Abstract
Bakgrunn og Mål
Kronisk pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen er preget av omfattende stel cellemediert fibrose, og dagens terapeutisk utbyggingen omfatter målretting bukspyttkjertelkreft stroma og tumor-vert interaksjoner. Nyere bevis tyder på at sirkulerende benmarg stamceller (BMDC) bidrar til solide organer. Vi forsøkte å definere rollen av sirkulerende hematopoietiske celler i normal og sykelig bukspyttkjertelen.
Metoder
Hele benmarg ble høstet fra β-actin-EGFP donor mus mannlige og transplantert inn bestrålt kvinnelige mottaker C57 /BL6 mus. Kronisk pankreatitt ble indusert med gjentatte injeksjoner av caerulein, mens karsinogenese ble indusert med en intrapancreatic injeksjon av dimetylbenzantracen (DMBA). Fenotype av innpodet donor-deriverte celler i bukspyttkjertelen ble vurdert ved immunhistokjemi, immunfluorescens og
in situ
hybridisering.
Resultater
GFP positive celler var synlige i eksokrin pankreas epitel fra 3 måneder etter transplantasjonen. Disse utstilt acinar morfologi og var positive for amylase og jordnøttagglutinin. Mus administreres caerulein utviklet kronisk pankreatitt mens DMBA mus utstilt forstadier og kreft i bukspyttkjertelen. Det er ingen akinærceller ble identifisert til å være donor-avledede ved opphør av cerulein behandling, men i sjeldne tilfeller benmarg-avledede akinærceller ble observert i løpet av bukspyttkjertel regenerering. Økt rekruttering av BMDC ble observert i desmoplastic stroma, bidrar til den aktiverte bukspyttkjertelen stel celle (pasc) befolkningen i begge sykdommene. Uttrykk for stelcellemarkører CELSR3 ble observert PBX1 og GFAP i BMD kreft-assosiert PaSCs, men kreft-assosiert, men ikke pankreatitt-assosiert BMD PaSCs, uttrykte kreft pasc spesifikk markør CELSR3.
Konklusjoner
Denne studien viser at BMDC kan innlemme i bukspyttkjertelen og vedta den differensierte tilstand av eksokrin rommet. BMDC som bidrar til den aktiverte pasc med kronisk pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen har forskjellige fenotyper, og kan spille en viktig rolle i disse sykdommene. Videre kan benmargstransplantasjon gi en nyttig modell for studiet av tumor-vert interaksjoner i kreft og pankreatitt
Citation. Scarlett CJ, Colvin EK, Pinese M, Chang DK, Morey AL, Musgrove EA, et al. (2011) Rekruttering og Aktivering av bukspyttkjertelen stel celler fra benmargen i bukspyttkjertelkreft: En modell av Tumor-Host Interaksjon. PLoS ONE 6 (10): e26088. doi: 10,1371 /journal.pone.0026088
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 19 august 2010; Godkjent: 19 september 2011; Publisert: 14 oktober 2011
Copyright: © 2011 Scarlett et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den Cancer Institute of New South Wales (CINSW), National Health and Medical Research Council (NHMRC) fra Australia, The Cancer Council of New South Wales, St. Vincent Clinic Foundation, Royal Australian College of Surgeons, den australske Cancer Research Foundation, og RT Hall Trust. AVB, CJS, DKC, EAM og EKC støttes av stipend fra CINSW. RLS er en Senior Principal Fellow av NHMRC og holder Petre leder Breast Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er fortsatt en av de mest ødeleggende kreft, og er den fjerde største årsaken til kreftdød i vestlige samfunn med en overlevelse på mindre enn 5% [1]. Ingenting bortsett fra bukspyttkjertelen reseksjon i en andel av pasientene (10-20%), og har en hvilken som helst kureringspotensiale, med kjemoterapeutiske midler som matcher begrenset suksess [2]. Kronisk pankreatitt er en betydelig risikofaktor for utvikling av kreft i bukspyttkjertelen, og begge er kjennetegnet ved omfattende stel celle mediert fibrose, som i tilfelle av kreft i bukspyttkjertelen letter progresjon av kreft og metastase [3], [4]. Nylig, Olive
et al product: [5] viste at ved å målrette den stroma hjelp hemmere av pinnsvin signalering, forbedrer levering av kjemoterapeutika til epithelial rommet av svulsten, og selv om effekten var forbigående, forbedret samlet effekt. Videre kraman
et al
vist at målretting spesifikke undergrupper av stromale celler for ødeleggelse kan fjerne sin hemmende effekt på vertens immunrespons mot svulsten [6].
Observasjoner gjort i nyere årene har vist at voksne stamceller har bemerkelsesverdig fleksibilitet i sine differensiering repertoar. Dette plastisitet gjør at voksne stamceller, spesielt de av benmarg opprinnelse, for å innpode alternativ ikke-hematopoietiske steder og transdifferentiate inn celletyper som passer til deres nye nisje. Dette er spesielt tydelig når mottakeren organ er skadet [7], [8]. Benmarg avledet celler (BMDC) kan enten innpode eller sikring for å adoptere, eller omprogrammeres, til differensiert tilstand av den spesielle epitel [9] (anmeldt i [10]). Dette tyder på at den endogene stamcelle av et organ, og dens rolle i vekst og regenerering, ikke er begrenset til hvert enkelt organ, men kan være et dynamisk system med sirkulerende BMDC med stamcelle nisje miljøer som regulerer rekruttering, proliferasjon og differensiering [7], [11]. Dette kan ha viktige implikasjoner vedrørende utviklingen av kreft i mange faste organer, inkludert bukspyttkjertelen. Houghton
et al
viste at i en modell av
Helicobacter felis
gastrisk kreftutvikling, utvikling av metaplasi og dysplasi var knyttet til engraftment og utvidelse av BMDC befolkningen, til slutt gir opphav til mage adenokarsinom [12]. Observasjoner hos kvinner som fikk benmargstransplantasjon fra mannlige blodgivere, og som senere utviklet kreft, identifisert som myofibroblasts (bukspyttkjertelen stel celle tilsvarende) innenfor disse svulstene ble avledet fra donor benmarg [13].
De fleste av tidligere studier som vurderer rollen BMDC i bukspyttkjertelen regenerering og reparasjon har konsentrert seg om å gjenopprette endokrine funksjon følgende holme celle skade [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Få studier har fokusert på bidrag BMDC til vekst og regenerering av eksokrin pankreas, eller deres rolle i kreft i bukspyttkjertelen. Wang
et al product: [22] beskriver bidrag BMDC å pankreasgang formasjonen i neonatale mus, Marrache
et al product: [23], og Watanabe
et al product: [24 ] viser i en modell av caerulein indusert kronisk pankreatitt som BMDC bidrar til bukspyttkjertelen stelcellepopulasjon som antyder en rolle i vevsreparasjon, mens mer nylig Pan
et al product: [25] identifisert et bidrag av BMDC til bukspyttkjertelen stel cellepopulasjon i en rottemodell for kjemisk karsinogenese.
Her vi generere en robust modell av hele benmargstransplantasjon for å vise at i bukspyttkjertelen karsinogenese, og i kronisk pankreatitt, BMDC bidrar betydelig til den aktiverte bukspyttkjertelen stel celle (pasc ) befolkning. De som er assosiert med kreft i bukspyttkjertelen uttrykte gener som er karakteristiske for peritumoral stel celler sammenlignet med dem som ikke er forbundet med malignans, noe som tyder på at BMDC kan spille en viktig rolle i å støtte bukspyttkjertelen karsinogenese. I tillegg kan disse modellene av benmargstransplantasjon vise seg nyttig i å undersøke tumor-vert interaksjoner
in vivo
.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeidet ble godkjent av Garvan Institute of Medical Research /St Vincent Hospital dyreetikk komité (protokoll # 06/53).
benmargstransplantasjon
Hele benmarg ble høstet fra mannlige C57 /BL6 -TgN (ACTbEGFP) IOsb /J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA, heretter kalt β-actin-EGFP mus) ved å spyle den skinnebein og lårben med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen, Eugene, OR, USA) ved anvendelse av en 26G nål. Celler ble filtrert gjennom en 70 um cellefilter, telles deretter vasket og resuspendert i PBS. 5 × 10
6 β-actin-EGFP benmargceller ble transplantert inn i bestrålte (950 Rads; Gammacell 40 Exactor; Nordion International Inc. Canada) mottakeren 4-8 uker gamle kvinnelige C57 /B6 mus via halevenen. Mus ble gitt antibiotikum vann (40 mg /5 ml trimetoprim + 200 mg /5 ml sulfametoksazol) i 14 dager. Mens bruken av forbedrede grønt fluorescerende protein (GFP) har blitt markør trekkes av mange typer av celletransplantasjon og ætt merking eksperimenter, er det ikke klart at den GFP uttrykt i benmarg stamceller ville fortsette å bli uttrykt i ikke-hematopoietisk vev følgende atom reprogrammerings [26], [27], [28]. Derfor utførte vi kjønns umake transplantasjoner å spore skjebnen til donor-deriverte celler ved hjelp av Y-kromosomet genotypiske markør for å validere funnene observert ved hjelp av GFP reporter.
Normal Pancreas
Mus ble ofret på 3 (n = 12), 6 (n = 12), 9 (n = 12) og 12 (n = 11) måneder etter transplantasjonen (figur 1). Ved hvert tidspunkt, ble pankreas høstet, halvert og anbragt i enten 10% nøytral buffret formalin og deretter innstøpt i parafin, eller innleiret i kaldt Tissue-Tek oktober forbindelse (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) og hurtigfrosset i flytende N
2. Cellular fenotype av donor avledet celler i bukspyttkjertelen ble vurdert ved immunhistokjemi, immunfluorescens og
in situ
hybridisering for Y-kromosom. For å overvåke engraftment av donor β-actin-EGFP benmarg, ble perifert blod vurderes for GFP positivitet med fluoresens Activated Cell Sortering (FACS) på en måned etter transplantasjonen, deretter ved offer (tabell 1).
5 × 10
6 benmargceller fra mannlige β-actin-EGFP mus ble transplantert inn lethally bestrålt kvinnelige C57 /B6 mus. For vurdering av de normale bukspyttkjertel, ble pankreata høstet ved 3, 6, 9 og 12 måneder etter transplantasjonen. For kronisk pankreatitt, ble musene administrert intraperitonealt caerulein i 10 uker og deretter avlivet ved opphør av behandling, så vel som 3, 6 og 9 måneder etter behandling for å vurdere regenerering. For kreft i bukspyttkjertelen, ved en måned etter transplanterte mus ble administrert en intrapancreatic injeksjon av 7,12-dimetylbenzantracen (DMBA) og avlivet ved 4, 8, 12 eller 12 måneder etter DMBA-behandling eller ved en pankreatisk Massen ble detektert
kronisk pankreatitt
En måned etter transplantasjon, mus ble injisert intraperitonealt med 50 mikrogram /kg caerulein (# 152860; MP Biomedicals Inc., Solon, OH, USA) 5 ganger i løpet av 4 sammenhengende timer, to ganger i uken i 10 uker som tidligere beskrevet [29]. Musene ble avlivet ved gjennomføring av caerulein behandling (n = 8) og 3 (n = 8), 6 (n = 8) og 9 (n = 8) måneder etter caerulein behandling for å vurdere bukspyttkjertelen regenerering. En ekstra arm vurderes bukspyttkjertelen regenerering hos mus behandlet med caerulein på 6 måneder etter transplantasjon og ofret på 3 måneder etter opphør av caerulein behandling (n = 4) (figur 1).
Kjemisk Modell av kreft i bukspyttkjertelen
en måned etter transplantasjonen, ble musene bedøvet med isofluorane og en venstre lateral subcostal snitt i bukveggen ble utført og milten exteriorised å avdekke kroppen og halen i bukspyttkjertelen. 1 mg /50 pl 7,12-dimetylbenzantracen (DMBA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ble løst opp i PBS /0,1% Tween og injisert inn i hale i bukspyttkjertelen ved anvendelse av en 25G nål som tidligere beskrevet [30 ]. Milt og pankreas ble returnert til bukhulen og peritoneum /muskellagene og huden ble suturert lukket. Mus ble avlivet mellom 1-4 (n = 16), 5-8 (n = 6), 9-12 (n = 4) og 12 (n = 2) uker etter DMBA-behandling eller ved en pankreatisk masse ble detektert følgende abdominal palpasjon (figur 1). Som med modellen av kronisk pankreatitt, vurdert en ekstra arm bidrag BMDC til bukspyttkjertelen kreft etter induksjon med DMBA på både 6 (n = 10) og 9 (n = 10) måneder etter transplantasjon.
FACS analyse
perifert blod og benmarg celler ble analysert for GFP uttrykk med fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) (tabell 1).
perifert blod.
i en måned etter transplantasjon og ved offer, ble blod samlet via hale blø og samlet i BD Microtainers med litium /heparin (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). 1000 ul FACSlyse (1X) ble deretter tilsatt og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Rørene ble sentrifugert ved 1000 g i 5 minutter, supernatanten ble fjernet og cellene resuspendert i 200 ul kald PBS på is inntil analyse.
Bone Marrow.
Benmarg ble spylt fra lårben av transplanterte mus med kald PBS ved anvendelse av en 26G nål, filtrert gjennom en 70 um cellefilter og holdt på is før analyse. Fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse ble utført ved hjelp av en BD FACS CANTO (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
Immunohistochemistry /immunfluorescens /In-situ hybridisering
Immunohistochemistry.
Parafin innebygd bukspyttkjertelen vevssnitt (4 mikrometer) ble de-vokset og rehydrert før H E farging for å vurdere histologisk morfologi. For immunhistokjemi, ble antigen avsløring oppnådd ved hjelp av target-henting løsning (s2367, pH 9,0: DAKO Corporation, Carpenteria, California, USA) i 30 minutter i et kokende vannbad. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset med 3% -ig hydrogenperoksyd (5 minutter), skyllet i DAKO buffer (DAKO Corporation) deretter objektglass ble blokkert med DAKO Protein blokk (10 minutter; DAKO Corporation). Seksjonene ble deretter inkubert i 60 minutter med primært antistoff (se nedenfor) og deretter et merket polymer pepperrot peroksidase anti-kanin deteksjonssystem ble anvendt (30 minutter; Envision + anti-kanin; DAKO Corporation) og 3,3′-diaminobenzidin ble anvendt som en substrat. Counter-farging ble utført med Mayers hematoksylin (DAKO Corporation).
immunfluorescens.
For immunfluorescens analyse, 4 mikrometer parafinsnitt ble de-vokset, rehydrert og antigen hentes som beskrevet ovenfor. Seksjonene ble så blokkert med protein blokk (10 minutter), og deretter primære antistoffer (se nedenfor) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur, vasket i DAKO-buffer (3 x 5 minutter) og inkubert i sekundære antistoffer (se nedenfor) i 1 time ved romtemperatur. Fluorescerende farging av apikale membraner av eksokrine akinærceller ble utført ved bruk av rhodamin-konjugert jordnøttagglutinin (PNA, 1:200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Glassene ble skylt deretter kontra og montert i Vectashield hardt satt montering medium med DAPI (H-1500, Vector Laboratories)
primære antistoffer:. GFP kanin polyklonale (A11122, Invitrogen, Eugene, OR, USA; 1: 1000 IHC, 1:200 IF), GFP geitepolyklonalt (ab5450; Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:1000), amylase geitepolyklonalt (C-20, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA; 1 :200 IF), desmin (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA; 1:200 IHC), α-glatt muskulatur Actin monoklonalt (klon 1A4, A5228, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1: 1: 500 IHC /IF), vimentin (SP-20; Epitomics, Burlingame, CA, USA; 1:200 IHC), Cytokeratin 5/6 (D-13, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA; 1: 100 IHC), glial fibrillary surt protein (GFAP) kanin polyklonale (Z0334, DAKO Corporation, Carpenteria, California, USA; 01:50), pre-B-celle leukemi transkripsjonsfaktor 1 (PBX1) kanin polyklonale (ab12001; Abcam, Cambridge , MA, USA; 1:100), cadherin EGF LAG sju-pass G-type reseptor 3 (CELSR3) kanin polyklonale (ab12958; Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:100)
Sekundære Antistoffer:. Anti-kanin Cy5 (1:250; # 711-176-152, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA), anti-geit Cy5 (1:250; # 705-175-003, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA), anti-geit Cy3 (1:500; # 715-166-147, Jackson Immunoresearch), anti-mus Cy3 (1:500; # 715- 166-150; Jackson Immunoresearch)
In-situ hybridisering
Hele muse Y-kromosom probe merket med fluorescein (Star * FISH, # 1189-YMF-01,.. Cambio Ltd) ble påført til 3 um parafinsnitt følgende deparaffinization i xylen, forbehandling med DAKO target gjenfinning oppløsning (TRS: 30 min ved 95 ° C), proteasenedbrytning ved 37 ° C i 15 minutter og etter fiksering i nøytral bufret formalin i 10 minutter. Hybridisering nettstedet ble valgt med henvisning til en seriell seksjon farget med H + E. 3,5 ul probe ble anvendt under en mm dekkglass 15 x 15 forseglet med gummisement. Co-denaturering ved 90 ° C, etterfulgt av hybridisering over natten ved 37 ° C på en termosykler blokk. Etter hybridisering etter skyller i 2X SSC /0,3% NP-40 (2 x 2 minutter ved 72 ° C), slides ble tørket og motfarget med DAPI. Signal ble analysert med en Zeiss Axioscope II mikroskop med digital AxioCam og AxioVision programvare.
Resultater
Vellykket tilberedning av benmargen i transplanterte mus var påviselig i perifert blod på en måned etter transplantasjon ved hjelp FACS analyse for GFP uttrykk. I tillegg ble langtids innpoding verifisert ved tidspunktet for avlivelse. GFP positivitet fra perifert blod og benmarg ved hver endepunktet var sammenlignbar med den giver β-aktin-EGFP mus (Blood, 70,07% ± 3,90 SEM, Marrow, 30,87% ± 1,60 SEM). (Tabell 1)
BMDC og normale eksokrine pankreas
fra 3 måneder etter transplantasjonen, individ, ble donor-avledet GFP positive celler sett i eksokrin pankreas epithelial rommet av ikke-behandlede kontroll transplanterte mus (figur 2A). Små GFP-positive celler som hadde spindellignende, eller immun cellemorfologi ble spredt over hele interstitium (data ikke vist), mens sjeldne forekomster av GFP-positive celler med acinar morfologi var tilstede i den eksokrine rommet. Ved nærmere undersøkelse ved hjelp av co-immunfluorescens, disse cellene var positive for GFP, amylase og jordnøttagglutinin (figur 2C, 2D), markører spesifikke for pancreatic akinærceller, noe som tyder på at BMDC kan innlemme i den voksne bukspyttkjertelen og vedta den differensierte tilstand av eksokrin kupé. Sammenhengende klynger av 2-3 celler ble observert fra 6 måneder etter transplantasjonen, mens sporadisk hele acinar enheter bestående av donor-avledet GFP positive celler var også tydelig (figur 2B, 2E, 2F).
GFP immunhistokjemi av pankreata identifisert person GFP + ve donor-deriverte celler med acinar cellemorfologi fra 3 måneder etter transplantasjon (A), og sporadisk hele acinar enheter (B), ble observert fra 6 måneder etter transplantasjonen. Immunofluorescence bilder av donor avledet GFP + ve akinærceller co-farging positiv for både GFP og amylase (C, E); og GFP og PNA (D, F).
BMDC og bukspyttkjertelen skade
En eksperimentell arm å vurdere engraftment av donor BMDC i bukspyttkjertelen spesifikk skade (kronisk pankreatitt) og regenerering var også etablert. Etter 10 uker caerulein behandling, mus hadde pankreata som hadde magre, og peri-acinar fibrose utviklet som en fin meshwork hele eksokrin kjertel. Intra-acinar lumina ble utvidet. Noen acinar heter viste seg å utvikle en ductal fenotype med tap av zymogen granuler og mer sentralt plasserte kjerner. Disse rørformede komplekser besto av sylindere med et bredt hulrom omgitt av et monolag av utflatede kanalsystem-lignende celler (fig S1B, E) [31], [32]. Kontroll pankreata var histologisk normale (figur S1 A). Sirius rød farging av interstitiell kollagen var mer fremtredende i caerulein behandlet mus, en indikasjon på kronisk skade. Farging i kontrolldyrene ble lokalisert primært rundt kanalene, små blodårer med tynne tråder som strekker seg mellom større lobules, og ikke rundt enkelt acinar enheter. I caerulein behandlet dyrene periacinar kollagen økt, rundt enkelt acinar heter, lik den fibrose observert i menneskelige kronisk pankreatitt (Tall S1D, E).
Ved opphør av caerulein behandling (3 måneder etter transplantasjon umiddelbart etter skade) det ble økt BMDC rekruttering til bukspyttkjertelen (figur 3A). Dette inkluderte rekruttering av GFP positive inflammatoriske celler så som lymfocytter (positive for CD45 ekspresjon; data ikke vist) og makrofager, mens noen BMDC lokalisert mellomrommene var positive for desmin, og spindel som peri-akinærceller besatt morfologien av pankreas stel celler ( pasc er; Figur 3C). Det er ingen akinærceller ble identifisert til å være donor avledet (GFP positiv) i en tidlig endepunktet.
Merk økt tilstedeværelse av GFP-positive celler i interstitium av de skadde bukspyttkjertel, inkludert inflammatorisk infiltrat (A), sammenlignet den regenererte bukspyttkjertel (B); så vel som de GFP positive spindelende celler (sort pil) med en pankreatisk stel cellemorfologi (C) som omgir acinar heter (a); (D) Y-kromosom FISH bekreftet minimal bidrag BMDC til regenerering av eksokrin parenchyma, mens noen Y positive lymfocytter ble observert i hele parenchyma (hvite piler).
BMDC og bukspyttkjertelen regenerering
Ved opphør av caerulein behandling, dyr var igjen for å gjenopprette å vurdere bidraget av BMDC til bukspyttkjertelen regenerering. Etter 3 måneder med utvinningen post opphør av caerulein behandling, pankreata av behandlede dyr tilbake til en histologisk normal fenotype (figur S1C), som minner om ikke-behandlede dyr. En reduksjon av interstitiell og periacinar kollagen var også synlig (figur S1F). Som for normale bukspyttkjertelen, bare i sjeldne tilfeller enkle og små klynger av GFP positive akinærceller viser amylase og PNA positivitet ble observert, noe som tyder på at BMDC kunne vedta den differensierte tilstand av eksokrin rommet under bukspyttkjertelen regenerering. Interstitiell GFP positive inflammatoriske celler ble redusert i antall som regenerering tid økt (figur 3B). Lignende resultater ble observert for mus som ble behandlet med caerulein følgende lang sikt engraftment (6 måneder etter transplantasjon) og venstre for å komme seg.
In situ
hybridisering for Y-kromosomet bekreftet at det ikke var noen økning i bidraget fra BMDC til eksokrin pankreas med regenerering (figur 3D).
BMDC og bukspyttkjertelkreft
To uker etter injeksjon av DMBA, rørformede komplekser var til stede fokalt blant akinærceller med ductal metaplasi i tilknytning til det normale acinar vev observert etter 1 måned. Fra en måned etter DMBA behandling, bukspyttkjertelen forstadier (mPanIN) med varierende grad av dysplasi var til stede. Foci av adenokarsinom i forhold til mPanIN ble sett i bukspyttkjertelen fra 2 måneder etter DMBA, mens ductal adenokarsinom (sarcomatoid variant) utviklet ved 3-4 måneder (Tall S1G-I). Dette fenotype lignet det man ser i en lignende modell som brukes av Kimura et al [30].
Vi vurderte bidrag BMDC til desmoplastic stroma, spesielt til befolkningen i bukspyttkjertelen stel celler, ved å vurdere co- uttrykk for GFP og stel celle selektive markører desmin, glial fibrillary surt protein (GFAP), α-glatt muskel aktin (αSMA), co-uttrykk som definerer aktiverte stel celler [3], [33], [34] ( anmeldt i [35]). Disse markørene, som opprinnelig ble identifisert som pasc bestemt, blir brukt til å skjelne pasc S fra normale fibroblaster på grunn av det ko-ekspresjon av de mellomliggende filamentproteiner desmin og GFAP [33], [34], mens ekspresjon av αSMA i pasc største ble opprinnelig beskrevet som en kilde fibrose i kronisk pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen, som betegner aktivert pasc s [3], [36]. Det var signifikant BMDC rekruttering til stroma som omgir forstadier etter DMBA-behandling, med bidrag av BMDC til den aktiverte bukspyttkjertelen stelcellepopulasjon (GFP, desmin og αSMA positiv, Fig S2A, C, E). Co-immunofluorescens-analyse viste også at donor-avledede BMDC positivt både GFP og αSMA var tilstede i cellene i direkte tilknytning til pankreatiske intraepitelial neoplasi (mPanIN) lesjoner (figur S2B, D, F). Vi har også observert utviklingen av en stor, dårlig differensiert og invasiv cytokeratin positive /vimentin negativ duktalt adenokarsinom (sarcomatoid) svulst med en betydelig BMDC befolkningen (figur 4A, 4B), som inkluderte en omfattende donor avledet inflammatorisk infiltrat, demonstrert ved hjelp av FISH for Y-kromosomet (Y-FISH, figur 4C), samt benmargs avledet aktiverte bukspyttkjertelen stel celler (Figur 4D), visualisert ved co-immunfluorescens av GFP med αSMA (figur 4D). Benmarg avledet epiteliale kreftceller ble ikke sett. Vi kvantifisert andelen BMDC innen svulsten mikromiljøet i 5 høye strøm forstørrelse felt (400X) og funnet ut at 41,8% (± 2,77 SEM) av celler ble benmarg avledet (figur 4). Lignende resultater ble observert når vi administreres DMBA følgende lang sikt engraftment (6 måneder etter transplantasjon)
(A) H . E viser dårlig differensiert, invasive bukspyttkjertelen svulst; (B) GFP IHC og (C) y-kromosom FISH, demonstrerer omfattende benmargen avledet cellepopulasjon i tumoren; (D) Samtidig immunfluorescens av GFP med αSMA identifisert benmarg avledet aktivert stel celler i tumor (pilspiss).
Mer nylig, Erkan
et al product: [37] brukt transkripsjon profilering for å identifisere markører for å skille pasc er forbundet med kronisk pankreatitt versus de av kreft i bukspyttkjertelen, med sikte på å subtyping pasc s inn i enten betennelse eller kreft-assosiert. Pre-B-celle leukemi transkripsjonsfaktor 1 (PBX1) ble oppregulert i betennelse-assosiert pasc er i forhold til tumor-assosiert pasc tallet, mens cadherin EGF LAG sju-pass G-type reseptor 3 (CELSR3) uttrykk ble oppregulert i tumor-assosiert pasc er sammen i tillegg til betennelse-assosiert pasc s [37]. Vi undersøkte 5 seksjoner hver fra 3 mus som utviklet adenokarsinom og observerte at GFAP, PBX1 og CELSR3 uttrykk var samlokalisert med GFP i tumorassosiert pasc tallet (figur S3A, S3b, S3C henholdsvis), og selv om PBX1 (men ikke CELSR3) ble oppdaget i stroma i pankreatitt, det gjorde ikke co-lokalisere med GFAP, noe som tyder på at det ikke ble uttrykt i aktiverte stel celler.
Diskusjoner
Kjønns umake hele benmargstransplantasjon viste at BMDC migrere til bukspyttkjertelen og utvide som klonale enheter til å vedta differensierte statene i eksokrin rommet. Selv om det var minimal rekruttering til acinar cellepopulasjon, som ikke øker med skade, gjenfødelse, eller karsinogenese, var det betydelig rekruttering til stroma. Selv om de fleste rekruttert celler under akutte skader og kreft var inflammatoriske celler, en andel differensiert i stel celler. De som er forbundet med kreft uttrykt markører karakteristisk av tumor-assosiert stel celler som tyder på at de var co-valgt, og endret av svulsten mikromiljøet.
Mens regenerativ kapasitet opprettholdes i voksen eksokrin pankreas, opprinnelsen til regenererende epitel restene uklart [38]. Nylig har en mekanisme av klonal utvikling av pankreatisk acini blitt beskrevet med bevis forutsatt at en enkelt stamceller, enten det er en moden acinar celle eller en multipotent stamcelle, gir opphav til alle eksokrine celler av en acinus [39]. Videre avstamning sporing studier gir holdepunkter for at nye akinærceller genereres fra pre-eksisterende akinærceller følgende delvis pancreatectomy [40] og caerulein indusert pankreatitt [41]. Gitt disse dataene, og våre observasjoner i de vanlige bukspyttkjertelen, hypotese vi at BMDCs bidra til regenerering av eksokrin rommet. Til tross for hjelp av ulike skader protokoll tidspunkter vi ikke var i stand til å demonstrere en betydelig økning i BMDC bidrag til acinar cellepopulasjon. Y-kromosom FISH data ekskludert GFP stanse [42], [43], [44] som en potensiell årsak til manglende GFP uttrykk, og gjenspeiles GFP positive cellefordeling.
pasc er er bosatt myofibroblast-lignende celler som finnes i den periacinar plass av eksokrin pankreas, og det er økende bevis for at de er sentrale aktører i patogenesen av bukspyttkjertelen eksokrine sykdommer, spesielt i produksjon av rikelig fibrøst stroma, som er en funksjon av kreft i bukspyttkjertelen [3]. Selv om det var signifikant BMDC rekrutteringen av inflammatoriske infiltrat ved tidspunktet for pankreatisk skade i samsvar med tidligere rapporter [45], [46], dette var forbigående og celletall redusert over tid, til lave nivåer når regenereringen var fullført. Imidlertid forble stel celler blant rest befolkningen i BMDC. Denne observasjonen tyder på at BMDC spille en rolle i å støtte regenerativ prosess, men omdannes ikke å bidra til den regenerative epitelet i seg selv. Tumor assosiert BMDC pasc s kan holdes i den peri-tumor stroma, mens de som er forbundet med pankreatitt er ikke. Selv om antall benmarg avledet pasc var litt mindre i innstillingen av pankreatitt i forhold til kreft, ville lengre tidspunkter for å fastlå om BMDC ble fortrinnsvis beholdt i bukspyttkjertelen i innstillingen av kreft.
Som i kronisk pankreatitt, ble det økt rekruttering av BMDC til bukspyttkjertelen etter behandling med DMBA. Dette igjen inkludert en inflammatorisk infiltrat og aktivert pasc tallet. Viktigere, uttrykk for CELSR3 i BMDC forbundet med svulst tyder på at det var endring av disse pasc tallet av svulsten mikromiljøet. Dette støttes av nyere studier der benmargavledede stamceller fortrinnsvis lokalisere til regioner av bukspyttkjerteltumorvekst [47] og har vist seg å forvandle seg til tumorassosierte myofibroblasts i insulinomer [48]. Kreft i bukspyttkjertelen celler utskiller vekstfaktorer som TGF-β1, PDGF og VEGF, samt ekstracellulære matriks (ECM) metalloproteinase-indusere som omdanner de vanligvis hvilende pasc s inn i en aktivert myofibroblast-type fenotype og skiller ut overskuddsmengder av ECM og matrisenedbrytende enzymer [ ,,,0],3], [4], [49] (oversikt i [50]).
