Abstract
Bakgrunn
Bacillus Calmette-Guerin (BCG) er den mest effektive behandlingen for ikke-muskel invasiv blærekreft. Imidlertid har en svikt i den første responsen eller tilbakefall i løpet av de første fem årene av behandling er observert hos 20% av pasientene. Vi har tidligere observert at
in vivo
administrering av en inhibitor av nitrogenoksid forbedret respons på BCG av blæretumorbærende mus. Det ble beskrevet at denne effekten skyldes en erstatning av tumorvev ved kollagen depoter. Målet med dette arbeidet var å avklare mekanismen involvert i denne prosessen.
Metodikk /hovedfunnene
Vi viste at BCG induserer NIH-3T3 fibroblast spredning ved å aktivere MAPK og PI3K signalveier og også differensiering bestemmes av alfa-glatt muskel aktin (alfa-SMA) uttrykk.
In vivo
, intratumoral inokulering av BCG også økt alfa-SMA og kollagen uttrykk. Oral administrasjon av L-NAME forbedret pro-fibrotisk effekt av BCG. Bukhinnemakrofager hentet fra MB49 tumorbærende mus behandlet
in vivo
med kombinert behandling av BCG med L-NAME også forbedret fibroblast spredning. Vi observerte at FGF-2 er en av faktorene utgitt av BCG-aktiverte makrofager som er i stand til å indusere fibroblast proliferasjon. Involvering av FGF-2 ble påvist ved bruk av et anti-FGF2 antistoff. Samtidig, forbedret dette makrofag befolkningen sårheling hastighet i normale mus og FGF-2 uttrykk ble også økt i disse sårene.
Konklusjon /Betydning
Våre funn tyder på at fibroblaster er målrettet etter BCG både direkte og gjennom aktiverte makrofager i en immunterapi sammenheng med en blære murine modell. Vi har også beskrevet, for første gang, at FGF-2 er innblandet i en dialog mellom fibroblaster og makrofager indusert etter BCG behandling. Det faktum at L-NAME administrasjon forbedrer BCG effekt på fibroblaster, NO-hemming, kan representere en ny tilnærming for å legge til den konvensjonelle BCG behandling
Citation. Lodillinsky C, Langle Y, Guionet A, Góngora A, Baldi A, Sandes EO, et al. (2010) Bacillus Calmette Guerin induserer fibroblast Aktivering både direkte og gjennom Makrofager i en mus blærekreft Model. PLoS ONE 5 (10): e13571. doi: 10,1371 /journal.pone.0013571
Redaktør: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, Frankrike
mottatt: 5 mai 2010; Godkjent: 04.10.2010; Publisert: 22 oktober 2010
Copyright: © 2010 Lodillinsky et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CL, YL, AB, AME), og tilskudd fra Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas-PIP, og Universidad de Buenos Aires -UBACYT M017 (www.conicet.gov.ar . www.uba.ar). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på diagnosetidspunktet, 60-80% av blæren svulster er ikke-muskel invasiv og begrenset til urothelium og /eller lamina propria. Disse inkluderer papillærtumorer eller carcinoma in situ. Begge typer svulster forekommer ofte samtidig. I 1976 Morales et al. [1] rapportert, for første gang, den vellykkede intravesikal bruk av
Bacillus Calmette Guerin (BCG)
som en adjuvant behandling for ikke-muskel invasiv blærekreft etter transuretral reseksjon. Det er nå allment akseptert at intravesikal BCG er mer potent behandling i kreftsvulster tilbakefall enn noen intravesikal kjemoterapi [2]. Men om lag 20% av pasientene enten mislykkes i å svare innledning eller tilbakefall i løpet av de fem første år med behandling [3].
Det er kjent at BCG genererer en lokal immunologisk reaksjon med aktivering av immunceller så vel som sekresjon av cytokiner som involverer Th1-celle-cytotoksisitet [4]. En betydelig økning i polymorfonukleære og mononukleære celler som infiltrerer i blæretumorer etter BCG behandling er blitt observert [5]. Siden makrofager (MACS) er fagocyterende og antigenpresenterende celler og har kapasitet til å skille ut cytokiner og vekstfaktorer, blir de betraktet de best utstyrte celler involvert i BCG immunterapi. Avhengig av mikromiljøet, naturen og intensitet hvor MAC differensiering finner sted, er disse celler er i stand til å aktivere forskjellige reaksjonsveier og gi opphav til bestemte profiler [6]. Svarene på MACs etter skade eller infeksjon er eksempler på mange forskjellige stimuli som utløser MACs aktivering i vev, viser stor plastisitet. BCG, når det brukes som immunterapi for blæretumorer, blir behandlet av Mac og urotelialceller, noe som resulterer i tidlig frigivelse av inflammatoriske cytokiner, hvorav noen kan være ansvarlig for visse uønskede bivirkninger observert hos pasienter [7], [8]. Ett av mediatorer av denne inflammatoriske prosess er nitrogenoksid (NO), som genereres av en familie av NO synthases (Noss). Inflammatoriske cytokiner og /eller bakterielle produkter vanligvis aktivere ekspresjonen av induserbare NOS (iNOS) isoform, genererer store mengder av NO. iNOS er ikke uttrykt i normal epitel blæren men har blitt detektert i tidlige blære av tumorer [9], og det har blitt rapportert at iNOS-ekspresjon i tumorceller kan være assosiert med ikke-responsivitet til BCG [10]. Vi har tidligere rapportert at in vivo administrering av BCG til MB49-tumorbærende mus ble redusert tumorvekst, og at den kombinerte behandling av BCG med NOS-inhibitor L-NAME betydelig forbedret tumorregresjon ved å erstatte tumorvev etter kollagen depoter, likner sårheling [11] . Våre nåværende resultater tyder på at kontroll av blære tumor tilbakefall etter BCG behandling involvere stroma omorganisering og at ingen hemming kan forbedre vev remodeling. Sårheling er et eksempel på vev omorganisering, ettersom etter viklet generasjon, vekstfaktorer frigjort til den ekstracellulære matriks induserer en inflammatorisk prosess som gjør det mulig for cellevandring [12]. Blant annet Mac og fibroblast er viktige celler involvert i denne prosessen. Fibroblast migrerer mot den skadede sone, differensieres til myofibroblasts og syntetisere ekstracellulære matriseproteiner som tillater sammentrekning og endelig såret lukkes. I en sårtilheling sammenheng, vekstfaktorer slik fibloblast vekstfaktor-2 (FGF-2) og transformerende vekstfaktor beta (TGF-beta) som utskilles av MAC, stimulerer fibroblaster som er ansvarlig for syntesen, avsetning og remodellering av den ekstracellulære matriks [1. 3]. FGF-2 ble opprinnelig identifisert som en grunnleggende vekstfaktor som stimulerer proliferasjon av NIH-3T3-fibroblaster. Dessuten har flere studier vist en rolle av FGF-2 i vev fibrose, hvor denne faktoren økes i akutte sår og spiller en rolle ved dannelse av granulasjonsvev, reepithelization og vev remodellering [12], [14].
Så vidt vi vet, er det ingen informasjon om rollen i vev ombygging av BCG når de brukes i blærekreft behandling. Derfor er målet med vårt arbeid var å evaluere effekten av BCG på fibroblast aktivering, målt ved MAPK og PI3K signalveier og kollagen jeg, og alfa-glatt muskulatur aktin (alfa-SMA) uttrykk. Siden MAC er involvert i både BCG respons og i vev omorganisering som observert i ferd med sårheling [6], [15] Vi evaluerte også rollen til MAC henhold BCG behandling og ingen inhibering terapi, i fibroblast aktiverings i en sårheling modell . Våre funn tyder på at, som en del av mekanismene for blærekreft kontroll, BCG induserer aktivering av fibroblaster enten direkte eller gjennom MACs, at ved å slippe løselige produkter, kan i seg selv aktivere fibroblaster. Deltakelsen av NO som en negativ regulator av denne prosessen ble også demonstrert.
Resultater
BCG induserer NIH-3T3 spredning
Det har blitt beskrevet som BCG er i stand til å indusere cellesyklus og apoptose i blæren tumorcellelinjer [15], [16]. Men man kunne gjenstående spørsmålet være hva som ville være effekten av BCG på fibroblaster? For å besvare dette spørsmålet NIH-3T3 celler ble dyrket under ulike konsentrasjoner av BCG. Som vist på fig. 1A og 1B, BCG induserte proliferasjon av NIH-3T3-celler, evalueres både ved å telle antallet celler og ved MTS-analysen. Induksjon av fibroblast spredning ble oppdaget med BCG-konsentrasjoner fra 1,5 × 10
6 CFU /ml opp til 3 × 10
6 CFU /ml, minkende for høyere konsentrasjoner enn 6 × 10
6 CFU /ml. Våre resultater viser avvik når bestemmelsen av proliferasjon ble foretatt enten ved å telle antallet celler eller ved MTS (figur 1 A og B henholdsvis) til konsentrasjoner lik eller større enn 6 x 10
6 CFU /ml. Vi tror at denne forskjellen ble relatert å forbedre mitokondriell aktivitet indusert av høye mengder av BCG. Dermed ble følgende eksperimenter utført med 3 x 10
6 CFU /ml BCG som det er enighet mellom de to formene for kvantifisering. For å vurdere om PI3K og MAPK trasé er involvert i BCG-indusert fibroblast spredning, analyserte vi effektene av LY 294 002 og PD 98059, henholdsvis hemmere av PI3K og MAPK trasé, på fibroblast spredning indusert av BCG. Vi vurderte også fosforylering av ERK og AKT, to aktivert molekyler som er nøkkelen i disse banene. Vi har observert at LY (20 uM) var i stand til å inhibere proliferasjonen indusert av BCG etter 24 timer fra behandlingen (fig. 1C), og at PD (50 pM) hemmet proliferasjonen indusert av BCG etter 48 timer fra behandlingen (fig. 1D ). Som vist på fig. 1E og 1F, BCG behandling induserte en hurtig fosforylering av ERK- og AKT innen 5 min. Western blot-analyser viste at fosforyleringen av AKT ble stimulert mellom 5-10 min, reduseres etter 20 minutter (fig. 1E). BCG induserte også ERK1 og ERK2 fosforylering etter 5 min, som deretter avtok etter 30 minutter (fig. 1F). Dette samspillet mellom BCG og fibroblast innebærer både en spredning og overlevelse sti. Disse dataene tyder på at BCG mål ikke bare tumorceller og Mac, men også fibroblaster.
(A) NIH-3T3-fibroblaster ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BCG i 24 timer. Cellene ble telt eller (b) cellelevedyktigheten ble bedømt ved en ikke-radioaktiv celle titter metode (MTS), vs kontroll: p 0,05. (C) Effekt av LY 294002 og (D) PD 98059 evaluert ved MTS i fibroblast stimulert med BCG (3 x 10
6 CFU /ml) i 24 og 48 timer henholdsvis, a: p 0,05 vs kontroll b: vs BCG. Fibroblast stimulert med BCG (3 x 10
6 CFU /ml) og p-AKT (E) og p-ERK (F) bestemmes ved hjelp av Western blot. Relative fosforylering nivåer ble normalisert til total protein og omtales som en fold endring av kontroll, en: p. 0,05
Spredning av NHI-3T3 celler ble forsterket av L-NAME 0,5 til 4 mm (p 0,05) i en konsentrasjons-uavhengig måte (data ikke vist). Når fibroblaster ble behandlet med en kombinert protokollen, ble den høyeste aktiviteten spredning detektert med BCG 3 x 10
6 CFU /ml pluss L-NAME 2 mM (Fig 2). Denne effekten ble hemmet av LY 294 002 og PD 98059, og dermed indikerer at L-NAME er i stand til å forbedre BCG-indusert spredning i NIH-3T3 celler mediert av MAPK og PI3K signalveier.
NIH-3T3 fibroblast ble behandlet med BCG (3 × 10
6 CFU /ml), L-NAME (2 mm) eller BCG og L-NAME i nærvær av LY 294 002 og PD 98059 for 24 og 48 h hhv. Cellelevedyktigheten ble evaluert ved MTS. a: p 0,01 vs kontroll; b: p 0,05 vs BCG eller L-NAME alene; c. p 0,01 vs deres respektive kontroll
BCG induserer NIH-3T3 differensiering
Aktivering av fibroblaster i myofibroblasts, et viktig skritt i prosessen med sårtilheling, er preget av utvikling av intracytoplasmatisk spennings fibre der det gis til disse cellene evnen til å utvikle spenning, og ved økt syntese av ekstracellulære matrikskomponenter, så som kollagen type i [17], [18]. Det viktigste markør for fibroblast /myofibroblast fenotypiske overgang er novo expresión av alfa-glatt muskulatur aktin [19]. Så, vi analysert alfa-SMA og kollagen jeg som indikatorer på fibrogenic aktivitet og evaluert uttrykket av disse molekylene i NIH-3T3 celler behandlet med BCG.
For å etablere den beste dosen av BCG, immunfluorescens av både proteiner var utføres i fibroblaster behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BCG til 24 timer (data ikke vist). Den sterkeste ekspresjon av både alfa-SMA og kollagen ble observert med 3 x 10
6 CFU /ml av BCG (fig. 3A), og dermed denne konsentrasjonen ble valgt til å utføre Western blot analyser. Figur 3B viser at 3 x 10
6 CFU /ml av BCG var i stand til å indusere kollagen-ekspresjon etter 6 timers behandling, blir uttrykket 2,5 ganger høyere enn kontrollene etter 12 timers behandling. En signifikant induksjon av alfa-SMA etter 12 timer med BCG behandling ble observert, resterende øket ved 48 timer etter behandling. Til sammen viste dataene opp til nå, kan vi hypotese at fibroblast aktivering kan også skje in vivo.
(A) Immunofluoresce farging av NIH-3T3 behandles med BCG (3 × 10
6 CFU /ml) i 24 timer avslørte med anti-kollagen i og anti-alfa-SMA-antistoff. Scale: bar = 100 um. (B) Western Blot fra fibroblast-homogenater behandlet med BCG (3 x 10
6 CFU /ml) ved forskjellige tider for å være ensbetydende med kollagen I og alfa-SMA-induksjon. (C) Densitometriske enheter av kollagen I eller (D) alpha-SMA ble bestemt ved hjelp av analyse programvare, relativized til beta-aktin og omtales som en fold change of control a: p 0,05, b. P 0,01
BCG induserer fibroblast aktivering gjennom makrofager
in vitro Kjøpe og induserer kollagen og alpha-SMA uttrykk i MB49 svulster
in vivo
Som direkte behandling med BCG induserer fibroblast spredning og MACs er noen av de viktigste cellene i BCG svar, vi en hypotese om at det er en dialog mellom fibroblaster og MACs henhold BCG behandling. For å teste dette, undersøkte vi om MACs behandlet med BCG kan påvirke spredning og differensiering av fibroblaster. Først vurderte vi ingen produksjon i MACs behandlet med BCG. Som vist på fig. 4A, peritoneal MAC fra tumor-bærende mus som ble behandlet in vivo med BCG produserte høyere mengder av NO enn dem fra ikke-behandlede seg. In vitro behandling av MAC-cellelinjen RAW 264.7 med BCG også økt NO-produksjon. For å vurdere rollen til de løselige produkter utgitt fra MAC, vi fått betinget media (CM) fra peritoneal MACs fra tumor-bærende mus enten behandlet in vivo eller ikke med BCG +/- L-NAME. Vi observerte at CM fra peritoneale MAC fra tumor-bærende mus (MAC-T) for de forskjellige gruppene induserte fibroblast proliferasjon. Spesielt, den CM av MAC fra tumorbærende mus behandlet in vivo med BCG (MAC-T-BCG) pluss L-NAME induserte den høyeste fibroblaster formeringshastigheten in vitro. CM fra ubehandlet RAW 264,7 endret ikke fibroblast spredning. Imidlertid er in vitro-behandling av RAW 264.7 med BCG, enten i kombinasjon eller ikke med L-NAME, på samme måte som peritoneal MAC, også induserte NIH-3T3-spredning (Fig. 4B).
(A), NO-produksjon ble bestemt i supernatantene fra begge peritoneale MAC fra MB49-tumorbærende mus (MAC-t) og RAW 264.7 celler behandlet in vivo med BCG (6 x 10
6 CFU /ml) eller in vitro (3 x 10
6 CFU henholdsvis /ml), ble undersøkt i supernatanten av Griess-reagens. a: p 0,0001 vs kontroll. RAW 264.7-celler ble behandlet med BCG (3 x 10
6 CFU /ml) i 24 timer, og deretter ble cellene vasket grundig med PBS. Serum-fritt medium ble tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 24 timer for å oppnå den CM. (B) fibroblast behandlet i 48 timer med CM fra peritoneal eller RAW 264.7 celler tidligere er behandlet med BCG (3 × 10
6 CFU /ml) pluss L-NAME (2 mm). Fibroblast Levedyktigheten ble evaluert ved MTS og betegnet som en prosent av kontroll (RAW 264.7 eller NIH-3T3 ubehandlet cellelinjer), a: p 0,05 og b: p 0,01 vs kontroll c: p 0,05 vs MAC-T kontroll. (C) Western Blot for å avgjøre kollagen I og alpha-SMA fra fibroblast homogenates behandlet i 24 timer med CM fra RAW 264,7 tidligere behandlede i 24 timer med BCG pluss L-NAME. Relativ uttrykk nivået var normalisert til beta-aktin og omtales som en fold endring av kontroll, en: p 0,05, b: p 0,01. (D) Masson Trichome (øverst panel) og immunhistokjemisk farging (nederst panel), for å fastslå kollagenfibre og alpha-SMA henholdsvis ble utført i MB49 svulster vokser subkutant i mus behandlet med BCG, L-NAME eller BCG + L-NAME. Hvite piler viser blå flekk av kollagenfibre. Gule piler viser brun positiv farging for alpha-SMA. Scale. Bar = 100 um
CM hentet fra RAW 264,7 indusert kollagen jeg uttrykk i fibroblaster. Uttrykket var høyere når CM var fra MACs behandlet med BCG, og denne effekten ble holdt seg høy i henhold til L-NAME tillegg. CM oppnådd fra RAW 264,7 behandlet med BCG pluss L-NAME også induserte alfa-SMA-ekspresjon (Fig. 4C). Disse resultater synes å indikere at det er noen løselige faktorer utskilt fra MAC aktiveres av BCG som kan indusere fibroblast proliferasjon og aktivering. Med sikte på å evaluere denne virkning in vivo vi analyserte kollagen avsetning og alfa-SMA-ekspresjon i MB49 tumorbærende mus i henhold til BCG og L-NAME-behandling. Våre resultater viste at både BCG og L-NAME og deres kombinasjon indusert deponering av kollagenfibre i disse svulstene. BCG og L-NAME også indusert ekspresjon av alfa-SMA sammenlignet med kontrollgruppen. Imidlertid ble mer intens farging av alfa-SMA observert i tumorer behandlet med BCG pluss L-NAME. Disse resultatene antyder at BCG kan indusere aktivering av fibroblaster in vivo, og at denne effekten forsterkes ved inhibering av NO-produksjon.
Nitrogenoksid hemning forbedrer
in vivo
sårheling indusert ved peritoneal MAC fra tumorbærende mus behandlet med BCG
for å bestemme den funksjonelle kapasiteten til MAC etter BCG behandling og regulering av NO, ble en in vivo eksperiment sårtilheling utført. Peritoneal MAC-T, enten behandlet eller ikke med BCG in vivo ble plassert i en dorsal hud sår hos normale mus. Den INGEN hemmere L-NAME og 1400W ble lagt i sårene, enten alene eller i kombinasjon med MAC. Overflaten Såret ble signifikant redusert når MAC fra normal- (data ikke vist) eller MAC-T ble tilsatt på såret, sammenlignet med kontrollene, hvor bare PBS-glycerol-løsning ble tilsatt. Det er viktig å merke seg at tilsetningen av NO-inhibitorer L-NAME eller 1400W alene var i stand til å betydelig redusere overflate såret. Når peritoneal MAC fra tumor-bærende mus som hadde mottatt BCG intratumorally (MAC-T-BCG) ble tilsatt på såret, ble prosentandelen av sårlukking redusert, sammenlignet med sårene med MAC-T. Men når disse MAC-T-BCG ble lagt med 1400 W, såret helbredende hastigheten ble betydelig økt (Fig. 5A).
(A) Peritoneal MACs fra svulst bærende mus enten behandlet eller ikke med BCG ( MAC-T-BCG og MAC-T respektivt), ble plassert i rygghuden sår hos normale mus. L-NAME (2 mm) eller 1400 W (1 UM) ble lagt inn på såret. Den til lukking av sår ble beregnet som prosent av det opprinnelige sårområdet (dag null), a: p 0,01, b: p 0,001 vs PBS-gli, c: p 0,05 vs MAC-T-BCG kontroll. (B) Peritoneal MACs-T-BCG ble plassert i rygghuden såret av mus behandlet oralt med L-NAME (0,2 g /kg mus), en: p 0,0001 vs PBS-gli, b: p 0,01 vs MAC-T -BCG kontroll.
Når rygghuden såret ble dannet i mus som drikker NO inhibitor L-NAME, ble overflaten såret redusert sammenlignet med kontrollgruppen. MAC-T-BCG tillegg også induserte akselerasjon av sårheling. Dessuten MACs-T-BCG tillegg forbedret såret reparasjon når mus fikk L-NAME oralt (fig. 5B).
FGF-2 formidler den stimulerende effekten av BCG-aktiverte makrofager på fibroblaster
Det er blitt demonstrert at FGF-2 er en av de viktigste vekstfaktorer som er involvert i fibroblast proliferasjon [20]. Dessuten har det vist seg at FGF-2 er i stand til å inhibere apoptose i NIH-3T3-celler som ble behandlet med cytostatika [21]. Således har vi antatt at FGF-2 kan være en av de løselige faktorer utskilt av aktiverte MAC i stand til å stimulere proliferasjonen av fibroblaster. For å bekrefte denne ideen, vi først analysert enten FGF-2 er modulert i MACs RAW 264.7 celler etter BCG behandling. Figur 6A viser, ved Immunofluorescence farging, som er FGF-2 økte i MAC RAW 264,7 behandlet med BCG sammenlignet med ubehandlede celler. Dette ble også observert ved western blot analyse (figur 6B), hvor det kan sees et bånd på 17,2 kDa compatibly med sekretorisk FGF-2. Bånd med høyere molekylvekt representerer ikke-sekretorisk FGF-2. Vi utførte deretter en proliferasjonsanalyse med CM avledet fra RAW 264.7 aktivert med BCG, utarmet eller ikke av FGF-2. CM fra RAW 264,7 behandlet med BCG øket fibroblast proliferasjon, mens uttømming av FGF-2 en betydelig reduksjon av fibroblast stimulering, noe som tyder på at BCG-aktiverte MAC kan indusere fibroblast proliferasjon, i det minste delvis, av FGF-2 sekresjon. Fibroblaster migrere inn i såret, hvor de prolifererer og produserer store mengder av ekstracellulær matriks. Noen fibroblaster differentiante inn i myofibroblasts, som er ansvarlig for såret sammentrekning og avsetning av ytterligere matrisen [22]. For å vurdere om MAC fra tumorbærende mus behandlet med BCG er i stand til å indusere FGF-2 in vivo ekspresjonen av FGF-2 ble evaluert enten i sårheling analyser. Foruten, vurderte vi også FGF-2 uttrykk i MB49 svulster. Histologisk analyser fra huden sår viste økt ekspresjon av FGF-2 i sår med MAC-T-BCG. Når disse MACs ble plassert sammen med NO-hemmere på sår, forble FGF-2 uttrykk høy (Fig. 6D). Det høye nivået av FGF-2 var i overensstemmelse med den økte helbredelseshastigheten som ble vist i fig. 5. Videre ble lignende resultater observert i MB49 svulster, hvor ekspresjonen av FGF-2 var høyere i tumorer fra mus som var behandlet enten med BCG eller med L-NAME enn i kontrollene. Svulster som stammer fra mus som fikk den kombinerte behandlingen viste mer lokaliserte og intensiv FGF-2 flekker (Fig. 6E). I denne modellen viser våre resultater at FGF-2 er forbundet med virkningsmekanisme BCG immunterapi.
(A) Immunofluorescens farging med anti-FGF-2-antistoff fra RAW 264.7 MAC behandlet med BCG (3 x 10
6 CFU /ml) i 24 timer. (B) Western blot av lysater av RAW 264,7 behandlet med BCG (3 x 10
6 CFU /ml) i 8 og 24 timer. 20 ng av renset murint FGF-2 ble anvendt som en positiv kontroll. Relativ uttrykk nivået var normalisert til GAPDH og omtales som en fold endring av kontroll, en: p 0,05 (C) fibroblaster ble behandlet med CM fra RAW 264.7 celler som tidligere er behandlet med BCG (3 × 10
6 CFU /ml), L-NAME eller BCG pluss L-NAME for 24 timer. Kontroll ble gjennomført med utmattet kultur media (CM 3T3, fra de samme NIH-3T3-celler). 0,5 ng /ml FGF-2 in CM 3T3 ble benyttet som en positiv kontroll. NIH-3T3 proliferasjon ble målt ved
3 (H) tymidin inkorporering. CM ble preinkubert i 1 time med 10 ug /ml av det blokkerende monoklonale anti FGF-2-antistoff (DB3), eller normal IgG som en kontroll, a: p 0,001 vs CM NIH-3T3, b: p 0,001 vs IgG. (D) Immunohistokjemisk farging til besluttede FGF-2-ekspresjon ble utført i sår på huden. Sår ble behandlet med peritoneal MACs fra tumorbærende mus behandlet eller ikke med BCG (MAC-T og MAC-T-BCG respectivesly) alene eller lokalt kombinert med NO-hemmere (E). Immunhistokjemisk farging av FGF-2 ble utført i s.c. MB49 svulster fra mus behandlet med BCG, L-NAME eller BCG pluss L-NAME. Scale:.. Bar = 100 um
Diskusjoner
Intravesikal behandling med BCG spiller en viktig rolle i behandling og forebygging av residiverende ikke-muskel invasiv blære carcinoma [23]
Shelley et al. [24] har nylig beskrevet i en meta-analyser studie som BCG brukt som adjuvans etter transuretral reseksjon reduserte risikoen for tilbakefall med 67% ved 12 måneder sammenlignet med transurethral reseksjon alene; imidlertid noen bivirkninger slik som cystitt, feber og hematuria, var assosiert med BCG administrasjon. Den nøyaktige mekanismen for antitumoraktivitet av BCG er ikke helt forstått, men det ser ut til at BCG involverer både direkte effekter på tumorceller [16] og indirekte virkninger som medieres av immunceller [7].
Vi har tidligere rapportert som BCG Wass i stand til å indusere veksthemming av MB49 blæretumorceller enten in vitro eller in vivo inokulert inn i syngeniske mus NO som produseres av MB49 kreftceller behandlet med BCG induserte MAC og splenocytter død, således som tyder på en in vivo immunundertrykkende funksjon av NO. Våre eksperimenter viste også en større hemning av tumorvekst i mus behandlet med BCG i kombinasjon med L-NAME sammenlignet med BCG alene. I det første tilfellet ble det få gjenværende tumorceller fullstendig omgitt av kollagenfibre [11].
I det foreliggende arbeid, undersøker vi noen av de mekanismer som BCG og L-NAME genererer arret vi beskrevet tidligere. MAPK og PI3K signalveier har blitt mye studert i forskjellige modeller. Disse aktiveres av ulike stimuli, slik som vekstfaktorer og cytokiner [25], [26]. Våre nåværende funn viser at BCG er i stand til å direkte indusere NIH-3T3 fibroblast spredning gjennom MAPK og PI3K signalveier, kollagen uttrykk og fibroblast differensiering som bestemmes av alfa-SMA uttrykk. Dessuten immunhistokjemi av svulster fra BCG behandlet mus, viste økt uttrykk av kollagenfibre og alpha-SMA, noe som tyder på at fibroblast aktivering kan også skje.
Vi tror at BCG kan handle på stroma rundt kreftceller som kan forbli etter tumor-reseksjon eller på en ny stigende svulst. Dermed vil den felles aktivitet av fibroblast og immunceller aktiveres av BCG og den direkte virkning på tumorceller som reduserer risikoen for tilbakefall. Konsentrasjonen av BCG brukes i hvert drypping i pasienter, er tilnærmet av 10
7 cfu /ml (totalvolum 50 ml). Vi vet ikke nøyaktig dosis som mottar stroma, likevel, i våre eksperimenter bruker vi 3 × 10
6 CFU /ml, som er den beste dosis som induserer fibroblast proliferaton in vitro, å være en lavere orden enn den som brukes i instillasjon av pasienten. Således, spekulere vi at mengdene av BCG vi benytter in vitro er nesten fysiologisk.
Det er kjent at bakterielle stimuli er i stand til å indusere NO produksjon i Mac [27]. Her viste vi at etter BCG behandling, RAW 264.7 og MAC-T var i stand til å øke NO nivåer in vitro og in vivo henholdsvis og CM fra RAW 264,7 behandlet in vitro med BCG induserte fibroblastproliferering og øket kollagen I ekspresjon. På grunn av involvering av NO i ulike aspekter av fysiologiske og patologiske prosesser, har NOS inhibitorer fått fremtredende i de involverte i sårheling, angiogenese og inflammatoriske respons på cytokiner [28], [29], [30] mekanismer. Siden CM fra MAC-T-BCG-L-NAME induserte den høyeste fibroblastproliferering hastighet, kunne vi spekulere at i denne cellepopulasjon, inhibering av NO induserer frigjøring av noen løselige faktorer, i stand til å øke fibroblast proliferasjon og aktivering. Dessuten kan vi ikke forkaste at INGEN hemming kan også endre sekresjon mønster av disse løselige faktorer. Så vidt vi vet er det ingen rapporter som viser samspillet mellom Mac og fibroblast i blærekreft. I overensstemmelse med våre resultater, ved hjelp av en lungetuberkulose modell, har det blitt beskrevet økt spredning av pulmonal fibroblast av CM av alveolære makrofager stimulert med BCG [31]. Samtidig observerte vi samsvar mellom effekten av in vivo behandling av urinblæren tumos og in vitro-analysen. En markant uttrykk av kollagenfibre og alpha-SMA ble observert i tumorer behandlet med BCG, L-NAME og BCG pluss L-NAME, blir effekten mer uttalt med den kombinerte behandlingen.
Rollen av NO i dermal fibroblast proliferasjon har tidligere blitt beskrevet av Chen et al [32], som er foreslått at inhibering av dermal fibroblast proliferasjon av UV-lys, kan være relatert til den opp-regulering av iNOS genekspresjon og således til NO over-sekresjon i enig med disse resultatene vi kan tyde på at NO-produksjon er en negativ regulator av fibroblast proliferasjon og aktivering når BCG anvendes i blærecancerterapi.
Svulster og sår dele noen komponenter, slik som inflammatoriske forbindelse [22]. Men mens i sår betennelse er forbigående, i tumorer denne prosessen er foreviget i tid, noe som gjør denne endringen ble et mål for tumorvekst kontroll. I 1986, Dvorak postulerte begrepet «svulster er sår som ikke leges», og en hypotese at sammensetningen av tumoren stroma ligner på granulasjonsvev av helbredelse huden sår, noe som antyder at epiteltumorer fremme dannelsen av deres stroma ved å aktivere såret helbredende reaksjon på verts [22], [33]. Basert på denne hypotese, genererte vi en dorsal hud sår assay for å vurdere rollen til makrofager under forskjellige behandlinger i en modell hvor fibroblaster har en nøkkelfunksjon. Vi evaluerte kapasiteten på MAC-T-BCG å hjelpe i sårheling. Vi observerte at eksogene MACs-T akselerert helbredelsesprosessen, men tvert imot MACs-T-BCG redusert healing hastighet sammenlignet med MAC-T. Imidlertid, i nærvær av en NO-inhibitor, ble det til lukking av sår akselerert, noe som tyder på at NO utgitt av MAC-T-BCG forsinker helbredelsesprosessen. For å vurdere rollen til endogent NO av verten, ble L-NAME oralt til sår bærende mus, såret nedleggelse var betydelig raskere når MACs-T-BCG ble plassert i sårene. I sammendraget, våre resultater tyder på at, i tillegg til NO slippes ut på såret etter MAC-T-BCG, andre celler som produserer NO i sår bærende mus spiller en negativ rolle i helbredelsesprosessen. Informasjon relatert til ingen aktivitet i sårheling er kontroversielt. Enkelte forfattere har vist at NO induserer en angiogen prosess som er nødvendig for en god helbredelse [29], [34], mens andre har vist at apoptose indusert av NO er i stand til å inhibere sårheling [30]. På basis av resultatene kan vi spekulere at NO som genereres av MAC-T-BCG eller ved de gjenværende cancerceller kan forsinke vev reorganisering under BCG immunoterapi.
Avvikende funksjoner av vekstfaktorer, såsom FGF-2 eller TGF-beta, i sårheling og kreft har også blitt rapportert.
