Abstract
Mål
Fettvev inneholder en populasjon av multipotente adipose stamceller (ASCs) som danner tumor stroma og kan fremme tumorprogresjon. Gitt den høye frekvensen av eggstokkreft metastaser til oment adipose, hypotese vi at oment-avledet ASC kan bidra til eggstokkreft vekst og spredning.
Materialer og metoder
Vi isolert ASCs fra omentum av tre pasienter med eggstokkreft, med (O-ASC4, O-ASC5) og uten (O-ASC1) oment metastasering. BM-MSC, SQ-ASCs, O-ASCs ble karakterisert med genuttrykk arrays og metabolske analyse. Stromale celler effekter på eggstokkreft kreftceller spredning, chemoresistance og stråling motstand ble evaluert med co-kultur analyser med luciferase-merket menneskelige eggstokkreft cellelinjer. Transwell migrering ble utført med kondisjonert medium fra O-ASCer og kontrollcellelinjer. SKOV3 celler ble intraperitionally injisert med eller uten O-ASC1 å spore
in vivo
engraftment.
Resultater
O-ASCs betydelig forfremmet
i
vitro
spredning, migrasjon cellegift og stråling respons av eggstokkreft cellelinjer. O-ASC4 hadde mer markert effekt på migrasjon og kjemoterapi respons på OVCA 429 og OVCA 433 celler enn O-ASC1. Analyse av mikroarray data viste at O-ASC4 og O-ASC5 har lignende genekspresjonsprofiler, i motsetning til O-ASC1, som var mer lik BM-MSC og subkutane ASCer i hierarkisk gruppering. Menneske O-ASCs ble påvist i stroma av menneskelige ovarialcancer murine xenografter men ikke uninvolved eggstokkene.
Konklusjoner
ASCs avledet fra det menneskelige omentum kan fremme eggstokkreft spredning, migrasjon, chemoresistance og stråling motstand
in vitro
. Videre isolerer klinisk O-ASCs demonstrere heterogene effekter på eggstokkreft
in vitro
Citation. Nowicka A, Marini FC, Solley TN, Elizondo PB, Zhang Y, Sharp HJ, et al. (2013) Menneskelig oment-Avledet adipose stamceller Øk Eggstokkreft spredning, migrasjon, og Chemoresistance. PLoS ONE 8 (12): e81859. doi: 10,1371 /journal.pone.0081859
Redaktør: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, USA
mottatt: 09.08.2013; Godkjent: 16 oktober 2013; Publisert: 02.12.2013
Copyright: © 2013 Nowicka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra The University of Texas MDAnderson Cancer Centre NCI spesialiserte programmer for fremragende forskning (SPORE) i Eggstokkreft utviklingspsykologi Award (DRP) (Grant No. CA83639) [https://www.mdanderson.org/Departments/ovarianspore /] og tilskudd R01CA133057 fra National Institutes of Health [www.nih.gov]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Vær oppmerksom på at en medforfatter, PBE, er for tiden ansatt ved Asuragen Inc. i Austin, Texas. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft, noe som resulterer i 16.000 dødsfall per år i USA [1]. Den dødelighet og sykelighet av eggstokkreft skyldes en høy grad av intraperitoneal formidling og utvikling av kjemoterapi-resistente svulster tross utgangspunktet chemoresponsive sykdom.
Intraperitoneal spredning av ovariecancer ofte resulterer i dannelsen av metastase i omentum, godt vaskularisert og innerverte fettvevet som ligger over tarm. Grunnen til at det omentum er det å foretrekke «jord» i metastatiske eggstokkreft celler forblir ukjent. Responsen av eggstokkreft metastaser i omentum til kjemoterapi er en uavhengig prediktor for død av kreft i eggstokkene, noe som tyder på at interaksjoner mellom eggstokkreft og oment mikromiljøet er en viktig drivkraft for klinisk utfall [2].
Vi antok at omentum er et gjestfritt miljø for dannelse av ovarial cancer metastaser på grunn av en populasjon av tumor tropiske mesenchymale stamceller ved omental adipose. Nylig, kjennetegnet vi en befolkning på flere potente adipose-avledet mesenchymale stamceller fra omentum (O-ASCs) av to pasienter med oment sykdom og en uten. Hvert isolat ble bekreftet å ha multi-potent differensiering potensial som forventet fra MSC. ASCs ligne benmargavledede mesenchymale stamceller (BM-MSC) som har kapasitet til å migrere inn i svulster og kan har vist seg å fremme startfasen, vekst, vaskularisering, metastaser, og motstand mot kjemoterapi i mange tumormodeller [3-6 ]. Vi undersøkte effekten av O-ASCs fra pasienter med og uten oment metastaser på eggstokkreft cellelinjer.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Den menneskelige eggstokkkreft cellelinjer OVCA 429, OVCA 433, og A2780 ble hentet fra Dr. Samuel C. Mok (The University of Texas MD Anderson Center, Houston, Texas). OVCA 429 og OVCA 433 cellelinjer ble etablert cellelinjer avledet fra pasienter med sent stadium serøs ovarian adenokarsinomer, som beskrevet av Bast et al [7]. De humane ovarie carcinom cellelinjer SKOV3 og A2780 og human BM-MSC ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle cellelinjer ble holdt i DMEM (Mediatech, Inc., Manassas, VA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT) og 1% penicillin og streptomycin (Mediatech, Manassas, VA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
Menneske O-ASCs og SQ-ASCs isolasjon
Under The MD Anderson Institutional Review Board godkjent protokollen, grovt normal-vises menneskelig omentum og underhud fettvev ble oppnådd i løpet av de staging prosedyrer for pasienter med eggstokkreft. Informert samtykke til vev bank ble innhentet fra hver pasient. All klinisk undersøkelse har blitt gjennomført gjennom prinsippene uttrykt i Declaration of Helinski. Skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient. O-ASCer og SQ-ASCer ble isolert i henhold til tidligere publiserte protokoller [8]. O-ASC1 ble isolert fra en pasient (body mass index (BMI) = 25,2 kg /m
2) med tilbakevendende endometriod adenokarsinom i endometrium og eggstokk uten oment metastaser. O-ASC4 og O-ASC5 ble isolert fra fra pasienter med høyverdig serøs eggstokkreft med oment engasjement. BMI for pasienter fra hvem O-ASC4 og fem ble avledet var 32,4 kg /m
2 og 22 kg /m
2, henholdsvis. O-ASC5 ble brukt for genekspresjon matrise og celleoverflaten markør uttrykk, men gikk tapt etter serieaging
in vitro Hotell og dermed kunne ikke brukes i funksjonelle analyser. Det isolerte O-ASCer og SQ-ASCer ble dyrket i α-MEM medium (Mediatech, Manassas, VA) med 20% FBS (HyClone, Logan, UT) og 1% penicillin streptomycin og L-glutamin (Mediatech, Manassas, VA ).
O-ASCs linje karakterisering
Etter isolering ble cellene utvidet
in vitro
i α-MEM medium (Mediatech, Manassas, VA). Celleoverflate markør ekspresjon ble karakterisert ved strømningscytometri-analyse. O-ASCs ble karakterisert ved tidlig passasje (maks 5) ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for de følgende markører: CD11b, CD29, CD34, CD44, CD45, CD 90, EpCAM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), og CD105 (BioLegend, San Diego, CA).
For å bekrefte adipogenic potensialet i O-ASCs og BM-MSC, vi inkuberes 10
5 celler i adipogenic induksjon media (DMEM medium med 10% FBS, 45 g /l glukose, L-glutamin, 1% penicillin og streptomycin, 10 ug /ml insulin, 500 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 1 uM deksametason, og 200 uM indometacin). Etter 72 timer, opprettholdelsesmedium (DMEM Mediatech, Manassas, VA) med 10% FBS, 45 g /l glukose, L-glutamin, 10 ug /ml insulin, 1% penicillin og streptomycin) ble tilsatt til cellene. Vedlikeholdsmediet ble skiftet 2 ganger per uke i løpet av 10 dagers inkubasjon. På de angitte tidspunkter, utførte vi olje rød O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) histokjemisk farging av cytoplasmiske slutninger av nøytrale lipider funksjonelle adipocytter.
osteoblastisk differensierings O-ASCer og BM-MSCer var utføres ved hjelp av fem x10
4 celler. Etter 3 uker inkubasjon i osteoblast induksjon medium (NH OsteoDiff medium, Bergisch Gladbach, Miltenyi Biotec GmbH, Tyskland), ble ekstracellulære kalkavleiringer farges ved hjelp av Alizarin Red S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Vi bekreftet celler chondrogenic potensiell anvendelse av 10
6-celler, som ble inkubert i 2 ml chondrogenic medium (DMEM-medium med 45 g /l glukose, L-glutamin, 1% penicillin og streptomycin, 50 ug /ml askorbinsyre, 100 nM deksametason, og 10 ng /ml transformerende vekstfaktor β). Mediet ble endret tre ganger i uken. Etter 21 dager, ble cellene høstet, innstøpt i parafin og farget med 1% Alcian blå (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 5% eddiksyre. Den blå fargen i bildet representerer sulfat proteoglykan innskudd som er anbefalt av funksjonelle chondrocytes.
NimbleGen menneskelige uttrykk analysen HG18
mRNA uttak for O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, subkutan ASCs (SQ-ASCs) og BM-MSC ble utført ved hjelp av Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens protokoll. NimbleGen (Madison, WI) HG18 72 k mikromatriser inneholder 72.000 lange oligonukleotider (60-mer) som flis det menneskelige genom ble brukt for genekspresjon rekke profilering. Genekspresjon profilering ble utført minst to ganger for hver cellelinjer. Microarray bildene ble behandlet i NimbleScan v2.3 (NimbleGen, Madison, WI). Normalisering ble utført ved hjelp av robust multi-rekke analyse algoritme med standardinnstillinger.
Expression analyse programvare
For å utføre cluster analyse av prøven og uttrykk profilering analyse av gener, det BRB Array Tools versjon 4.2. 1 (Richard Simon og Amy Peng Lam, National Cancer Institute, Bethesda, MD) ble brukt. Prøvene ble samlet ved hjelp av unsupervised hierarkisk clustering med standardinnstillinger. Klasse sammenligninger ved hjelp av en univariat
t
-test med en tilfeldig variasjon modell på RMA (Robust Multi-matrise Gjennomsnittlig) normalisert data ble brukt for å identifisere gener som var signifikant forskjellig uttrykt. En signifikansnivå på p = 0,001 ble utpekt til hver univariate test.
Metabolske assays
Celler ble sådd ut i 50.000 celler pr brønn i 12-brønners plater i 48 timer. Supernatanter ble samlet opp for ekstracellulære stoffskifte analyse og cellepelletene ble lysert med RIPA-buffer for proteinanalyse. Glukose forbruket ble vurdert ved Wako Glukose kit og analysene ble utført i henhold til produsentens protokoll. Cellesupernatanter ble tilsatt til en 96-brønns plate som er fylt med rekonstituert Wako Glukose-reagens (Wako Chemicals, Richmond, VA). Deretter ble platen inkubert ved 37 ° C og ble rystet samtidig. Absorbansen ble detektert ved 505nm og 600nm ved spektrofotometer (SpectraMax
® M5; Molecular Devices) for å måle glukoseinnholdet av prøvene. Resultatene ble uttrykt i pmol /mg protein [9].
laktat innholdet i prøvene ble målt ved Trinity Laktat Kit i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble celler supernatant fortynnet 1:10 i PBS og deretter fortynnede prøver ble tilsatt til 96-brønns plate med rekonstituert Trinity laktat reagens. Den klare for 96-brønns plate ble beskyttet fra lys og inkubert ved 37 ° C i en time. Absorbansen ble påvist ved 540 nm med spektrofotometer (SpectraMax
® M5; Molecular Devices) for å måle laktatinnhold av prøvene. Pyruvatbestemmelse involvert kolo nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) kvantifisering. Laktatdehydrogenase (LDH) katalyserer omdannelsen av pyruvat til laktat med bekostning av NADH. I korthet ble NADH oppløsning fremstilt ved oppløsning av NADH (Sigma Aldrich) i Tris-løsning (pH = 7,0). Laktatdehydrogenase (LDH) ble rekonstituert i 50% glycerol og fortynnet i Tris-løsning (pH = 7,0). NADH-oppløsning ble tilsatt til 96-brønns plate før tilsetning av celle supernatant. Den fremstilte platen ble inkubert ved 37 ° C i fem minutter og ble rystet. Absorbansen ble avlest ved 340 nm ved spektrofotometer (SpectraMax
® M5, Molecular Devices) for å skanne de basale nivåer av NADH. Deretter LDH ble tilsatt, og platen ble beskyttet mot lys og ble inkubert ved 37 ° C i en time. De endelige nivåer av NADH ble målt ved den samme bølgelengde. Tap av NADH absorbans tilsvarer pyruvat innholdet i prøvene. Intracellulære ATP-innhold ble målt for de forskjellige celletyper ved hjelp av Cell Titer Glo-Luminescent cellenes levedyktighet assay (Promega). Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater (hvite) ved 8000 celler per brønn i 24 timer. Tjuefire timer senere ble cellene inkubert i 2 timer i nærvær av enten oligomycin (2,5 ug /ml) eller 2-deoksyglukose (100 mM). ATP-innholdet ble oppdaget i henhold til produsentens instruksjoner, med et spektrofotometer (SpectraMax
® M5, Molecular Devices).
spredningsanalyse
OVCA 429, OVCA 433 celler, A2780, og SKOV3-celler ble stabilt transfektert med ildflue luciferase-genet ved hjelp av en lentiviral fremgangsmåte og sådd ut ved 5000 celler /brønn i et BD Falcon 96-brønns plate, alene eller i 1: 1 ko-kultur med O-ASC1 eller O-ASC4. Ko-kulturer ble utført i DMEM (Mediatech, Manassas, VA) med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin. Etter 24 timer, ble 0,15 mg /ml D-luciferin tilsatt og inkubert i 1 time. Luminescens ble målt med en luminometer (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Tyskland). Mediene ble erstattet, og målinger ble gjentatt i opptil 11 dager med kultur.
Migrasjon analysen
Cell migrasjon ble analysert ved hjelp av betinget media (CM) generert fra O-ASC1 og O-ASC4 . O-ASCer ble dyrket på en 6-brønners plate til konfluens i α-MEM medium (Mediatech, Manassas, VA) med 20% FBS (HyClone) og 1% penicillin, streptomycin og L-glutamin (Mediatech, Manassas, VA). Etter vasking med PBS, serumfritt DMEM med 1% penicillin og streptomycin (Mediatech, Manassas, VA) ble tilsatt til hver brønn. Etter 36 timer ble O-ASC CM oppsamlet. Ovarie cancer cellelinjer av interesse ble sådd ut (i serumfritt medium) i den øvre del av en 24-brønns plate med transwell 8 um porer (Corning, Inc., Corning, NY) med 500 ul O-ASC CM tilsatt til bunnen av hver brønn. Alle prøver ble analysert i duplikat eller triplikat. Etter 24 timer ble de migrerte celler farget ved hjelp av Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Optisk tetthet ble lest direkte fra 96-brønns plate ved 590 nm fra en enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) plateleser (BioTek Instruments, Winooski, VT).
Radiosensitivity analysen
Luciferase -merkede A2780 celler ble sådd ut (ved en densitet på 10.000 celler /brønn) i et BD Falcon 96-brønns plate, alene eller i 1: 1 eller 1:19 ko-kultur med O-ASC1 eller O-ASC4. Ko-kulturer ble utført i DMEM (Mediatech, Manassas, VA) med 10% FBS, 250 ug /ml G418, 1% penicillin og streptomycin. Etter 24 timer ble cellene bestrålt ved 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, og 8 Gy via cesium 137 ekstern strålebehandling. Luciferase-ekspresjon ble målt i 0,15 mg /ml D-luciferin. Etter 1 times inkubering ved 37 ° C, ble luminescens målt med et spektrofotometer (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Tyskland). Media ble da erstattet med nye medier som inneholder G418, og målinger ble gjentatt annenhver dag inntil cellene nådde samløpet.
Paclitaxel og karboplatin analyser
Luciferase-merket OVCA 429, OVCA 433, A2780, og SKOV3-celler ble sådd ut (ved en densitet på 10.000 celler /brønn) i et BD Falcon 96-brønns plate, alene eller i 1: 1 ko-kultur med O-ASC1 og O-ASC4. Ko-kulturer ble utført i DMEM (Meditech, Manassas, VA). Etter 24 timer, OVCA 429 til 0,5 um paklitaxel 200 uM karboplatin, OVCA 433-1 uM paclitaxel og 100 uM karboplatin, A2780 til 20 uM paclitaxel 200 uM carboplatin og SKOV3 til 50 uM paclitaxel og 100 uM karboplatin ble utsatt. Luciferase-ekspresjon ble målt i 0,15 mg /ml D-luciferin. Etter 1 times inkubering ved 37 ° C, ble luminescens målt med et luminometer (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Tyskland). Mediene ble deretter erstattet med nye medier som inneholder det angitte konsentrasjon av paclitaxel og carboplatin og måling ble gjentatt over 9 dager.
O-ASCs
in vivo
engraftment
Å avgjøre om O-ASCer innpode i ovariekreft stroma, ble 5 nakne mus injisert intraperitonealt (IP) med 5 x 10
6 luciferase som uttrykker SKOV-3-tumorceller med eller uten det samme antall RFP-merkede O-ASC1. Kontrollgruppen bestod av mus injisert med bare O-ASC1. Tumorvekst ble overvåket med
in vivo
bioluminescent imaging. Mus ble avlivet etter 53 dager. Alle mus ble avlivet etter protokoll godkjent av MD Anderson Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Tumor og eggstokkene ble fikset og parafin innebygd for histologisk analyse. Immunofluorescens ble utført på ovariene for å detektere RFP uttrykker O-ASC i alle mus. Alle dyr arbeidet er utført i henhold til godkjent musen protokollen ved MD Anderson Cancer Center. Mouse protokollen ble godkjent av MD Anderson Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Hematoxylin og eosin (H 0.05 .. Alle grafene viser gjennomsnitt ± SEM.
Resultater
Karakterisering av O-ASCs
O-ASCs ble isolert fra tre pasienter med eggstokkreft. O-ASC1 ble oppnådd fra oment fettvev fra en pasient med adenokarsinom endometrial og eggstokkreft uten oment metastasering. O-ASC4 og O-ASC5 ble isolert fra grovt normal vises omentum oppnådd fra en pasient med serøs ovarialcancer med omental metastasering. Differensiering analyser viste at O-ASCs, som BM-MSC, differensieres til adipogenic, chondrogenic, og osteogene mesenchymale linjene (Figur S1). Celleoverflatemarkører ble preget med flowcytometri (figur S2). O-ASC1 og O-ASC4, ligner på BM-MSC, uttrykt CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105. De uttrykte ikke CD11b, CD34, CD45, eller EpCAM. Markøren overflate CD34 (transmembran glykoprotein uttrykt i begynnelsen av hematopoetiske og vaskulært vev) ble uttrykt ved 10% av O-ASC1s sammenlignet med 0,2% av BM-MSC og 1,42% av O-ASC4. Endoglin (CD105) og CD44 ble nesten universelt uttrykt i BM-MSC (99,34% og 100% av cellene, henholdsvis), men ble uttrykt ved lave nivåer på O-ASC1 (87,24% og 46,1% av cellene, henholdsvis), eller O- ASC4 (7,98% og 30% av cellene, henholdsvis). Andre markører ble uttrykt på samme nivå i alle cellelinjer.
Gene uttrykk
Gene uttrykk for O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5 for sammenligning med SQ-ASC og BM-MSC ble kartlagt med NimbleGen arrays. En hierarkisk clustering algoritme ble anvendt for å gruppere prøver på grunnlag av likhet i ekspresjon av alle 24.000 gener. Dendrogrammer basert på unsupervised clustering skilt prøver i to hovedgrener; 1) O-ASC4 og O-ASC5, som ble isolert fra pasienter med metastaser inn i omentum, og 2) SQ-ASCer og O-ASC1) og BM-MSC (figur 1A).
Unsupervised clustering ble utført for å generere et dendrogram ved hjelp av senter korrelasjon og gjennomsnittlig binding (A) (O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, BM-MSC: n = 2; SC-ASC: n = 4). IPA-analyse viste trasé med vesentlig forskjellig uttrykk mellom O-ASC1 og O-ASC4 (B). Funksjonene er oppført fra de fleste signifikante (høyere linjer) slik at minst signifikante (nedre stenger), og den vinkelrette gule linje angir terskelen for signifikans (p = 0,05).
Ved hjelp av en pakke av statistiske verktøy, identifiserte vi 415 signifikant forskjellig uttrykt gener mellom O-ASC1 og O-ASC4. Femti-seks prosent av over-uttrykte gener (minst 10 x-gangers skifte) i O-ASC4 i forhold til O-ASC1 kodet for produkter som endelig lokalisering er i plasmamembranen eller det ekstracellulære rom. Oppfinnsomhet Pathways Analysis (IPA) analyse viste at de fleste av disse genene er involvert i cellulær bevegelse, vekst og proliferasjon og kreft eller lite molekyl metabolisme (figur 1B). Tabell 1 viser de 25 beste genene (endring cut-off av 4 og p-verdi 0,001) som uttrykk signifikant forskjellig mellom OSC4 og OSC1.
Symbol
Tiltredelse antall
Entrez genet navn
beliggenhet
Skriv
Fold endring
Parametrisk p-verdi
ACANNM_001135, NM_013227AggrecanExtracellular spaceOther116.511.20E-06VNN1NM_004666Vanin 1Plasma membraneEnzyme0. 0327.20E-06GPR116NM_015234G protein-koblet reseptor 116Plasma membraneG-protein kombinert receptor23.811.02E-05GRIK2NM_021956, NM_175768Glutamate reseptor, ionotrope, kainat 2Plasma membraneIon channel21.191.02E-05NRCAMNM_001037132Neuronal celle adhesjon moleculePlasma membraneOther0.0331.13E-05C1QL3NM_001010908Complement komponent 1, q delkomponent lignende 3Extracellular spaceOther0.0421.24E-05ITGA8NM_003638Integrin, alpha 8Plasma membraneOther51.011.35E-05CADM3NM_021189Cell adhesjonsmolekyl 3Plasma membraneOther0.0491.51E-05NEBLNM_006393NebulettePlasma membraneOther0.0582.17E-05GJA5NM_005266Gap krysset protein, alpha 5, 40 kDaPlasma membraneTransporter24.452.27E-05NPTX1NM_002522Neuronal pentraxin IExtracellular spaceOther35.62.51 E-05AIF1LNM_001002260Allograft inflammatorisk faktor 1-likePlasma membraneOther12.842.73E-05F11RNM_016946F11 receptorPlasma membraneOther0.0983.18E-05PF4NM_002619Platelet faktor 4Extracellular spaceCytokine0.0973.39E-05OXTRNM_000916Oxytocin receptorPlasma membraneG-protein kombinert receptor14.553.63E-05PCDH10NM_032961Protocadherin 10Plasma membraneOther57.293.83E-05SGCANM_000023Sarcoglycan, alfa ( 50 kDa dystrophin-assosiert glykoprotein) Plasma membraneOther10.434.00E-05SORBS1NM_001034954Sorbin og SH3 domene som inneholder 1Plasma membraneOther30.084.00E-05CXCL5NM_002994Chemokine (CXC motiv) ligand 5Extracellular spaceCytokine0.124.15E-05ESM1NM_007036Endothelial celle-spesifikt molekyl 1Extracellular spaceGrowth factor20.674.34E-05CCBP2NM_001296Chemokine bindende protein 2Plasma membraneG-protein kombinert receptor0.134.39E-05IL13RA2NM_000640interleukin 13 reseptor alfa 2Plasma membraneTransmembrane receptor0.0684.60E-05MMP7NM_002423Matrix metallopeptidase 7 (matrilysinaktivitet, livmor) ekstracellulær spacePeptidase0.14.68E-05WFDC1NM_021197WAP fire-disulfid kjernedomenet 1Extracellular spaceOther19.454.75E-05Table 1. Liste over 25 gener som uttrykk var statistisk signifikant forskjellig mellom O-ASC4 vs. O-ASC1.
å beregne statistisk signifikans, brukte vi Students
t
-test. CSV Last ned CSV
Stoffskifte analyser
Stroma har vist seg å fremme ondartet progresjon ved å endre kreft celle metabolisme. I henhold til den «reverse warburg effekt», stromaceller oppregulere glykolyse, øke laktatproduksjon som utskilles og forbrukes av tilstøtende kreftceller som drivstoff for oksydativ fosforylering (OXPHOS) [10]. Vi antok at de pro-proliferative og trekkende effekter av OSC kan forklares ved metabolske forskjeller i stromal isolerer. SQ-ASC hadde den høyeste grad av glukoseopptak og laktat sekresjon i forhold til BM-MSC og O-ASCer (figur 2A og 2B). Blant O-ASCs isolerer, O-ASC4 hadde signifikant høyere rate av glykolyse og laktat sekresjon enn O-ASC1 (figur 2A og 2B). O-ASC4 hadde høyere rate av pyruvat opptak enn O-ASC1 som trolig omdannes til laktat gitt at har en høyere rate av glycolytic aktivitet i O-ASC4 (figur 2C). Steady state ATP produksjonen var høyere i O-ASC4 enn O-ASC1 (figur 2E-F). ATP-produksjon tilskrives glykolyse ble bestemt ved å hemme F1F0-ATPsynthase med oligomycin mens ATP fra oksidativ fosforylering (OXPHOS) ble målt ved å hemme glykolyse vei med to-deoxyglucose (2DG). Disse resultatene viste at O-ASC4 produsert ATP fortrinnsvis fra glykolysen mens O-ASC1 produsert fra ATP OXPHOS (figur 2 E og F).
Metabolsk analyse ble utført på BM-MSC, SC-ASC og O-ASC1 og 4, inkludert glukoseopptak (A), laktat sekresjon (B), pyruvat opptak (C), endogen produksjon ATP (D), ATP avledet fra glykolyse (E) og ATP-avledet fra oksidativ fosforylering (OXPHOS) (F). Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p 0,001 for uparet 2-tailed t-test (n = 8).
O-ASCs effekter på eggstokkreft celleproliferasjon
Gitt skillet mellom O-ASC1 og O-ASC4 med hensyn til genekspresjonsanalyser og metabolske analyser, vi en hypotese om at disse isolatene kan ha forskjellige virkninger på eggstokkreft biologi. For å teste dette, ble effekten av O-ASC1 og O-ASC4 på eggstokkreft celleproliferasjon, migrasjon og chemsensitivity forhold. Først, for å avgjøre om O-ASCer påvirker ovarial cancer cellemetabolisme, umerkede O-ASCer og luciferase-uttrykkende ovarie cancer-cellelinjer (OVCA 429, OVCA 433, A2780, og SKOV3) ble ko-dyrket ved 1: 1-forholdet til cellen ble sammenflytende 11 dager etter plating. OVCA 429 og OVCA 433 celler spredning ble betydelig økt ved 7 (p 0,001 og p 0,5 henholdsvis), 9 (p 0,0001 for begge cellelinjer) og 11 dager (p 0,0001 og p 0,001 henholdsvis) ved samtidig kultivert med O-ASC1 sammenlignet med kontroll. Vesentlige pro-proliferative effekter av O-ASC4 ble sett i OVCA 429 celler etter 9 dager (p 0,01) og OVCA 433 celler ved 11 dagers co-kultur (p 0,001). O-ASC4 økt spredning av SKOV3 celler ved 7 (p 0,001), 9 (p 0,01) og 11 dagers (p 0,01). Interessant, O-ASC1 og O-ASC4 trykkes proliferasjonen av humane A2780 eggstokk-carcinoma-celler (p 0,01 på dag 7, 9, og 11) (figur 3). For å evaluere effekten av en lavere ratio på ASC celler, utførte vi sprednings analyser med en 01:19 O-ASCs: kreft celler ratio (Figur S3). Det var ingen signifikant forskjell i proliferasjonsrate for OVCA 429, OVCA 433, A2780 og SKOV3 cellelinjer ved samtidig dyrket med O-ASCs på dette forholdet.
Luciferase uttrykker ovarie cancer-cellelinjer ble dyrket alene eller i et 1: 1 forhold med umerkede O-ASCer. Signifikant forskjell mellom kontrollene (kreftceller dyrket alene) og kreftceller co-dyrket med O-ASCs vises: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ****, P 0.0001 (n = 5). ANOVA med en Bonfferoni multiple sammenligninger test.
O-ASCs effekter på eggstokkreft cellemigrasjon
For å undersøke effekten av O-ASCs på eggstokkreft celle migrasjon, endret Boyden kammer analyser ble utført med kondisjonert medium (CM) fra O-ASCs. Antallet migrerte kreftceller (OVCA 429, OVCA 433, A2780, og SKOV3) betydelig øket etter inkubasjon med CM fra begge O-ASC1 og 4. O-ASC4 CM betydelig øket vandring av OVCA 429, 433 og A2780 celler sammenlignet O-ASC1. (Figur 4, Figur S4).
eggstokkreft celler migrert gjennom et 8 um pore i nærvær av kontroll av O-ASC kondisjonert medium. Absorbansen ved 590 nm reflekterer antall celler som passerte gjennom transwell membranen. Vesentlige forskjeller er vist som følger: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 for uparet 2-tailed t-test (n = 3).
O-ASCs effekt på kreft i eggstokkene celle respons på kjemoterapi og strålebehandling
For å avgjøre om tilstedeværelse O-ASCs slag eggstokkreft celler respons på kjemoterapi, behandlet vi cellene alene og co-kultivert med O-ASCs med paclitaxel eller carboplatin. OVCA 429 celler hadde betydelig større overlevelse etter behandling med karboplatin eller taxol ved samtidig dyrket med O-ASC4. OVCA 433 og Skov-3 overlevelse etter behandling av carboplatin og taxol økt med co-kultur av både O-ASC1 og O-ASC4. A2780 overlevelse ble ikke påvirket av O-ASC co-kultur (figur 5A). For å bestemme O-ASCer effekt på strålesensitivitet, A2780-celler ble ko-dyrket 1: 1 i 7 dager med O-ASC1 eller O-ASC4. Etter inkubering ble cellene bestrålt ved 2, 4, 6 og 8 Gy. Vi har observert en betydelig økning i overlevelse etter 4, 6 og 8 Gy i A2780-celler ko-dyrket med O-ASC1 (p 0,05, s 0,0001 og p 0,01, henholdsvis) og O-ASC4 (p 0,01, s 0,01, respektivt) sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5B). Den radiobeskyttende rolle av adipose stamceller ble ikke klart vist i et tilsvarende forsøk utført med 01:19 forhold av O-ASCs celler til. kreftceller (figur S5).
eggstokk-kreft-celler ble dyrket med eller uten et tilsvarende antall O-ASC og behandlet med dosene av paclitaxel og karboplatin (n = 5) (A) eller stråling (n = 4) 0-8 Gray (B) som vist. Vesentlige forskjeller er vist som følger: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ****, P 0,0001 for uparet 2-tailed t-test.
O-ASC engraftment
Neste, vi forsøkte å finne ut om O-ASCs innpode i eggstokkreft stroma og normalt vev, inkludert eggstokk. Nakne mus ble injisert intraperitonealt med luciferase som uttrykker SKOV-3-tumorceller med eller uten et tilsvarende antall RFP-merkede O-ASC1. Tumorvekst ble overvåket med
in vivo
bioluminescent imaging. Etter 7 dager luciferaseaktiviteten var signifikant høyere i mus behandlet med O-ASCer men senere ble redusert (figur S6). O-ASCs ble reinjisert på dag 25. immunfluorescens ble utført 7 dager senere for å oppdage RFP uttrykke O-ASCs innenfor eggstokkreft og uninvolved eggstokk. RFP uttrykker O-ASCs ble oppdaget i stroma av ovarian xenografter men ikke innenfor uninvolved eggstokkene (figur 6a, 6b), viser tumor-spesifikke engraftment, som har blitt rapportert med MSC fra andre kilder.
(A) Immunoflouresence ble utført for å påvise O-ASC i eggstokkene SKOV3 xenografter og grovt normal eggstokk. O-ASC oppdages så røde celler i stroma av ovarietumorer i mus injisert med RFP uttrykker O-ASC. (B) H . E vev farging (20x forstørrelse)
Diskusjoner
I tillegg til adipocytter inneholder omentum blod- og lymfekar, samt et rikt inflammatorisk infiltrat som gjør det forskjellig fra subkutant fettvev.
