (Fig. 3, B).
Celler ble behandlet av immunfluorescens å visualisere kjerner, aktin filamenter og mikrotubuli, og chrysotile fibrene ble observert av sin autofluorescence. A) Confocal bilder av hK2 celler behandlet med krysotil i 24 timer eller 48 timer som viser lange og tykke fibre som samvirker med cellene og multipolar mitose; B) de endringer i cellemorfologi ble analysert, og etter 24 timer eller 48 timer av krysotil behandling, antallet binucleated og flerkjernede celler økt, i tillegg til antall mikroceller, apoptotiske celler og celler i multipolar mitose (P 0,001) .
etter 48 timer av chrysotile behandling etterfulgt av en lignende restitusjonsperiode, flerkjernede celler, unormal mitose og ble observert lange og små chrysotile fiber inni cellene (fig. 4, A). Videre analyser viste at cellene tillatt å komme i lange perioder inneholdt færre fibre; krysotiltypen fibre og små fiberfragmenter ble observert i det perinukleære region av celler etter 4 dager med bedring, mens etter 8 dager med utvinning var der ingen lange fibre og noen få små fragmenter av fibre i celler (fig. 4, A). Etter 4 dager med oppgang, antall bi /multinucleated celler gått ned, men det var fortsatt høyere enn i kontrollceller, men antall celler i multipolar mitose og mikro ble økt (Fig. 4, B). Etter 8 dager med gjenvinning, er cellemorfologi av krysotiltypen-behandlede celler som lignet den for kontrollceller som utgjorde mononukleærerte celler, celler i mitose bipolar og få mikro og apoptotiske celler. Antallet av celler i mitose multipolar redusert sammenlignet med den til cellene tillatt å komme i 4 dager; men i de chrysotile-behandlede celler, var det flere tilfeller av multipolar mitose enn det var i kontrollceller (Fig. 4, B).
Celler ble undersøkt ved hjelp av immunfluorescens å visualisere kjerner, aktin filamenter og mikrotubuli , og chrysotile fibrene ble observert av sin autofluorescence. A) Confocal bilder av kontroll HK2 celler og celler behandlet med krysotil i 48 timer og fikk komme seg i 2 dager, 4 dager eller 8 dager, og viser cellemorfologi og nærværet av krysotiltypen fibre. Etter 2 dager med oppgang, ble lange fibre observert å samhandle med celler overflaten; Men etter 4 og 8 dager med oppgang, ble bare fiberfragmenter observert; B) de endringer i cellemorfologi ble kvantifisert, og etter 48 timer med krysotil behandling og 4 dager med utvinning, antall bi /flerkjernede celler og apoptotiske celler ble redusert, men fortsatt var høyere enn kontrollene (p = 0,30 for bi /flerkjernede etter 4 dager og P = 0,05 for apoptotiske celler). Antallet av mikroceller i krysotil-behandlede gruppe forble større enn i kontrollgruppen (P 0,001 etter 4 dager), og antallet celler i mitose multipolar var størst (P 0,001). Etter 8 dager med oppgang, antall celler i multipolar mitose cellene forble høyere enn i kontrollceller (P = 0,02).
For å avgjøre om normale celler vil på samme måte svare på chrysotile, kulturer av Vero-celler ble utsatt for krysotiltypen fibre i 48 timer og fikk komme seg i 24 timer i fiber-fritt medium, og deretter ble de behandlet ved hjelp av immunfluorescens for å analysere cellemorfologi. De kontrollceller, hovedsakelig bestående mononukleærerte celler (99,29%), med sjeldne mikroceller (1,55%) og ingen unormal celledeling. Etter chrysotile behandling, ble bi /multinucleated og mikroceller observert i større antall enn i kontrollceller (6,34% og 3,89% henholdsvis), og multipolar mitose og cytokinese resulterer i tre datterceller ble også observert (7,18% av alle celledel) ( fig. 5, A og B).
Celler ble undersøkt ved å benytte legges immunofluorescens for å visualisere kjerner, aktin filamenter og mikrotubuler og krysotiltypen fibere ble observert ved sin autofluorescens. A) Confocal bilder av kontrollceller og celler behandlet med krysotil i 48 timer og fikk komme seg i 24 timer, som viser cellemorfologi og nærværet av krysotiltypen fibre. Etter utvinning, ble lange fibre observert å samhandle med cellene, og multinucleated celler, ble observert med mikroceller og celler i multipolar mitose; B) endringer i celle morfologi ble kvantifisert, og chrysotile behandling førte til økt antall mikroceller, bi /multinucleated celler, apoptotiske celler og celler i multipolar mitose (P . 0.001)
Time- lapse mikros~~POS=TRUNC: skjebnene til unormale mitotiske celler og dannelse av flere centrosomes
for time-lapse roterende disk konfokalmikroskopi, ble HK2 celler transfektert med GFP-merket α-tubulin. Hver transfektert celle ble observert i en periode på 2-3 timer. Når en kontrollcelle i metafasen ble funnet, er det kommet til anafase og nådde telophase i 30 til 100 minutter. Samtlige avdelinger observert i kontrollceller ble bipolar (fig. 6, A). Ved sammenligning, når krysotiltypen-behandlede celler ble observert, rundt 40% av metafaser var multipolar. Analyse av skjebnen til 30 av disse cellene viste ulike mønstre; hver av dem ble observert minst to ganger.
Celler transfektert med GFP-merket α-tubulin ble behandlet med krysotil i 24 eller 48 timer og deretter observert av time-lapse roterende disk konfokal mikroskopi. Celler i metafase ble observert i 2 til 3 timer. A) En tidsserie av maksimal projeksjonsbilder som viser en bipolar mitose som genereres bare to datterceller etter 1 time i en kontrollkultur; B) en tidsserie av maksimal projeksjon bilder som viser en veis mitose fra en chrysotile behandlet kultur som ikke går gjennom M fase; C) en tidsserie av maksimal projeksjon bilder som viser en chrysotile behandlet celle som organisert spindel polene i en tre-veis mote og kommet til anaphase og telophase generere tre datterceller; D) en tidsserie av maksimal projeksjonsbilder som viser cytokinese i en krysotil-behandlede celle, genererer tre datterceller som ervervet interfase morfologi; E) en tidsserie av maksimal projeksjonsbilder av en krysotil-behandlede celle som angitt anaphase genererer fire datterceller; Men cellene fusjonert under telophase og dannet kun to datterceller.
Om lag halvparten av cellene i multipolar meta ikke videre til anaphase i observasjonsperioden, resterende i metafase med pseudo-bipolar,-veis eller quadripolar spindler (fig. 6, B). I disse tilfellene mikrotubuli var dynamisk, og spinde Stengene var mer dynamisk når gruppert i pseudo-bipolar spindler. Celler i multipolar metafase også gjennomgikk celledød, som dokumentert av lekkasje av cytoplasma observert i det utsendte lyset kanalen.
Noen celler i multipolar metafase etter chrysotile behandling også kommet til anaphase, telophase og cytokinese. Tripolar meta generert tre datterceller knyttet sammen av to midbodies med microtubuli organisasjon som ligner den som ble observert i kontrollceller (Fig. 6, C). De tre datterceller enten forble adskilt og tilegnet en interfase morfologi 100 minutter etter begynnelsen av cytokinese (fig. 6, D), eller kondensert under cytokinese. I disse tilfellene ble to av de tre dattercellene smeltet og knyttet til inter bro av to strukturer av mikrotubuli. Cellefusjonen skjedde også under telophase til inter bro formasjon, så to dattercellene ble koblet med bare ett midbody (fig 6, E.)
Dannelsen av multipolar spindler eller flere centrosomes ble ikke observert under mitose.; alle forekomster av metafase var unormal siden begynnelsen av observasjons. Dermed ble interfase celler observert å identifisere endringer som kan være relatert til sentrosomen forsterkning, som var ansvarlig for dannelsen av multipolar spindler i den påfølgende M fase.
Celler i inter med to centrosomes ble observert, og centrosomes nærmet hverandre i stedet for å migrere til motsatte poler. Også, mikrotubul nettverk av disse cellene forble lik den interfase-celler og ikke danner spindler. En annen situasjon som ble observert etter behandling krysotil var tilstedeværelsen av mellomfase med to sentrosomen lignende organer – strukturer som befinner seg i perinukleært region av cellen hvor mikrotubuli ble konsentrert. Disse strukturene syntes å være dannet av meget små punkter som beveget seg under hele registreringsperioden. Også forble cellen i interfase og ikke utvikle seg til M fase (Fig. 7, A).
Endringer som kan være relatert til en unormal antall centrosomes ble observert i HK2 celler behandlet med chrysotile for 24 eller 48 timer. A) En tidsserie med bilder som viser en celle med to sentrosomen like-strukturer som ikke hadde progresjon til M fase som forventet for en celle med to centrosomes; B) en tidsserie av bilder som viser to interfaseceller knyttet sammen av en inter bro uten midbody organisasjon. Cellene nærmet seg hverandre i løpet av observasjonsperioden, noe som reflekterer en regresjon av cytokinese.
En annen mekanisme ansvarlig for dannelsen av ekstra centrosomes i cellene er cytokinese fiasko. Denne prosessen tar for lang tid å bli observert i løpet av time-lapse eksperimenter vi gjennomførte. Imidlertid ble interfaseceller knyttet sammen av en inter bro uten midbody microtubuli organisasjon observert, og cellene nærmet hverandre i observasjonsperioden (Fig. 7, B).
Diskusjoner
Chrysotile er anses mindre skadelige for helse enn andre typer av asbest, på grunn av mangel av en sterk sammenheng mellom krysotil fiber eksponering og utvikling av karsinomer og mesotheliomas. Likevel har noen studier vist at potensialet for chrysotile å forårsake skade på DNA og cellulære forandringer
in vitro
og lungeskader
in vivo
. Den nåværende arbeid analysert cellulære endringer knyttet til Aneuploidy og cellesyklus avbrudd, og verifisert som endringer vedvare i kultur etter 2, 4 og 8 dager til oppgang i fiber-fritt medium. Også, ble forandringer i cellemorfologi relatert til nærværet av fibre i kulturen i løpet av de første 24 timer og 48 timer av krysotil behandling og også etter lange perioder med utvinning. Vi har også analysert multipolar mitose og sentrosomen forsterkning, noe som er flere funksjoner i chrysotile behandling som er nært knyttet til Aneuploidy.
Analysen av HK2 celler ved konfokalmikroskopi fråtset at chrysotile fiber ikke vedvare i cellekultur etter 8 dager for utvinning, og etter 4 dager med gjenvinning av bare fragmenter og små fibre var tilstede i det perinukleære regionen i noen celler. Også, etter 4 og 8 dager for utvinning, cellemorfologi lignet som kontrollceller med hensyn til tilstedeværelse av bi /multinucleated og med mikroceller. Imidlertid vedvarte den aneuploid befolkningen i cellekultur etter 4 og 8 dager med oppgang i fiber-fritt medium, og prosenter av aneuploide kjerner var alltid rundt 10% av den totale befolkningen. Dataene som tilbys av DNA kvantifisering viste også at aneuploide atomkjerner var for det meste i mononukleærerte celler etter 4 og 8 dager med oppgang, mens i løpet av de første dagene av utvinning de aneuploide kjerner var i bi /multinucleated celler. Alle disse observasjonene er i overensstemmelse med de data levert av flowcytometri, som indikerte at chrysotile behandlet HK2 celler viste økt hipertetraploidy selv etter 8 dager med oppgang.
Tilstedeværelsen av aneuploide celler er en konsekvens av chrysotile behandling observert etter 48 timers eksponering, som vedvarer selv etter 72 timer for å bli frisk etter behandlingen [11], [13]. Disse cellene kan være relatert til kreftutvikling, fordi tap eller vinning av en kromosom – eller en del av denne – kan innføre mutasjoner som kreves for malign transformasjon. Vi viser i denne studie som induksjon av Aneuploidy i celler er krysotil konsentrasjonsavhengig, og som beskrevet ovenfor, at andelen av aneuploide celler forble høy sammenlignet med kontrollceller etter å ha opp til 8 dager etter utvinning i fiberfritt kulturmedium.
