Abstract
Bakgrunn
PI3K /AKT signalveien er abnormt aktiv og spiller en avgjørende rolle for cellesyklusprogresjon av human ondartet pleural mesothelioma (MME) celler.
AKT er en av de viktige cellulære mål av perifosine, en ny bio-tilgjengelig alkylphospholipid som har vist betydelig anti-proliferativ aktivitet in vitro og in vivo i flere menneskelige tumor modellsystemer og blir nå testet i kliniske studier.
Metoder
Vi testet Perifosine aktivitet på humane mesothelial celler og ulike mesothelioma cellelinjer, for å gi bevis av sin effekt som monoterapi og kombinasjonsbehandling.
Resultater
Vi viser her at perifosine, for tiden under vurdering som en anti-kreft agent i fase 1 og 2 kliniske studier, forårsaket en dose avhengig reduksjon av AKT-aktivering, ved konsentrasjoner forårsaker MME cellevekst arrest. I denne studien vi først beskrive at MME celler uttrykker bortsett fra akt1 også akt3 og at enten Myristoylated, konstitutivt aktiv, former av to proteiner, avskaffet perifosine-mediert hemming av cellevekst. Videre beskriver vi her en ny mekanisme for perifosine som forstyrrer, oppstrøms AKT, påvirker EGFR og MET fosforylering. Til slutt viser vi en betydelig økning i celletoksisitet når Mme celler ble behandlet med perifosine i kombinasjon med cisplatin.
Konklusjoner
Denne studien gir en ny virkningsmekanisme perifosine, direkte hemmende EGFR /MET-akt1 /3 akse, noe som gir en begrunnelse for en ny translasjonsforskning tilnærming til behandling av MME
Citation. PINTON G, Manente AG, Angeli G, Mutti L, Moro L (2012) Perifosine som en potensiell Novel Anti-Cancer middel hemmer EGFR /MET-AKT Axis i ondartet pleural mesothelioma. PLoS ONE 7 (5): e36856. doi: 10,1371 /journal.pone.0036856
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 21 november 2011; Godkjent: 15 april 2012; Publisert: May 10, 2012 |
Copyright: © 2012 PINTON et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work var støttet av Mesothelioma Applied Research Foundation (MARF gi 2009), Fondazione Buzzi Unicem og gime (italiensk Mesothelioma interesse Group). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ondartet pleural mesothelioma (MME) er en raskt dødelig kreft assosiert med eksponering for asbest som øker i forekomst over hele verden [1], [2]. Siden Mme er motstandsdyktig mot konvensjonell terapi, er prognosen for disse pasientene dårlig, med en median overlevelse på 11-12 måneder etter diagnose [3], [4] og derfor er det et stort behov for effektiv behandling.
Aktivering av flere reseptor tyrosin kinaser (RTK) er kritisk for celleproliferasjon og /eller overlevelse av Mme celler. Blant RTK, ble møtt og EGFR tenkt å være to av de mest vesentlig involvert i MME spredning og /eller overlevelse via PI3-K /AKT signalkaskade aktivering. Imidlertid har en fase II klinisk studie av erlotinib behandling ingen effekt på mme, selv om 96% av prøvene viste positiv pEGFR [5].
Mangelen på EGFR mutasjon i mme kan være en av årsakene for den ikke-responsivitet [6]. MET er en annen RTK som formidler aktiveringen av flere signalveier, inklusive fosfoinositid 3-kinase (PI3-K) /AKT og Ras /mitogen-aktivert protein kinase kaskader [7]. Tidligere studier har vist at MET ble uttrykt og aktivert i de fleste MME cellelinjer og kliniske prøver, [8], [9]. Men MET hemming forårsaket vekst arrest i bare en liten del av MME cellelinjer, uavhengig av hyppige MET aktivisering [10]. I en nylig publisert artikkel Kawaguchi et al. foreslått at inhibering av flere RTK’er kan tjene til å utvikle en mer effektiv mål terapi for pasienter med MME [11].
Som i andre kreftformer hos de RTK’er aktiverte signaler, den fosfoinositid 3-kinase (PI3K) /AKT pathway , spiller en avgjørende rolle for cellesyklusprogresjon i humane MME-celler [12], [13]. Det har blitt rapportert at inhibering av PI3K-aktivitet førte til signifikant cellesyklus-stans og suppresjon av celle proliferasjon av forskjellige MME cellelinjer [14]. PI3K aktivering resulterer i akkumulering av phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate og fosfatidylinositol 3,4-bisfosfat [15]. Deretter pleckstrin homologi (PH) domene-inneholdende proteiner, inkludert PDK1 og AKT [16], [17] binde seg til det 3′-OH-fosforylerte fosfatidylinositoler gjennom dette domenet. Denne bindingen resulterer i målretting av AKT til plasmamembranen og gir en gunstig konformasjon for AKT Thr308 og Ser473 fosforylering [18].
Den første generasjonen av PI3K hemmere inkluderer LY294002 og Wortmannin, både rettet mot katalytiske stedet P110, som er blitt anvendt som forskningsverktøy for å belyse verdien av PI3K som terapeutisk mål [19]. For de un-gunstige farmasøytiske egenskaper, toksisitet, og cross-over hemming av andre lipid og protein kinaser, de ble ikke mye brukt i kliniske studier [20].
Perifosine [oktadecyl- (1,1-dimetyl -piperidinio-4-yl) -fosfat] er et syntetisk ny alkylphospholipid (ALP), en ny klasse av antitumor-midler som er rettet mot cellemembraner av aktive prolifererende celler og hemmer PH domene mediert AKT membran rekruttering og aktivering. Viktigere, ikke perifosine ikke direkte innvirkning aktivitet av PI3K eller phosphoinositide-avhengig kinase 1 (PDK1) [21]. Perifosine har vist betydelige anti-proliferativ aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
i flere menneskelige tumor modellsystemer og blir nå testet i ulike kliniske studier [22], [23].
Den aktuelle studien undersøker en potensiell antitumor aktivitet av perifosine å bruke
in vitro
MME cellemodeller, ved hjelp perifosine enten på egen hånd eller i kombinasjon med etablerte cellegifter. Vi viser at perifosine hemme både MET og EGFR aktivering selv i nærvær av HGF og EGF reduserer AKT fosforylering og blokkerer celleproliferasjon uten å indusere apoptose av MME cellelinjer. I denne studien vi først beskrive at MME celler uttrykker bortsett fra akt1 også akt3 og at perifosine indusert hemming av cellevekst ble gjenopprettet ved transfeksjon av både Myristoylated-AKTs, konstitutivt lokalisert til plasmamembranen. Videre samtidig behandling med perifosine øker vesentlig cytotoksiske effekten av cisplatin i MME celler.
Resultater
Perifosine rettet AKT fosforylering og påvirker Mme celleproliferasjon indusere en G2 /M faser arrestere
Perifosine har en lignende struktur som naturlig forekommende fosfolipider som har blitt beskrevet først og fremst å interferere med membraner av prolifererende celler som tumorceller, Her viser vi at 50% av Perifosine-indusert MME vekst inhibering (IC50) i 24 timer var 23 pM, 14 mikrometer og 7,5 mikrometer for henholdsvis REN, MSTO211H, og MMP, mens minimal toksisitet ble vist i HMC normale mesothelial celler (figur 1A). Disse dosene var i tråd med oppnådde plasmakonsentrasjoner
in vivo plakater (beskrevet til å være rundt 16 mikrometer). Den AKT pathway er et mål for den anti-proliferative effekt av perifosine, så vi undersøkt effekten av dette stoff på den fosforylering status av AKT. Figur 1B viser at eksponering av celler til MME perifosine i 1 time forårsaket en doseavhengig tap av Ser473 fosforylering av AKT, uten å påvirke den totale mengden av protein. Dette tap av AKT-fosforylering ble observert i alle cellelinjene som ble testet ved deres IC50 konsentrasjon på perifosine. Vi valgte REN celler, representant for de mer vanlige epiteloide svulster, for ytterligere å karakterisere tidlig signal hendelser påvirket av perifosine. I REN celler demonstrerte vi at behandlingen med forskjellige doser av perifosine i 24 timer førte til en cellesyklus-stans med en progressiv signifikant akkumulering i G2 /M-fase (figur 2A). Både sub-G1 plukke og spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase var ikke tydelig ved inkubasjon med økende doser av perifosine i 24 timer, noe som indikerer at ingen caspase avhengige apoptotisk celledød oppstod (figur 2B). Videre er virkningene av perifosine øket med tiden behandling ledende alle cellene eksponert for 23 uM til å dø etter 72 timer (figur 2C). Lignende resultater ble oppnådd på MSTO211-H-celler (figur S1).
A, virkning av perifosine på levedyktigheten til HMC og tre forskjellige MME cellelinjer (REN, MSTO211-H og MMP) etter 24 timers behandling ved de angitte konsentrasjoner.
poeng
betyr ± SD av tre individuelle målinger. B, REN, MSTO211-H og MMP-celler ble behandlet med de angitte doser perifosine for en time. Celler ble lysert, og like mengder av protein ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembran, probet med fosfo-spesifikke AKT og re-probet med panAKT antistoffer som beskrevet i «Materialer og metoder». Representative for tre uavhengige eksperimenter.
A, ble REN-celler behandlet med forskjellige doser av perifosine i 24 timer. Etter behandling ble cellene farget med propidiumjodid som beskrevet i «Materialer og Metoder» og analysert med henblikk på cellulær DNA-innhold ved strømningscytometri. Data som er rapportert i tabellen representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3) av prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen, * p≤0.005, ** p≤0.001. B, REN, ble cellene behandlet med de angitte doser av perifosine i 24 timer. Celler ble lysert, og like mengder av protein ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembran, probet med et spesifikt anti-PARP1 antistoff og tubulin for lik belastning. Representant for tre uavhengige eksperimenter. C Effekt av perifosine på levedyktigheten av REN-celler ble testet ved 24, 48 og 72 timers behandling ved de angitte konsentrasjoner.
poeng
betyr ± SD av tre individuelle målinger
En konstituerende aktive formen av AKT over kommer perifosine hemming
AKT består av tre nært beslektede isoformer. AKT 1, AKT 2 og AKT 3, kodet for av tre forskjellige gener [24]. Som det fosfo-antistoffet diskriminerer ikke mellom de tre isoformer, i denne studien, ble AKT 1, AKT-2 og AKT-3 ekspresjon undersøkt i REN-celler. Data rapportert i figur 3A og 3B viser at REN celler uttrykker akt1 og akt3, mens akt2 mRNA ikke ble dokumentert (tilsvarende resultater på MSTO211-H celler er vist i figur S1).
A, akt1, 2, 3 og aktin som kontroll mRNA-ekspresjon i A549 og REN-celler ble evaluert ved hjelp av RT-PCR som angitt i i «Materialer og metoder» -delen. B, akt1 og tre protein uttrykk ble evaluert av Western blot analyse i REN celler med isoform spesifikke antistoffer, bekreftet tubulin blot lik belastning. Representant for tre uavhengige eksperimenter. C, REN-celler ble transfektert med 1 pg /plate av plasmid som koder for den konstitutivt aktivert form av AKT, Myr-akt1 eller 3. 24 timer etter transfeksjon REN-celler ble behandlet med 23 uM perifosine i 1 time, deretter ble lysert og like mengder av proteiner ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av immunblotting med spesifikke antistoffer mot fosforylert AKT, HA for å bekrefte transfeksjon og tubulin for lik belastning. D, Virkningen av perifosine på celler transfektert med Myr- akt1 eller 3 ble også undersøkt på celleproliferasjon. REN-celler ble transfektert med 1 pg /plate av plasmid som koder Myr-akt1 eller 3 og 24 timer etter transfeksjon ble behandlet med 23 uM perifosine i 24 timer. Ved slutten av behandlingen av levedyktige celler ble bestemt.
poeng
betyr ± SD av tre individuelle målinger. Perifosine markert endrer AKT membran translokasjon, så vi neste spurt om tvungen uttrykk for en eksogen Myr-akt1 eller Myr-akt3 kan oppheve effekten av perifosine på AKT aktive phosphorylations og cellevekst. Motstridende data er tilgjengelige i litteratur om evnen til en konstitutivt aktiv AKT å overvinne perifosine handling. Mens i prostatakreftceller hemming av AKT fosforylering ble betydelig lettet ved innføring av en Myr-akt1, som omgås kravet til PH domain-mediert membran rekruttering, i myelomaceller det har blitt beskrevet som perifosine vinne konstituerende høyaktiv akt1 [25], [26]. Vi transient transfektert REN-celler enten med et HA-merket Myr-akt1 eller Myr-akt3 og behandlet dem i 24 timer med IC50-dosen av perifosine. Western-blot analyse rapportert i figur 3C viser at transfeksjon av både Myr-akt1 og Myr-akt3 seirer perifosine hemming av AKT fosforylering i REN celler; Bare en liten reduksjon av fosforylering, sannsynligvis på grunn av blokken med de endogene proteiner, ble observert. Cellevekst analyse rapportert i figur 3D viser at både transfekterte Myr-AKTs reddet perifosine indusert blokk av celleproliferasjon.
Perifosine påvirker EGFR og MET signale
Perifosine ligner fosfolipider, den viktigste bestanddeler av cellemembraner og kan endre membran-relaterte signaltransduksjon. Gjennomgående i prostatakreftceller perifosine var i stand til å fastslå en reduksjon av AKT-aktivitet, celleproliferasjon, og for å indusere apoptose etter stimulering med 50 ng /ml EGF, selv om ingen data angående EGFR-aktivering ble vist så langt [27]. Derfor analyserte vi hvis perifosine kan forstyrre liganden mediert aktivering av EGFR og møtt av immunoutfellingsstudier og Vest-blot eksperimenter. Som vist i figur 4A og 4C i REN cellene sultet, behandlet en time med perifosine (23 uM) og deretter stimulert 10 minutter med 5 ng /ml EGF eller HGF både EGFR og MET var ikke fosforylert, selv i nærvær av deres ligander. Også EGFR og MET signale ble betydelig svekket; faktisk også vekstfaktor indusert AKT fosforylering ble sterkt hemmet. Som beskrevet i andre cellemodeller [26], som er analoge konsentrasjoner av perifosine faktisk forårsaket en svak økning i basal ERK1 /2 fosforylering, mens det motvirkes indusert av vekstfaktorer. Effekten av perifosine ble også vurdert på vekstfaktor-mediert celle proliferasjon. Som vist i figur 4B og 4D, 23 uM perifosine administrert 24 timer før REN-celler i nærvær av EGF eller HGF opphevet vekstfaktor indusert celleproliferasjon. Av notatet lignende data ble observert i MSTO-211H cellelinje (figur S1). Videre perifosine var mer effektiv enn single eller kombinert bruk av EGFR og MET spesifikke inhibitorer, enten i form av celle levedyktighet enn av AKT-aktivering (data ikke vist).
Perifosine forbedrer responsen MME celler til kjemoterapeutika
for å bestemme innholdet av interaksjoner mellom perifosine og kjemoterapeutiske midler som i dag brukes i MME terapi, undersøkte vi data fra dose-responskurver av isobologram analyse. Vi valgte å evaluere anti-proliferative effekter ved hjelp av IC50 for enkelt legemiddeleffekter som ble bestemt eksperimentelt ved hjelp av data fra dose-respons-eksperimenter som utgangspunkt. Perifosine (5-20 mm) og cisplatin (IC50: 100 mm) eller pemetrexed (IC50: 22 mm) eller gemcitabin (IC50: 2 nM) ble gitt samtidig i 24 timer til Ren celler i colture. Ved slutten av inkuberingsbetingelser celler ble trypsinisert og tellet. Representative isobologrammer i figur 5 indikerer at kombinasjonen av perifosine og cisplatin viste sterk synergistisk cytotoksisitet i REN-celler over et bredt område av doser. Videre perifosine viste additiv i kombinasjon med gemcitabin mens det syntes å motvirke effekten av pemetreksed. Sinergy med cisplatin er også rapportert i MSTO-211H cellelinje (figur S1) selv om ble observert forskjellig følsomhet for narkotika.
Diskusjoner
PI3-K /AKT signalering har vist seg å ha en viktig biologisk effekt i MME cellesyklusregulering, anti-apoptose og cellegift-motstand. Aktivering av AKT, som rapportert av Altomare et al., Ble observert i 65% av MME eksemplarer selv om genetiske endringer syntes å være sjeldne for PI3-K /AKT aktivering i MME-celler [12].
Videre fosfor-RTK rekke analyse viste at i MME celler EGFR familien, EGFR, ErbB2 eller ErbB3, var ofte co-aktivert med MET, som foreslo at MET og EGFR familie aktivering kan kompensere hverandre for vedvarende nedstrøms signalaktivering [28]. Faktisk, som rapportert i flere studier, selv om EGFR og MET ble sterkt uttrykt i mme enkelt RTK-inhibitorer som anvendes i fase II-forsøk var ikke tilstrekkelig til å hemme mme celleproliferasjon, noe som tyder på at inhibering av flere RTK’er kan tjene til å utvikle en mer effektiv målrette behandling for pasienter med MME i fremtiden [28].
behandling av PI3K /PDK1 /AKT signalveien, som et punkt av konvergens av vekstfaktor relaterte effekter på celleproliferasjon, som et mulig nytt mål for MME terapi, førte til eksperimentene som er rapportert her.
Perifosine [oktadecyl- (1,1-dimetyl-piperidinio-4-yl) -fosfat] er et syntetisk roman alkylphospholipid, en ny klasse av antitumor-midler som mål cellemembraner, hemmer AKT-aktivering, og induserer apoptose i forskjellige carcinoma celler.
A, B, Eksponensielt voksende REN-celler ble forbehandlet med 23 mM perifosine i 1 time og deretter inkubert i 10 minutter med EGF (5 ng /ml) eller HGF (5 ng /ml). Ved slutten av eksperimentet, ble cellelysater fremstilt eller immunopresipitert og analysert ved immunblotting med angitte antistoffer. Resultatene er representative for tre forskjellige eksperimenter. B, D, Virkningen av perifosine ble også vurdert på vekstfaktor-mediert celle proliferasjon. REN-celler ble behandlet med 23 uM perifosine 24 timer i fravær eller i nærvær av 5 ng /ml EGF eller HGF. Ved slutten av behandlingen av levedyktige celler ble bestemt.
poeng
betyr ± SD av tre individuelle målinger.
A, B, C, isobologram plott av samspillet mellom perifosine og cisplatin eller gemcitabin eller pemetrexed forbindelser på REN celler. Celler (5 × 10
4) ble belagt i fullstendig medium og lov til å forholde seg til overflaten over natten. Pletteringsmediet ble fjernet og erstattet med medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av perifosine og IC50-doser av de andre stoffer. For å bestemme innholdet av samspillet mellom perifosine og cis-platina eller gemcitabin eller pemetrexed, telte vi overlevende celler etter 24 timer narkotika inkubasjon. Den diagonale linjen representerer isoeffect linjen additivity. Hvert punkt er middelverdien bestemmes fra eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Forsøkene presenteres i denne artikkelen viser at perifosine, forårsaket hemming av MME cellevekst (IC
50 med 7,5 mikrometer til 23 mikrometer i 24 timer) og cellesyklus-stans i G2-M-fase, er forbundet med raskt redusert AKT aktivering, som bedømt ved Ser473 fosforylering kvantifisering. Som fortrinnsvis opptrer på membranen struktur av aktive prolifererende celler, perifosine resulterte bare litt giftig på normale mesothelial celler
AKT Familien har tre svært homologe isoformer:. AKT 1, AKT 2 og AKT 3, kodet av tre forskjellige gener. Alle tre AKT proteiner inneholder en N-terminal pleckstrin homologi (PH) domene, et katalytisk kinase domene og et C-terminalt regulatoriske domenet.
Som det fosfo-spesifikke og anti AKT antistoffer som vi brukte ikke diskriminerer mellom de tre isoformer, vi dypere undersøkt deres uttrykk i våre celler. Vi først beskrive at MME celler uttrykker akt1 og akt3 og at perifosine forstyrrer begge. Tatt i betraktning den tumorigenesis potensialet av AKT isoformer, blir videre studier på funksjon av dem i mme nødvendig. Hemming av AKT fosforylering og celleproliferasjon ble betydelig lettet ved innføring av et konstituerende aktiv Myristoylated akt1 eller 3, som gikk utenom kravet om PH domain-mediert membran rekruttering, støtter hypotesen om at perifosine ikke direkte påvirke aktivitet av PI3-K eller phosphoinositide- avhengig kinase 1 (PDK1). Det har blitt rapportert at perifosine forbedrer antitumoraktivitet av cetuximab i PTEN-mangelfull kreftceller, og at kombinasjonsbehandling forbedret inhibering av fosforylering av AKT, P44 /42MAPK og p38MAPK, men forskjøvet fosforyleringen av SAPK /JNK som ble aktivert ved perifosine behandling alene [29]. Videre har det blitt beskrevet som perifosine viste synergieffekter med erlotinib gjenopprette effekt mot EGFR-hemmere ved PCA [28].
Viktigere, når vi analysert dypere responsen av MME celler til EGF og HGF vi observert at perifosine, sannsynligvis opptrer på cellemembranen struktur eller påvirke reseptor interaksjoner eller rekruttering av co-aktivatorer, avskaffet oppstrøms for å signalmolekyler både EGFR og MET ligand indusert fosforylering.
til slutt testet vi effekten av kombinasjonsbehandling med perifosine og cisplatin eller pemetrexed eller gemcitabin bruker isobologram analyse. Som dokumentert av våre resultater perifosine klart synergized med cisplatin behandling og utøvde en additiv effekt med gemcitabin.
I sammendraget, har vi fremhevet AKT, et multifunksjonelt kinase, hvis aktivering er assosiert med resistens mot celledød og tumorigenesis, som et viktig mål for perifosine. Vi har demonstrert her at perifosine hemmer enten akt1 enn akt3 fosforylering og aktivering i celler som vokser eksponentielt i serumholdig medium og vekstfaktor etter stimulering. Denne sistnevnte mekanismer tilveiebringe en ny begrunnelse for å vurdere perifosine også som en multi-target-inhibitor, mens interferens med riktig membran lokalisering av target-proteiner for deres fosforylering og aktivering (i stedet for direkte inhibering av fosfotransferase aktivitet av kinaser kjent for å regulere AKT) , synes å være en ytterligere ny mekanisme av stoffet handling vi avsløre her. Selv om effekten av kombinert behandling mellom cisplatin og perifosine må valideres av ytterligere
in vivo
studier, våre resultater understreker perifosine som en multi-target terapi for MME. Mer interessant, perifosine var allerede vist seg å gi delvis respons og stabil sykdom hos pasienter i andre behandling (upubliserte data vennlig levert av Keryx biofarmasøytisk).
Materialer og metoder
cellekulturer behandlinger og transfeksjon
epithelioid MME avledet REN cellelinje som ble brukt som den viktigste eksperimentelle modellen i denne undersøkelsen ble vennlig levert av Dr. SM Albelda (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA), MMP ble stabilisert fra plevravæske av ondartet mesothelioma pasienter [30] og primær HMC-tert kulturer hentet fra pasienter med hjertesvikt og udødeliggjort av uttrykk for en menneskelig telomerase subenhet [31]. Den bifasiske avledet MSTO-211H cellelinjen ble hentet fra Istituto Scientifico Tumori (IST) Cell-bank, Genova, Italia. Celler ble dyrket i standard betingelser.
-celler dyrket til 80% konfluens i vevs kulturskåler ble transient transfektert med pcDNA3 Myr-HA-akt1 eller pBABE Purol Myr-HA-akt3 plasmid som koder for myristilated konstitutivt aktiv form av AKTs fra Addgene av LipofectAMINE reagens som beskrevet av produsenten.
Reagenser og antistoffer
de monoklonale antistoffer som er spesifikke for fosfor tyrosin, fosfor-ERK1 (pThr202 og pTyr204) og ERK2 (pThr185 og pTyr187) MAP kinaser, og fosfor-Akt (pSer473) akt1 og akt3, var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffene er spesifikke for α-tubulin, PARP1, ERK1 /2, panAKT, MET, EGFR og HA var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Anti mus og anti kanin IgG konjugert antistoff, vekstfaktorer og kjemiske reagenser var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL var fra Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sverige). Nitrocellulosemembraner og proteinanalysesett var fra Bio-Rad (Hercules, CA). Dyrkingsmedier, serum, antibiotika og lipofektamin var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Perifosine markedsføres og vennlig levert av Keryx biofarmasøytisk (New York, New York).
Cell lyse, immunoprecipitation og immunoblot
Proteiner ble trukket ut og immunopresipitert og SDS-PAGE skilt som tidligere beskrevet [32] . Etter SDS-PAGE ble proteinene overført til nitrocellulose, omsettes med de angitte spesifikke antistoffer og deretter påvist med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer og chemioluminescent ECL-reagens. Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av GS 250 Molecular Imager (Bio-Rad).
Celleproliferering som bestemmes ved direkte telling
MME celler ble dyrket og behandlet i fullstendig medium som ovenfor angitt, så var trypsinert og farget med trypanblått. Antallet levedyktige celler ble tellet i et Burker kammer.
Cell Cycle Analysis
Cell syklus /apoptose-analyser ble utført ved anvendelse av propidiumjodidfarging med påfølgende FACS-analyse. 5 x 10
5-celler /brønn ble dyrket på vevskulturplater med eller uten behandling i 24 timer. Etter inkubering ble adherente cellene løsnet med trypsin (0,5% trypsin /0,1% EDTA i PBS). Frittliggende og suspenderte celler ble høstet i fullstendig DMEM medium og sentrifugert ved 500 g i 10 minutter. Pelletene ble vasket med PBS og fiksert med iskald 75% etanol over natten ved 4 ° C, behandlet med 100 ug /ml RNAse A, og deretter farget med 25 ug /ml propidiumjodid. Deretter ble de analysert ved hjelp av en flowcytometer FACS (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) og Modfit programvare (Verity Software House, Inc., Topsham, Maine).
RNA isolering og RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra REN, MSTO-211H og A549 cellelinjer påfølgende til Trizol Reagens (Life Technologies, Inc.) protokoll. Kvaliteten og kvantiteten av RNA ble bestemt ved å måle absorbansen av det totale RNA ved 260 og 280 nm. For å oppnå cDNA ble brukt RevertAid cDNA Synthesis Kit fra Fermentas. Primere for Akt isoform uttrykk ble beskrevet av Okano et al. [33] og ble syntetisert ved MWG. Primerne var: 5′-GCTGGACGATAGCTTGGA-3 «(akt1 forstand); 5»-GATGACAGATAGCTGGTG-3 «(antisense akt1); 5»-GGCCCCTGATCAGACTCTA-3 «(akt2 forstand); 5»-TCCTCAGTCGTGGAGGAGT-3 «(antisense akt2); 5»-GCAAGTGGACGAGAATAAGTCTC-3 «(akt3 forstand); og 5»-ACAATGGTGGGCTCATGACTTCC-3 «(antisens akt3). p-aktin-primere var 5»-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 «(sense) og 5′-CTCCTTAAGTCACGCACGATTTC-3» (antisens). RT-PCR reaksjoner ble utført ved hjelp 2xPCR Master Mix fra Fermentas etter standard prosedyrer. PCR-produktene ble elektroforesebehandlet på en 1% agarosegel og visualisert med etidiumbromid. De Akt primere ble utviklet for å generere 383- (akt1), 276- (akt2), og 329- (akt3) bp produkter, henholdsvis.
Statistiske og isobologram analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller mellom verdier oppnådd i en populasjon av celler behandlet med ulike eksperimentelle forhold ble bestemt ved hjelp av uparet
t
-test. En
P
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Det teoretiske grunnlag av den isobologram metoden har blitt beskrevet i tidligere studier [34], [35].
Basert på dose-respons kurver av cisplatin, pemetrexed og gemcitabin, med tre isobologrammer ble konstruert ved å plotte IC50 verdiene av enkelt legemidler på
y Hotell og av perifosine på
x
aksler, og den teoretiske additive dosekombinasjon ble beregnet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1 .
Analyse av perifosine effekter på MSTO-211H celler. A, virkning av perifosine på levedyktigheten til MSTO-211H-celler ved 24, 48 og 72 timers behandling ved de angitte konsentrasjoner.
poeng
betyr ± SD av tre individuelle målinger. B, Eksponentielt voksende MSTO-211H-celler ble forbehandlet med 20 mM perifosine i 1 time og deretter inkubert i 10 minutter med EGF (5 ng /ml) eller HGF (5 ng /ml). Ved slutten av eksperimentet, cellelysater ble fremstilt og analysert ved immunblotting med angitte antistoffer. Resultatene er representative for tre forskjellige eksperimenter. C, akt1, 2 og 3 og aktin, som kontroll, ble mRNA ekspresjon i MSTO-211H-celler bedømt ved RT-PCR som rapportert i «Materialer og metoder» -delen. D, isobologram tomt på samspillet mellom perifosine og cisplatin på MSTO-211H celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0036856.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Dott. Peter Sportelli fra Keryx biofarmasøytisk for å gi kliniske data på perifosine behandlede pasienter.
