Abstract
The Hedgehog (HH) signalveien er kritisk for normal embryoutvikling, vev mønster og celledifferensiering. Avvikende HH signalering er involvert i flere kreft hos mennesker. HH signale innebærer en multi-protein kaskade aktivere GLI proteiner som transcriptionally regulerer HH målgener. Vi har tidligere rapportert at HH-signalering er nødvendig for human tykktarmskreft celleoverlevelse og inhibering av dette signal induserer DNA-skade og omfattende celledød. Her kan vi rapportere at HH /GLI akse regulerer human telomerase revers transkriptase (hTERT), som bestemmer replikasjonspotensialet av kreftceller. Undertrykkelse av GLI1 /GLI2 funksjoner ved et C-terminus avkortet GLI3 repressor-mutant (GLI3R), eller ved GANT61, et farmakologisk inhibitor av GLI1 /GLI2, redusert hTERT proteinekspresjon i human tykktarmskreft, prostatakreft og glioblastoma multiforme (GBM) cellelinjer . Ekspresjon av et N-terminus slettet konstitutivt aktiv mutant av GLI2 (GLI2ΔN) øket hTERT mRNA og protein ekspresjon og hTERT promoter drevet luciferase-aktivitet i humane tykktarmskreftceller, mens GANT61 inhiberes hTERT mRNA-ekspresjon og hTERT promoter drevet luciferase-aktivitet. Kromatin immunoutfelling med GLI1 eller GLI2 antistoffer utfelt fragmenter av hTERT-promoteren i humane tarmkreftceller, som ble redusert ved eksponering for GANT61. I motsetning til ekspresjonen av GLI1 eller GLI2ΔN i ikke-maligne 293T-celler ikke klarte å endre nivåene av hTERT mRNA og protein, eller hTERT promoter drevet luciferase-aktivitet. Videre er ekspresjon av GLI2ΔN øket telomerase enzymaktivitet, som ble redusert med GANT61 administrering i human tykktarmskreft, prostatakreft, og GBM-celler. Disse resultater identifiserer hTERT som et direkte mål for den HH signalveien, og viser en tidligere ukjent rolle HH /GLI akse i regulerer replikering potensialet av kreftceller. Disse funnene er av betydning for å forstå viktige reguleringsmekanismer som bestemmer funksjonene til HH /GLI signalering i kreftceller
Citation. Mazumdar T, Sandhu R, Qadan M, DeVecchio J, Magloire V, Agyeman A, et al. (2013) Hedgehog Signa Regulerer Telomerase revers transkriptase i humane kreftceller. PLoS ONE 8 (9): e75253. doi: 10,1371 /journal.pone.0075253
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 29 mars 2013; Godkjent: 13 august 2013; Publisert: 25.09.2013
Copyright: © 2013 Mazumdar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å erkjenne økonomisk støtte fra NCI award RO1 CA 87952 (JAH), og fra Cleveland Clinic. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Klassisk HH signale starter når de løselige HH ligander, Sonic (SHH), Desert (DHH) eller indisk (IHH) HH binde deres transmembrane reseptor Lappet (ptch), og dermed slippe trans protein, glattet (Smo) fra ptch-mediert hemming. Smo aktiverer deretter den GLI familie av transkripsjonsfaktorer som regulerer HH målgener. Den GLI familie av transkripsjonsfaktorer inkluderer GLI1, GLI2 og GLI3. I kraft av en C-terminal aktivator og N-terminale repressor-domener, GLI2 og GLI3 ha kontekstavhengige aktivator eller repressor aktivitet. GLI1 mangler repressoren domene og fungerer hovedsakelig som en aktivator [1], [2]. GLI2 har en C-terminal aktivator og N-terminale repressor-domener [3]. GLI2 er rapportert å være den første formidler av HH signaleringshendelser, som så induserer ekspresjon GLI1, noe som ytterligere øker HH target-genekspresjon [4]. Når HH signalveien er aktiv, de latente cytoplasmatiske GLI proteiner translocate til kjernen hvor de binder de GACCACCCA-lignende elementer på arrangører av HH-målgener [5], [6]. HH signale regulerer cellulære hendelser ved å modulere spesifikke målgener. Under normal embryoutvikling, er HH signaleringsaktivitet nødvendig, reguleres romlig og tidsmessig noe som resulterer i normalt vev mønster og differensiering. Koordinerte HH signalering er også involvert i cellulær proliferasjon og overlevelse, vedlikehold av stemness og bestemmelse av celle skjebne [6]. Abnormt aktiverte HH signalering er involvert i flere humane kreftformer, og den regulerer kreftcellevekst, overlevelse, kreft stilk cellefunksjoner, epitelial til mesenchymale overgang og metastase [6]. Vi har rapportert at HH signalering er kritisk for overlevelsen av humane tarmkreftceller, mens den blokkerer disse signalene induserer hurtig DNA-skade, som kulminerte i utstrakt cytotoksisitet [7], [8], [9], [10]. Ubegrenset replikasjon potensialet av kreftceller er nært assosiert med kreft celleoverlevelse, men rolle HH signalering i replikasjonspotensialet av kreftceller er ikke kjent.
Replikering potensialet av humane somatiske celler er begrenset av spesielle strukturer heterochromatic kjent som telomerer ved endene av lineære kromosomer [11]. Pattedyr telomerer består av tandem-repetisjoner av TTAGGG-sekvenser som er utsatt for korte til hver DNA-replikasjonssyklus [12]. Konvensjonelle DNA-polymeraser ikke er i stand til fullt ut å replikere endene av lineære DNA-molekyler; dermed er telomeric DNA forventet å forkorte med hver DNA replikasjonssyklus. Kritisk forkortede telomerer mislykkes i å beskytte kromosomendene som resulterer i irreversibel vekst arrest og begrenset cellular levetid. Derfor er telomere homeostase kritisk for cellevekst og overlevelse. Telomerase, en ribonucleoprotein består av en RNA komponent (TR) og en revers transkriptase katalytisk subenhet (TERT), fylles telomere repetisjoner og dermed regulerer cellulær replikasjonspotensial [13]. I de fleste voksne celler, er TR konstitutivt til stede, men TERT ekspresjon er undertrykt, noe som resulterer i begrenset spredning potensiell cellulær og levetiden [14], [15]. I aktivt prolifererende celler slik som stamceller og kreftceller, er tert ekspresjon oppregulert resulterer i ubegrenset replikasjonspotensial og udødelig av disse cellene [16]. Menneskelig TERT (hTERT) uttrykk og aktivitet har blitt dokumentert i 75% av menneskelige kolorektal kreft celler, men bare 3-15% av normal slimhinne og omkringliggende ikke-kreftceller [17]. I samråd med sin betydning i kreftcelleoverlevelse, er hTERT strengt regulert med flere aktivatorer og repressors, hvorav flere har blitt identifisert.
Her demonstrerer vi for første gang at HH signaliserer trancriptionally oppregulerer hTERT. Undertrykkelse av GLI1 /GLI2 redusert hTERT protein nivåer i menneskelige tykktarm, prostata og hjernekreftceller. Overekspresjon av GLI2ΔN økte nivåer av hTERT mRNA, protein og hTERT promoter-drevet luciferase (luc) aktivitet i tykktarm kreft celler. Blokkering GLI1 /2 aktiviteten redusert hTERT mRNA uttrykk og direkte interaksjon mellom GLI1 /GLI2 proteiner og hTERT promoter i humane tykktarmskreftceller. I motsetning til dette ble GLI1 /GLI2ΔN ekspresjon i ikke-kreft 293T-celler ikke endre nivåene av hTERT mRNA, protein eller hTERT promoter-luc-aktivitet. Lertid HH signalering i kreftceller redusert telomerase-aktivitet, som ble øket av GLI2ΔN ekspresjon. Disse resultatene demonstrerer hTERT å være en transkripsjons målet for HH signalveien og identifisere en tidligere ukjent rolle HH /GLI akse i regulerer replikering potensialet av kreftceller. Disse funn viser en ny funksjon av HH signalering i å øke den replikative evnen til kreftceller. Av interesse, regulerer HH signale hTERT i en kontekstavhengig måte i humane kreftceller, i motsetning til ikke-ondartede celler, som kan ha implikasjoner i kreftbehandling.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
HT29, SW480, HCT116 og 293T celler ble hentet fra American Type Culture Collection. C4-2, DU145 og PC3 cellene var snill gaver av Dr. Alexandru Almasan (Cleveland Clinic, OH). U87-celler var en slags gave av Dr. Candece Gladson (Cleveland Clinic, OH). Cellene ble rutinemessig kontrollert ved mikroskopisk analyse av celle-morfologi, vekstkarakteristikker, og som reaksjon på cytotoksiske midler [Annexin V /propidiumjodid (PI) farging]. cDNA microarray gene profiler var også karakteristisk og cellene ble bekreftet biannually å være mycoplasma-fri. HT29, HCT116, SW480, c4-2, DU145 og PC3 cellene ble opprettholdt i 10% FBS-supplert RPMI medium mens U87 og 293T celler ble opprettholdt i 10% FBS-supplert DMEM. Cellene ble trypsinert og telt ved bruk av en Z2 Coulter partikkeltelling og størrelse analysator (Beckman Coulter). For Vest-analyse, ble antistoff mot HSP90α /β kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology; anti-GLI1 og anti-hTERT-antistoffer var fra Novus Biologicals, og anti-GLI2 antistoff var fra Cell Signaling Technology. Anti-c-myc-antistoff (9E10) ble oppnådd fra hybridom Core, Lerner Research Institute. GANT61 ble kjøpt fra Calbiochem. Dr. Graham W. Neill (Queen Mary University of London, UK) vennlig levert den GLI1 og GLI2ΔN plasmider i pBabe-Puro (PBP) pattedyr ekspresjonsvektor. Full-lengde hTERT-PBP plasmid var en gave fra Dr. Robert Weinberg (Addgene plasmid # 1771).
Western Blot analyse
Totalt cellulære lysatene ble tilberedt med RIPA lysebuffer (Cell Signaling Technology ). Protein (60 ug) ble løst i 10% eller 5% SDS-PAGE-geler. Separerte proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner og deretter blokkert i blokkeringsbuffer [5% fettfri tørrmelk i 1 x Tris-buffer saltløsning med 0,1% Tween 20 (TBS-T)] i 1 time. Membranene ble vasket i 1 x TBS-T, inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C, vasket og inkubert med sekundært antistoff i 1 time, og til slutt utviklet ved hjelp av Super Signal Pico substrat fra Pierce Bioteknologi.
RNA isolasjon og mRNA Analyse
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Qiagen RNeasy mini kit ifølge produsentens protokoll. Total RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp av tilfeldige primere (iScript Velg cDNA syntese kit, BIO-RAD), og brukes for sanntids mRNA uttrykk analyse ved hjelp av 40 sykluser av Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR instrumentering og programvare. -Primere ble utformet ved hjelp av NCBI /Primer-BLAST og anvendes for å generere PCR-produkter. De GLI1, GLI2 og GAPDH primere ble tidligere beskrevet [9]
hTERT fremover primer. 5′-CCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3 «.
hTERT revers primer: 5′-CAGCCTTGAAGCCGCGGTTGA-3′.
GLI3R og Forbigående transfections
myc-merket C-terminalen slettet konstruere GLI3R (gave av Dr. Ariel Ruiz jeg Altaba, Universitetet i Genève Medical School, Genève, Sveits) har tidligere blitt beskrevet (3). HT29 celler ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000.
(Invitrogen) med GLI3R eller tom vektor pCS2-MT (Gitt av Dr. David Turner, på molekylært Behavioral Neuroscience Institute, University of Michigan, Ann Arbor , MI). Celler ble brukt til eksperimenter 24 timer, 48 timer eller 72 timer posttransfection.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
celler behandlet med GANT61 (20 mm) for 24 timer ble kryssbundet i 1% formaldehyd /PBS, 10 min, 37 ° C, som ble avsluttet i glycin, 5 min. Cellene ble vasket i PBS og nukleære ekstrakter fremstilt. Kjerner ble ultralydbehandlet for å generere kromatin fragmenter (≈ 500-800 bp). Den kromatin ble forbehandlet med en blanding av proteinA-sepharose og proteinG-sepharose som er blokkert med bovint serumalbumin (1 mg /ml) og laksesperm-DNA (1 mg /ml). 10% av klaret kromatin ble anvendt som inngangskontroll. Like mengder av preklarede kromatin fragmenter ble immunopresipitert med antistoffer spesifikke for GLI1 (Novus Biologicals, CO), GLI2 (Cell Signaling Technology (MA), IgG (Abcam, MA, negativ kontroll), eller histon H3 (Abcam, MA, positiv kontroll ). Fremgangsmåter ble utført som tidligere beskrevet (3, 4). de immunoutfelte produkter ble vasket grundig og eluert. 30 pl av de eluerte produkter ble behandlet med RNase A og proteinase K, fulgt av revers tverrbinding og DNA-isolasjon. Gene spesifikke primere kvantifisert mengdene av hTERT og BCL-2-promotor-DNA i de immunoutfelte fraksjoner. PCR-produktene ble løst på en 1% agarosegel farget med etidiumbromid, og visualisert under UV-lys.
primere som brukes for chip analyse er som følger:
hTERT arrangøren frem: 5′-TGATGGGGACCGTTCCTTCCATC-3 «
hTERT arrangøren omvendt. 5′-ACACGGCCCACCCAGGGTTTA-3′.
BCL2-promoter fremover : 5′-CCGGACGCGC CCTCCC-3 «
BCL-2 promoter omvendt. 5′-GGTGCCTGTCCTCTTACTTCATTCTC-3′.
Luciferase Assay
full-lengde hTERT promoter (-3337 /+ 438), og oppstrøms delesjonsmutanter (-1226 /+ 438 og -233 /+ 438) -driven luciferaserapportørplasmid konstruksjoner ble vennlig levert av Dr. Ralf Janknecht, University of Oklahoma Health Sciences Center, OK [18] . HT29 eller 293T-celler ble transient transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) med 4 mg av luciferase reporter og 0,4 mg pRLTK (Renilla luciferase drevet av TK promotor). 24 timer etter transfeksjon, ble cellene analysert ved hjelp av den doble luciferase-kit (Promega Corporation) i henhold til produsentens protokoll. Luciferase aktivitet ble oppdaget ved hjelp Victor2 multilabel teller, og normalisert til Renilla luciferase aktivitet som en kontroll for transfeksjon effektivitet.
Telomerase Gjenta Amplification Protocol (trap) Analyse
Celler ble lysert i 1X CHAPS lysisbuffer og 0,25 pg av lysatene ble brukt til å utføre TRAP analyse. 1 ug av TS primer ble endemerket med 3 ul av γ
P32ATP (Perkin Eimer) ved anvendelse av 1 ul PNK (NEB) i et 20 pl reaksjon ved 37 ° C i 45 minutter og renset gjennom en Sephadex G-25 søyle. I hver reaksjon, 2 pmol av γ-32P ende-merket TS primere og revers primere for PCR-amplifikasjon ble blandet med 0,05 mM dNTP, 20 mM Tris • Cl pH 8,3, 1,5 mM MgCl
2, 63 mM KCl, 0,05 % Tween 20, og 1 mM EGTA. 20 ng av RNase A ble tilsatt med cellelysatet i reaksjoner som ble behandlet med RNase. Telomerase-mediert primer-forlengelse ble utført ved 30 ° C i 30 minutter, etterfulgt av PCR-amplifikasjon ved anvendelse av TS og revers primere. Produkter fra TRAP analyser ble analysert på 12,5% ikke-denaturerende PAGE. TIFF-filer av de skannede gel bildene ble kvantifisert ved densitometri hjelp Image J programvare og telomerase aktivitet ble bestemt ved hjelp av formelen nevnt i produsentens protokoll for trapes Telomerase deteksjon kit (Chemicon International Inc., MA).
Statistisk analyse
Alle de statistiske analysene ble utført ved hjelp av Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Resultater
HH Signa oppregulerer hTERT Expression i humane kreftceller
feilregulert HH signalering er kjent for å fremme celleproliferasjon, cellesyklusprogresjon og celleoverlevelse i humane kreftceller, og dermed ble det ansett at det aktiverte HH reaksjonsveien kan også spille en rolle i replikasjonen potensialet av kreftceller. Telomerase, en viktig regulator av replikering potensial og nært knyttet til mobilnettet spredning og overlevelse, er derfor en sterk kandidat for regulering av aktivert HH signalering i kreftceller. For å teste denne hypotese, ble forholdet mellom HH /GLI signale akse og telomerase ekspresjon undersøkt på flere humane kreftcellelinjer. Vi avskaffet HH /GLI signaleaksen i flere humane kreftcellelinjer med farmakologiske hemmere og målt telomerase uttrykk. Humane tarmkreftceller HT29 og SW480, utsatt for GANT61 (20 uM), et lite molekyl inhibitor av GLI1 og GLI2 [9], i 72 timer viste reduserte likevektsnivåer GLI1, GLI2 og hTERT-proteiner (Fig. 1A). Tilsvarende blokkering HH /GLI signalering i prostata kreft celler c4-2, DU145 og PC3 også demonstrert redusert GLI1, GLI2 og hTERT protein uttrykk (Fig. 1a). Administrering av GANT61 (20 uM) for å GBM cellelinjen U87 over en periode på 72 timer resulterte i redusert GLI1, GLI2 og hTERT protein uttrykk (Fig. 1B). Vi validert ytterligere effekter av HH signalveien på hTERT uttrykk av genetisk modifisering av HH /GLI signalveien. Vi benyttet en C-terminal slettet mutant av GLI3 (GLI3R, myc-merket GLI3C’DCla1 [3]), som undertrykker GLI1 og GLI2 aktivitet [8]. Følgende transient transfeksjon av GLI3R inn i HT29 (. Densitometrisk kvantifisering i figur 2A) og HCT116 (Fig. 2B) tarmkreftcellelinjer, GLI1, GLI2 og hTERT proteinnivåer ble redusert over en periode på 48 timer – 72 timer. Motsatt, stabil uttrykk for enten GLI1 eller GLI2ΔN, en N-terminal slettet mutant av GLI2, med konstituerende aktivator funksjon i HT29 celler for 10 passeringer demonstrert økt hTERT protein uttrykk (Fig. 2C).
A :
HT29, SW480 (colon carcinoma-celler), c4-2, DU145 og PC3 (prostatakreftceller) ble behandlet i 72 timer med enten DMSO (vehikkelkontroll) eller GANT61 (20 uM).
B:
U87 (GBM celler) ble behandlet med GANT61 (20 mm) for 0-72 timer. Steady state nivåer av GLI1, GLI2 og hTERT protein ble bestemt ved Western-analyse. HSP90α /β ble brukt som lasting kontroll
A:.
HT29,
B:
HCT116-celler ble transient transfektert med GLI3R (myc-merket) for 48 time eller 72 timer, henholdsvis. Steady state nivåer av GLI1, GLI2 og hTERT ble bestemt ved Western-analyse representert som densitometry av blotter i
En
med en representant hTERT blot (innfelt). Uttrykk for GLI3R ble bestemt ved hjelp av anti-myc antistoffet.
C:
PBP tom vektor (V) eller full lengde cDNA GLI1 i PBP (GLI1) eller GLI2ΔN i PBP (GLI2ΔN) ble stabilt uttrykt inn i HT29-celler, og cellene ble dyrket i 10 passasjer. Steady state nivåer av GLI1, GLI2 og hTERT ble målt ved Western blot. HSP90α /β ble anvendt som en kontroll lasting. * P. 0,0001
GLI transkripsjonsfaktorer samhandle med hTERT arrangøren i humane kreftceller
Deretter undersøkte vi den mekanismen som HH signaler regulerer uttrykket av hTERT i human kreft celler. Transkripsjonell regulering av hTERT uttrykk er en vanlig mekanisme av hTERT oppregulering i kreftceller [19]. Siden GLI proteiner er transkripsjonsfaktorer, hypotese vi at GLI1 og GLI2 transcriptionally regulere hTERT uttrykk i kreftceller. hTERT mRNA uttrykk ble forhøyet i både GLI1- og GLI2-overekspresjon HT29 celler (fig. 3A). Når HT29-celler ble utsatt for GANT61 (20 pM), ble hTERT mRNA-nivåer signifikant redusert i løpet av 24 timer og forble trykkes gjennom 72 timer (fig. 3B). DU145 cellene demonstrert redusert GLI2 og hTERT mRNA nivåer når de utsettes for GANT61 (20 mm), mens GLI1 avskrift uttrykk forble uendret på 48 timer etter behandling (fig. 3C). Ved eksponering for GANT61 (20 uM), U87-celler som viste reduksjon i GLI1, GLI2 og hTERT mRNA i løpet av 24 timer (fig. 3D). Disse resultatene bekreftet transkripsjonsregulering av hTERT uttrykk ved HH signalveien i humane kreftceller
A:.
HT29 celler som stabilt uttrykker tom vektor (V), GLI1 (GLI1) eller GLI2ΔN (GLI2ΔN) ble analysert for hTERT, GLI1 og GLI2 mRNA uttrykk bestemmes av real-Time PCR.
B:
Eksponering av HT29 celler til GANT61 (20 mikrometer; 0-72 timer) redusert uttrykk for hTERT mRNA, bestemmes av Real-Time PCR.
C:
DU145,
D:
U87 celler ble utsatt for GANT61 (20 mikrometer, 48 timer eller 24 timer henholdsvis) og GLI1, GLI2 og hTERT mRNA ble målt ved Real-time PCR. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 3 bestemmelser. * P. 0,05
For å dissekere mekanisme transcriptional regulering av hTERT uttrykk ved HH signalveien, overvåket vi effekten av HH signale på hTERT promoter aktivitet i HT29 celler. The full-lengde hTERT promoter-drevet luciferase (FL hTERT prom-Luc) reporter og PRL-TK var forbigående co-transfektert inn HT29-avledet stabile cellelinjer over-uttrykker GLI1 eller GLI2 eller hTERT. Begge GLI1 og GLI2ΔN uttrykker cellene viste en 4-dobling i hTERT promoter aktivitet innen 24 timer av transfeksjon (fig. 4A). Å identifisere minimal promoter lengden som kreves for HH-avhengige effekter på hTERT promoter aktivitet, FL hTERT promoter (-3337 /+ 438), og oppstrøms delesjonsmutanter (-1226 /+ 438 og -233 /+ 438) -driven luciferasepreparater reportere ble ko-transfektert inn i HT29-celler fulgt av eksponering til enten bærerkontrollen eller GANT61 (20 uM) i 24 timer. Data viser at den -1226 /+ 438 region er minimumskravet for HH-avhengige promotor hTERT aktivering selv om effekten er mindre enn den for FL hTERT-promoteren (fig. 4B). FL hTERT promoter-aktivitet ble signifikant redusert ved blokkering av GLI aktivitet med GANT61 (20 pM) (Fig. 4B). Deretter undersøkte vi om GLI transkripsjonsfaktorer direkte interaksjon med hTERT promoter i kreftceller.
I silico
analyse av hTERT arrangøren avslørt 7 mulige bindingssteder for GLI familien av transkripsjonsfaktorer. Begge GLI1 og GLI2 antistoffer utfelt fragmenter av hTERT arrangøren i chip analyser (fig. 4C). PCR forsterkning av kromatin fragmenter ved hjelp av primere spesifikke for hTERT promoter regioner resulterte i amplikonene som inneholdt ihvertfall kjernen (-226 /+ 360) hTERT promoter bekreftet ved å sekvensere PCR amplikonene. Binding av GLI1 og GLI2 til hTERT-promoteren ble redusert i nærvær av GANT61 (20 uM) i løpet av 24 timer (fig. 4D). BCL-2, tidligere rapportert som et mål for både GLI1 og GLI2, ble brukt som positiv kontroll (Fig 4C og 4D.)
A:.
Stabile derivater av HT29 celler (beskrevet i fig. 2C) ble ko-transfektert med en full-lengde hTERT promoter drevet luciferase (-3337 /+ 438) reporter og Renilla luciferase (PRL-TK) konstruerer i 24 timer. Lysater ble fremstilt, og luciferase-aktiviteten bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. hTERT promoter luciferase-aktiviteten ble normalisert mot Renilla luciferase-aktivitet, og er presentert som gjennomsnitt ± SD, n = 3
B:
HT29-celler ble ko-transfektert med enten den fulle lengde (-3337 /+ 438) eller oppstrøms slettede mutanter (-1226 /+ 438 eller -233 /+ 438) av hTERT prom-luc reportere og PRL-TK fulgt av eksponering for GANT61 (20 mikrometer, 24 timer) og bestemmelse av luciferase aktivitet. hTERT promoter luciferase aktiviteten ble normalisert mot Renilla luciferase aktivitet og presenteres som gjennomsnitt ± SD, n = 3.
C:
HT29 celler ble ansatt for ChIP analyse ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for GLI1, GLI2, eller histon H3 (positiv kontroll, som brukes for normalisering).
D:
HT29 celler behandlet med GANT61 (20 mikrometer, 24 timer) ble likeledes evaluert av Chip analyse. Påfølgende Real-Time PCR brukt primere som flankert promotorområdene av hTERT eller GLI målet genet, BCL-2 (positiv kontroll). * P. 0,05
HH /GLI Signa regulerer ikke hTERT Expression in Non-maligne 293T celler
Vi videre undersøkt om HH signaliserer transcriptionally regulerer hTERT i ikke-ondartede celler. 293T-celler transformert eksperimentelt, men mangler evnen til lett å danne tumorer i nakne mus [20], og viser en induserbar HH /GLI signaleringsakse [21]. Vi transient transfektert 293T celler med, enten GLI1 eller GLI2ΔN ekspresjonsplasmider, og målt hTERT uttrykk ved western analyse. Selv GLI1 og GLI2 proteinuttrykk ble signifikant forhøyet i de transfekterte 293T celler, forble hTERT protein uttrykk uendret på 48 timer og 72 timer (Fig. 5A). hTERT over-uttrykkende HT29-celler ble anvendt som en positiv kontroll for hTERT-proteinet analyse (Fig. 5A). Vi målte hTERT avskrift etter transient transfeksjon av GLI2ΔN inn 293T celler. Innen 48 timer av transfeksjon, 293T celler demonstrerte robust økning i GLI2 mRNA og 5 ganger økning i GLI1 mRNA nivåer, men ingen signifikant økning i hTERT mRNA nivå (figur 5B.). Videre gjorde transient ko-transfeksjon av FL hTERT prom-Luc reporter og enten GLI1 eller GLI2ΔN ekspresjonsplasmider ikke øke luciferase aktiviteten i 293T celler (Fig. 5C). Disse funnene understreker kontekstavhengige funksjoner av HH signalveien som selektivt oppregulerer hTERT uttrykk i ondartede celler i motsetning til ikke-maligne celler
A:.
293T celler var ubehandlet (UT), transient transfektert med tom vektor (V) eller GFP-merket GLI1 (GLI1) eller GFP-merket GLI2ΔN (GLI2ΔN). Uttrykk av GLI1, GLI2 og hTERT ble bestemt for 48 og 72 timer med Western analyse. HSP90α /β ble brukt som lasting kontroll og GFP ble brukt til å markere eksogent uttrykt GFP-merket GLI proteiner. Total cellelysat fra HT29 celler som stabilt uttrykker hTERT (HT29 + hTERT) tjente som positiv kontroll.
B:
293T-celler transient transfektert med vektor eller GLI2 (som beskrevet i figur 5A) ble analysert for GLI1, GLI2 og hTERT mRNA-ekspresjon via qPCR. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 3 bestemmelser.
C:
293T celler forbigående ko-transfektert med FL-hTERT prom-luc, Renilla luceferase journalister og vektor, GLI1 eller GLI2 (som beskrevet i figur 5A). 24 timer etter transfeksjon ble cellene analysert for luciferase-aktivitet. hTERT promoter-drevet luciferase aktiviteten ble normalisert mot Renilla luciferase aktivitet og er representert som gjennomsnitt ± SD, n = 3. * p. 0,05
HH /GLI Signa Regulerer hTERT enzymatisk aktivitet i humane kreftceller
Aberrant oppregulering av hTERT uttrykk er assosiert med økt telomerase revers transkriptase enzym aktivitet i kreftceller. Derfor, testet vi den funksjonelle betydning av den HH /GLI /hTERT-aksen ved måling av telomerase-enzymaktivitet i kreftceller. TRAP-analysen ble anvendt for å bestemme aktiviteten av hTERT ved å endre den HH /GLI signalkaskade. GANT61 (20 mm) administrasjon førte til redusert telomerase aktivitet med 48 timer, som ble opprettholdt i opptil 72 timer i HT29 celler (Fig. 6A, kvantifisert i Fig. S1). Omvendt, stabile derivater av HT29-celler som uttrykker GLI2ΔN vist økte telomerase-aktivitet i forhold til vektorkontrollen, mens GLI1 over-uttrykkende celler hadde en beskjeden økning i telomerase-aktivitet (Fig. 6B, kvantifisert i fig. S1). hTERT over-uttrykkende celler med forhøyet telomeraseaktivitet tjente som en positiv kontroll (Fig. 6B). Telomeraseaktivitet ble redusert i DU145 celler eksponert for GANT61 (0-30 uM) i 48 timer (fig. 6C). U87-celler viste også reduksjoner i telomeraseaktivitet i 48 timer for eksponering for GANT61 (20 pM), som ble opprettholdt inntil 72 timer (fig. 6D). Disse observasjonene viser at HH signale oppregulerer både hTERT uttrykk og telomerase aktivitet i humane kreftceller
A:.
HT29 celler ble behandlet med GANT61 (20 mm) for 0-72 timer, og lysatene ble trukket i intervaller for TRAP analyse. 100 bp DNA-stige ble anvendt som en molekylær markør (M).
B:
HT29-celler som stabilt uttrykker vektor (V), GLI1 eller GLI2 (GLI2ΔN) (beskrevet i figur 3A) ble evaluert for telomeraseaktivitet av TRAP-analyse. hTERT over-uttrykkende celler ble anvendt som positiv kontroll.
C:
U87 og
D:.
DU145 cellene ble behandlet med GANT61 (0-30 mikrometer; 0-72 timer) og telomerase aktivitet ble analysert av FELLE analysen
Diskusjoner
HH signale aktivitet er viktig for normal embryoutvikling hvor det regulerer celledifferensiering og orgel formasjonen i en gradient-avhengig måte [22]. HH signale regulerer cellulær proliferasjon ved transkripsjonelt modulerende gener som kontrollerer cellesyklusutvikling, for eksempel cyclin D, cyklin E og, også ved ptch-mediert lagring av cyclin B i cyctoplasm [23], [24], [25]. I det voksne stadiet, aktiv HH signale vedvarer i en liten undergruppe av celler der det gis regenererende potensial for de modne organer [26]. Dysregulering av HH signalering har blitt rapportert i flere humane kreftformer, inkludert basalcellekarsinom [27], [28], medulloblastom [1], [29], rhabdomyosarkom [30], gliom [1], pankreatisk adenokarsinom [31], [ ,,,0],32], [33], prostatakreft [34] og colon carcinoma [7], [8], [9], [10]. I kreftceller, autokrine ligand-avhengige og onkogen-drevet ligand-uavhengige mekanismer opprettholde en aktiv HH signalkaskade. Avvikende HH aktivitet driver tumordannelse og tumor vedlikehold ved å fremkalle pro-overlevelse signaler og blokkerer apoptotiske signaler i kreftceller [9], [35]. Et annet kjennetegn på kreft er ubegrenset spredning potensialet av kreftceller resulterer i udødelighet, men en link til dysregulerte HH signale var ikke kjent.
Telomerer er spesialiserte nucleoprotein strukturer ved kromosomendene som er viktige for kromosom stabilitet og udødelighet celler. Normale somatiske celler støter på en gradvis slitasje av telomere lengder med hver DNA replikasjonssyklus og dermed begrense mobil levetid. Normale stamceller og kreftceller unnslippe denne sjekken og fylle opp sine telomere lengder av økt telomerase aktivitet. Telomerase er en ribonucleoprotein består av menneskelig telomerase revers transkriptase enzym, hTERT og telomerase RNA, HTR [36], [37]. I kreftceller, er ekspresjon hTERT abnormt gjenopprettet som fører til økt telomeraseaktivitet som opprettholder telomerlengde og overfører ubegrenset replikasjon potensial. hTERT uttrykk og telomerase aktivitet har et nært samarbeid [33] med kreft hos mennesker [17], [38]. Transformasjon av telomerase-negative normale celler in vitro krever hTERT uttrykk [39], opptegning hTERT uttrykk som en hastighetsbegrensende trinn i telomerlengde homeostase og cellulær transformasjon. Reguleringen av hTERT uttrykk har blitt grundig studert og mange positive og negative regulatorer har blitt identifisert [40], [41].
I denne studien har vi vist for første gang at HH signalveien gir ubegrensede replikering potensialet av cancerceller ved å regulere hTERT ekspresjon og aktivitet. I flere humane kreftcellelinjer inkludert tykktarm, prostata og hjerne, undertrykkelse av GLI1 og GLI2 uttrykk ved hjelp GANT61, et lite molekyl hemmer resulterte i redusert uttrykk for hTERT mRNA, protein og enzymaktivitet. Dette funnet indikerte en regulatorisk akse mellom HH signalering og hTERT i humane kreftceller. Ved hjelp av en genetisk tilnærming til å undertrykke GLI1 og GLI2 hjelp GLI3R, kan hTERT uttrykk også bli hemmet i tykktarm kreft celler. Tvunget uttrykk for GLI1 eller en konstitutivt aktiv mutant av GLI2 uttrykk økt hTERT mRNA og protein i menneskelige tykktarmskreftceller som demonstrerer HH /GLI-mediert regulering av hTERT uttrykk.
