Abstract
Bakgrunn
Faktorer som påvirker differensial svarene av prostatakreft til androgen reseptor (AR) Axis-rettet terapi er dårlig forstått, og prediktorer for behandlingseffekt er nødvendig. Vi antok at effekten av å hemme DHT ligand syntese forbinder med intra-tumor androgen forholdstall som indikerer relativ avhengighet av DHT-mediert vekst.
Metoder
Vi kjennetegnet to androgen-sensitive prostatakreft xenograft modeller etter androgen undertrykkelse av kastrering i kombinasjon med SRD5A hemmer, dutasteride, samt et panel av kastreringsresistent metastaser innhentet via rask obduksjon.
Resultater
i LuCaP35 svulster (intra-tumor T : DHT-forhold 02:01) dutasterid trykt DHT til 0,02 ng /g og forlenget overlevelse vs. kastrasjon alene (337 vs.152 dager, HR 2,8, p = 0,0015). I LuCaP96 svulster (T: DHT 10:01), ble overlevelse ikke bedret tross lignende DHT reduksjon (0,02 ng /g). LuCaP35 demonstrerte høyere uttrykk av steroid biosyntetiske enzymer opprettholde DHT nivåer (5 ganger høyere SRD5A1, 41 ganger høyere, 99 ganger høyere RL-HSD, p 0,0001 for begge), tilberedning av intra-tumor DHT (til ~ 30% av ubehandlet tumorer), og ~ 2 ganger økt ekspresjon av full lengde AR. I kontrast, LuCaP96 viste høyere nivåer av steroid catabolizing enzymer (6,9 ganger høyere AKR1C2, 3000 ganger høyere UGT2B15, p = 0,002 og p 0,0001 henholdsvis), vedvarende undertrykkelse av intra-tumor DHT, og 6-8 ganger induksjon av full lengde AR og liganden uavhengig V7 AR spleisevariant. Humane metastaser viste bioaktive androgen-nivåer og AR i full lengde og AR-spleise variant uttrykk i samsvar med det området som er observert i xenotransplantater.
Konklusjoner
Indre forskjeller i basal steroid, samt variable uttrykk av full lengde og spleise-variant AR, forbinder med respons og motstand mot pre-reseptor AR ligand undertrykkelse. Uttrykk for steroidogenic enzymer og AR isoformer kan tjene som potensielle biomarkører av følsomhet for potent AR-aksen hemming og bør validert i flere modeller
Citation. Mostaghel EA, Morgan A, Zhang X, Marck BT, Xia J Hunter-Merrill R, et al. (2014) prostatakreft egenskaper knyttet Response til Pre-Receptor målretting av Androgen Axis. PLoS ONE 9 (10): e111545. doi: 10,1371 /journal.pone.0111545
Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 19 februar 2014; Godkjent: 01.04.2014; Publisert: 30 oktober 2014
Copyright: © 2014 Mostaghel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prostate Cancer Foundation Career Development Award (EAM) og Challenge Award (EAM, SP, RLV, AMM, RBM, PSN), Damon Runyon Genentech-Clinical Investigator Award C-40-08 (EAM), NIH gi 1K23 CA122820-01 (EAM) DOD New Investigator Award W81XWH-10-1-0228 (EAM); GlaxoSmithKline (A. M. og P.S.N.); 1RC1 CA146849 (P.S.N.); PC093509 (P.S.N.); PO1 CA 85859 (J.X., R.G., R.V., P.S.N.); NIH /NCI Pacific Northwest Prostate Cancer SPORE P50CA97186 (J.X., relativ fuktighet, R.G., P.S.N., R.V.); og Department of Veterans Affairs (B.T.M., S.P. og A.M.M.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: A.M.M., R.B.M. og P.S.N. har konsultert og fått forskningsstøtte fra GlaxoSmithKline. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Selv om utgangspunktet svært effektive, androgen deprivasjon terapi for prostatakreft er jevnt preget av progresjon til kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) over en periode på 18-36 måneder, med en påfølgende median overlevelse på 1-2 år. [1] Mens androgenreseptoren (AR) -regulated genekspresjon blir først undertrykkes, [2], [3] transkripsjonen program regulert av AR reaktiveres i CRPC via mekanismer som opprettholder både ligand og reseptor-mediert bidrag til AR signalering. [4] – [6] Disse omfatter rest intratumorale androgener på nivåer som er tilstrekkelig til å aktivere AR program, [7] – [9] og økt AR-aktivitet, enten via amplifikasjon eller overekspresjon (noe som resulterer i forbedret følsomhet for lave ligand nivåer) [10 ], [11], eller via den nylig beskrevne ekspresjon av avkortede ligand-uavhengig AR spleisevarianter (AR
sv) mangler den ligandbindende domene (LBD). [12] – [17] Spesielt, studier av maksimal eller kombinert androgen blokade utnytte steroide eller ikke-steroide AR antagonister som er rettet mot AR LBD har bare vist en liten, om enn statistisk signifikant, forbedring av fem års overlevelse (27,6 vs. 24,7 %; p = 0,005). [18] Den enkleste forklaringen for den manglende større effekt er den manglende evne av disse AR-antagonister for å utkonkurrere rest testosteron (T) og dihydrotestosteron (DHT) (som har AR bindingsaffiniteter som langt overstiger de syntetiske anti-androgener), [ ,,,0],19] eller en manglende evne til effektivt å målrette AR
sv mangler LBD.
de kliniske reaksjoner på nye potent AR antagonister og nye steroidsyntesehemmere, kombinert med bevis for intracrine androgen biosyntesen i prostata kreft tyder på at begreper av maksimal androgen blokade bør revisited og raffinert. En fersk studie designet for å målrette flere trinn i androgen biosyntesen hos menn sviktende ADT (med hydrokortison, det CYP17A1 hemmeren ketokonazol, og steroid 5-alfa-reduktasehemmere (SRD5A) dutasterid) produsert betydelige PSA synker i de fleste pasienter og median responsvarighet 20 måneder. [20] Således klinisk effekt kan ikke kreve en AR-antagonist i innstillingen av mer effektiv undertrykkelse av «pre-reseptor» signalisering gjennom reduksjon av AR-ligander. Viktigere, effektiviteten av å hemme AR aktivering i prostatakreft, enten gjennom forbedret pre-reseptor tilnærminger eller de direkte rettet mot AR, varierer betydelig mellom pasienter, og de faktorer som bidrar til disse differensial utfall er ukjent. For eksempel forebyggende forsøk med SRD5A hemmere betydelig redusert hastighet til å oppdage lokaliserte prostatakreft, men denne intervensjonen var helt klart ikke effektive i å forebygge kreft progresjon eller påvisning i alle mennesker. [21], [22] Tilsvarende har de siste kliniske studier av nye hemmere av CYP17A1 og AR i menn med CRPC rapportert betydelige inter-pasient forskjeller i objektive responser [23], [24].
I denne studien , søkte vi å bestemme kreftspesifikke egenskaper som påvirker responsen av prostatakreft hemming av pre-reseptor AR signalering, ved hjelp av androgen deprivasjon kombinert med dual SRD5A hemmer dutasterid. T og DHT er biologisk aktive med høy affinitet AR ligander. Imidlertid er mellom 3-10 ganger høyere konsentrasjoner av T som kreves for å utøve de samme AR-mediert transkripsjonelle effekter av DHT. [25], [26] således redusere DHT-nivåer ved å inhibere omdannelsen av T til DHT kan representere et effektivt pre-reseptoren metode for å undertrykke den totale størrelsen av bioaktivt AR signalering. Vi antok at virkningen av SRD5A hemming på tumorvekst vil knytte til intra-tumor androgen nivåer og /eller uttrykk for steroid biosyntetiske enzymer som tyder på en relativ avhengighet av DHT-mediert vekst. Faktorer som bestemmer den relative respons av prostatatumorer til pre-reseptor androgen undertrykkelse med midler så som SRD5A inhibitorer er ikke kjent, men kan tjene som prediktor for effekt for disse midler i forebygging av prostatacancer, eller som en komponent av ADT i fremskreden sykdom.
Materialer og Metoder
LuCaP Menneskelig prostatakreft xenografter
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes Helse. Alle forsøk med dyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av Fred Hutchinson senter Institutional Animal Care bruk Committee (fil 1775). Alle operasjoner ble utført under isofluorane anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. De LuCaP35 og LuCaP96 linjene er pasient avledet xenografter som ble etablert som en del av University of Washington vev bank som tidligere beskrevet [27], [28] og ble valgt ut for analyse som begge linjene demonstrere kastrering sensitiv vekst i intakte hannmus. Kort fortalt LuCaP35 ble avledet fra en lymfeknutemetastase hentet fra en 66 år gammel hvit mann med CRPC. LuCaP96 ble avledet fra transuretral reseksjon av primær Gleason 9 prostata carcinoma oppnådd i en 61 år gammel hvit mann en måned før dokumentasjon av kastrering-resistent sykdom. I både xenografter AR exonic DNA-sekvensen er villtype (data ikke vist).
Mann CB-17 SCID-mus (Charles River Laboratories, Wilmington MA) ble implantert subkutant med 30 mm
3 kreft stk . Når tumorer nådde et gjennomsnitt på 300 mm
3, mus (LuCaP35 n = 62; LuCaP96 n = 65) ble kastrert (Cx) og randomisert til behandling med bil eller dutasterid (Dut) terapi over 8 uker. Dutasterid ble administrert (PEG monolaurate (Sigma 460 133) /1% Tween 80 (Sigma P4780)) ved oral sonde 5 dager i uken i et volum på 200 ul. Tumorvolumet ble bestemt ved den følgende formel (lange og korte akse lengder i mm): lang x (Short∧2) /2. Svulster fra en undergruppe av mus i hver årsklasse ble høstet på tidlige tidspunkter av behandlingen (tumorstørrelse på ca. 500 mm
3; range 7-21 dager). Når tumorer nådde ca. 750-1000 mg i størrelse ble dyrene avlivet ifølge institusjonelle protokollen og xenotransplantater høstet og flash-frosset for bestemmelse av vev androgener og utvinning av total RNA. Gjennomsnittlig antall dager mus i Cx + DUT grupper hadde vært av dutasterid behandling på tidspunktet svulster ble resected var 211 dager for LuCaP35, og 96 dager for LuCaP96. Dutasterid ble sjenerøst gitt av GlaxoSmithKline.
Alle prosedyrer som omfatter mennesker ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Washington Medical Center, og alle fag signert skriftlig informert samtykke. Pasienter med metastatisk prostatakreft gikk raske obduksjoner i regi av University of Washington Prostate Cancer Donor Autopsy Program som tidligere beskrevet [9], [27]. Obduksjoner ble utført i løpet av 4-10 timer døden. Prøver av alle grove metastatiske tumor nettsider ble oppnådd under sterile forhold og stedet, og volumet av ossøs og ikke-ossøs metastaser ble registrert. Friskt vev ble hurtigfrosset i flytende nitrogen umiddelbart etter høsting og holdt ved -80 ° C.
Steroid Målinger
androgennivåer i xenograft vev ble bestemt ved massespektrometri (MS) ved hjelp av fremgangsmåter har vi rives. [29] Denne fremgangsmåten resulterte i en lavere grense for kvantifisering av 1 pg per prøve for testosteron og DHT. Intra-assay variasjonskoeffisient generert ved hjelp av humant serum for høy, middels og lav-range prøvene var 3,5, 3,1 og 3,8% for testosteron og 6,3, 4,3 og 15,8% for DHT hhv.
RNA Isolation, kvantitativ RT -PCR og immunhistokjemi
Prøver ble brukt for RNA isolering, cDNA syntese og kvantitativ RT-PCR ved hjelp av metoder og primere vi tidligere har beskrevet. [9], [30] immunhistokjemisk farging og scoring for AR og PSA ble utført som vi har tidligere beskrevet [31] med et polyklonalt anti-PSA-antistoff (DAKO, Inc.), et anti-AR-antistoff rettet mot den N- terminus (klon F36.4.1, Biogenex), og en anti-AR-antistoff rettet mot C-terminus (C-19, Santa Cruz). Negative kontroll immunostains, erstatte preimmunt immunoglobulin av samme art som den der antistoff ble generert, viste ingen reaksjon produktet.
Statistiske analyser
For å vurdere forskjeller i tumorvolumet bane, må vi først bestemmes giringspunktene i tumorvekstkurver ved bruk av t-test for i rekkefølge å sammenligne tumorvolumer hver to dager. Etter å segmentere kurvene, vi brukt en lineær blandet modell for å kvantifisere behandlingseffekten på tumorvekst for hver lineær periode med tilbakegang loggtumorvolumet på dagen for måling, på behandlingsgruppe, og på et samspill mellom dag og behandling, mens regnskap for variasjon i initial tumor volum over mus. Progresjonsfri overlevelse i kastrering vs kastrering + dutasterid behandlet mus (definert som tumorstørrelse 750 mm
3) ble bestemt via Kaplan Meier analyse med sammenligning av kurver ved hjelp av Mantel-Haenszel logrank test. Å forutsi omtrentlig utvalgsstørrelsen i hver behandlingsgruppe som kan være nødvendig for å oppdage en statistisk signifikant effekt av kastrering pluss dutasterid versus kastrering alene, benyttet vi komplett sak oppdatering for en rekke utvalgsstørrelsene n = 10, 20, …, 200 mer enn 500 bootstrap gjentak. For hver prøve størrelse og bootstrap replikere, passer vi en Cox-modell og registrert estimert hazard ratio og p-verdi.
For analyse av QRT-PCR data, var gjennomsnittlig syklus terskel (Ct) for hvert gen ble normalisert til ekspresjon av husholdningsgenet RPL13A i den samme prøven (delta Ct). Gjennomsnittlig uttrykk for RPL13A var 15,6 +/- 0,5 (gjennomsnitt +/- SD) og 14,1 +/- 0,8 i LuCaP35 og LuCap96 svulster hhv. Welch to utvalgs t-tester ble brukt for å sammenligne forskjeller i androgen nivåer og forskjeller i gjennomsnittlig delta Ct-tallet for hvert gen mellom behandlingsgruppene uten korreksjon for multippel testing. P-verdiene 0,05 ble betraktet som signifikant. Flippen endringen ble beregnet av delta-deltaet Ct-metoden (fold = 2
ΔΔCt). Den rå DCT-tallet, ddCT og fold endringer er presentert i de supplerende data.
Resultater
Prostata kreft reagerer på androgen undertrykkelse demonstrere iboende forskjeller i basale nivåer av intratumorale androgener og steroidogenic genekspresjon
for å evaluere tumor egenskaper knyttet til respons og motstand mot AR sti-rettet terapi, vi først bestemt intratumorale androgener og steroidogenic genuttrykk i to prostata kreft pasient avledet xenografter, LuCaP35 og LuCaP96. Disse linjene uttrykker AR og PSA, (figur 1A) og svare på kastrering med tumor regresjon og forlengelse i progresjonsfri overlevelse (PFS), men til slutt videre til kastrering-resistente vekst (p 0,0001 for både Figur 1B, 1C). Spesielt LuCaP35 og LuCaP96 svulster resected fra mus med intakt gonadefunksjon utstilt markerte forskjeller i basale nivåer av intratumorale androgener (figur 1D): LuCaP96 svulster har høyere nivåer av T og tilsvarende nivåer av DHT, og dermed en høyere andel av intratumoral T: DHT sammenlignet med LuCaP35 svulster, på 10:01 og 02:01, henholdsvis (LuCaP96 T = 10,2 ± 6,5 ng /g; DHT = 0,9 ± 0,4 ng /g; LuCaP35 T = 2,6 ± 2,0 ng /g; DHT = 1,4 ± 0,8 ng /g, Tabell S1)
(A) Representative FFPE-prøver av hver xenograft ble farget med hematoksylin og eosin (H . E) og for ekspresjon av androgenreseptoren (AR) og PSA som angitt. Skalaen bar (avbildet på PSA-tallene for enkel visualisering) er 50 pm. Kaplan-Meier plott av progresjonsfri overlevelse (definert som tumorstørrelse 750 mm
3) i mus med LuCaP35 (B) eller LuCaP96 (C) xenografter. Intakte hann SCID-mus ble implantert subkutant med 30 mm
3 stykker av de angitte xenografter. Når tumorer nådde ~300 mm
3, ble musene tilfeldig innmeldt i kohorter som enten var intakt (No Cx) eller kastrerte (Cx). P-verdier for kurve sammenligninger ble generert ved hjelp av Mantel-Haenszel logrank test. (D) Mean og standardavvik av vev testosteron (T, svart strek) og DHT (grå linje) nivåer målt ved massespektrometri i svulster i angitte xenograft (passert i intakt mus). (E) Relativ uttrykk for transkripsjoner for de angitte steroidogenic genene ble beregnet ved hjelp av deltaet dCt metoden (endring = 2∧ddCt). Gener forskjellig uttrykt i LuCaP35 vs. LuCaP96 innenfor en størrelsesorden er angitt i de grå linjene. Signifikante forskjeller (ved Welch t test; p 0,05) er angitt med svarte sirkler; hvite sirklene viser gener som ikke var signifikant forskjellig mellom LuCaP35 og LuCaP96 (alle verdier gitt i Tilleggsdata 2) .Upward trekanter viser svært forskjellig uttrykt gener spesifikt fører til økt T (AKR1C3, 40 ganger) eller økt DHT nivåer (SRD5A1, 5,0 ganger ; 17BHSD10 4,8 ganger; RLHSD, 99 ganger). Nedadgående trekanter indikerer sterkt differensielt uttrykte gener spesifikt medier DHT katabolisme (AKR1C2, 7 fold, UGT2B15, 3000 fold).
For å identifisere mekanismer som bidrar til basale forskjeller i intratumor T og DHT konsentrasjoner, vi evaluert tumor-spesifikk ekspresjon av transkripter som koder for de primære enzymer involvert i steroid-syntese og nedbrytning (figur S1). Mens mange steroidogenic gener ble uttrykt i LuCaP35 innenfor en størrelsesorden av deres ekspresjon i LuCaP96 (figur 1E), flere forskjeller i samsvar med de forskjellige tumor androgen profiler var til stede. Spesielt genekspresjon i LuCaP35 var i overensstemmelse med androgen produksjon og vedlikehold av DHT nivåer, noe som viser høyere nivåer av steroid-biosyntetiske gener som STAR (10 ganger) og HSD3B1 (10 ganger) høyere ekspresjon av gener som medierer DHT produksjon (SRD5A1 , 5-fold, 17BHSD10 4,8-fold, RLHSD, 99 ganger), og lavere uttrykk av gener som medierer DHT katabolisme (AKR1C2, 7 ganger lavere, UGT2B17, 3000 ganger lavere). I motsetning til dette, genekspresjon i LuCaP96 var i overensstemmelse med produksjon og vedlikehold av T, med betydelig høyere nivåer av AKR1C3 (40 ganger, i samsvar med en økning i T produksjon fra androstendion), sammen med lavere nivåer av SRD5A1 (det primære enzymet som er ansvarlig for konvertering av T til DHT i neoplastisk prostata vev) [32] og høyere nivåer av DHT katabolisme enzymer AKR1C2 og UGT2B17. (Cycle terskler og kaste endringer for alle gener i figur 1E er presentert i tabell S2). Siden disse svulstene ble dyrket i genetisk identiske murine verter, disse dataene identifisere iboende tumorspesifikk variasjon i androgen metabolske programmer som kulminerte i merkede intratumorale forskjeller i AR ligand konsentrasjoner.
Pre-reseptor androgen vei undertrykkelse med kastrering pluss SRD5A hemming viser en tumor-spesifikk effekt i å forsinke progresjon til CRPC
Gitt 5-10 ganger høyere potens av DHT i å engasjere og aktivisere AR forhold til T, [25], [26] strategier rettet mot DHT reduksjon ved å hemme metabolisme av T til DHT kan representere et effektivt pre-reseptoren metode for å undertrykke den totale størrelsen av AR signalering. For å finne ut om kreftspesifikke forskjeller i basal forholdet mellom intratumoral T: DHT ville påvirke klinisk respons på midler rettet mot konvertering av T til DHT, behandlet vi årskull av mus med LuCaP35 og LuCaP96 svulster med kastrering alene, eller kastrering pluss dual SRD5A inhibitor dutasterid. Intakte hann SCID-mus ble subkutant implantert med 30 mm
3 stykker av LuCaP35 eller LuCaP96 svulster. Etter vekst i ~300 mm
3, mus ble kastrert og randomisert til kjøretøy eller dutasterid administrert ved oral føring i 8 uker.
gjennomsnittlig tumorvolum i LuCaP35 svulster ble markert undertrykt av en kombinasjon av kastrering pluss dutasteride vs. kastrering alene (Figur 2A). Tumor vekst fant sted i tre forskjellige stadier etter initiering av behandling: en kort periode med fortsatt vekst (dager 0-14), en langvarig fase av tumor regresjon eller stabilitet (dager 14-75), og en avsluttende fase av tumor re-vekst ( dager 75-200). For bedre å kvantifisere effekten av dutasterid sammenlignet vi tumorvolum baner i kastrering vs kastrering pluss dutasterid grupper etter lineær blandet modell brukes på hvert etterbehandlingsfasen. Dutasterid pluss kastrering sunket betraktelig den prosent økning i tumorvolum per dag versus kastrering alene i den første «on-behandling» scenen (fra 3,2% [95% CI 2.7 til 3.7] til 0,9% [95% KI 0,2-2,0]; p 0,0001), og økte prosent av tumor regresjon per dag i den påfølgende fasen (fra 1,2% [95% KI 0,5-1,8] til 3,6% [95% KI 2,0 til 5,3]; p 0,0001). Men etter seponering dutasterid-behandlede tumorer demonstrerte raskere prosent re-vekst per dag (fra 1,1% [95% KI 0,9 til 1,3] til 2,3% [95% CI 1.8 til 2.9]; p 0,0001), noe som tyder fortsatt behandling vil være nødvendig for å opprettholde terapeutisk effekt.
Midlere tumorvolumer i mus som bærer LuCaP35 (A) og (B) LuCaP96 xenografter. Intakte hann SCID-mus ble subkutant implantert med 30 mm
3 stykker av den angitte xenograft. Når tumorer nådde ~300mm
3, mus ble kastrert og tilfeldig innmeldt i kohorter behandlet med enten bilen (Cx) eller dutasterid (Cx + Dut) i 8 uker (markert med svart strek over x-aksen). Midlere tumorvolum er avbildet for hver behandlingsgruppe på de angitte dager etter innmelding (Cx, svarte firkantene, Cx + DUT, hvite sirkler).
I kontrast, ble tumorvolumer i LuCaP96 svulster ikke undertrykt av tillegg av dutasterid til kastrering (figur 2B), med ingen endring i hasardratio (HR) for PFS (HR 0,9, p = 0,97, ikke vist). For å undersøke hvor mye den ikke-signifikant forskjell var på grunn av det antall dyr, har vi bootstrapped fra de opprinnelige dataene 500 ganger og funnet at selv med n = 170 mus per behandlingsgruppe, en beskjeden (HR 1.4), men statistisk signifikant forbedring i overlevelse ble observert hos bare 50% av iterasjoner, noe som tyder på at sannsynligheten for å detektere en klinisk relevant behandlingseffekt i en større undersøkelse var lav. Samlet er disse observasjonene viser at pre-reseptor androgen vei undertrykkelse med kastrering pluss SRD5A hemming kan forsinke progresjon til kastrering motstandsdyktig vekst. Men denne reaksjon er ikke universelt, men heller synes å være tumortypespesifikk, og er forbundet med de tumorer som oppviser en androgen metabolsk enzym-profil rettet mot å opprettholde intratumorale DHT-nivåer, for eksempel LuCaP35, i stedet for et T-fremherskende tumor slik som LuCaP96.
tumor størrelse ved behandlingsstart påvirker den langsiktige svar på androgen undertrykkelse pluss SRD5A hemming
for ytterligere å undersøke kreft egenskaper knyttet til respons til pre-reseptor AR vei hemming, vi avgjort om svar til behandling var knyttet til tumorstørrelse ved behandlingsstart. Selv om studien var designet for å begynne behandlingen på en tumor volum ~300 mm
3, logistikken i dyreforsøk resulterte i en målbar variasjon i tumorstørrelse ved studiestart. Vi vilkårlig gruppert svulster i kohorter av 250 mm
3, 250-400 mm
3, og 400 mm
3 ved innmelding og sammenlignet effekten av kastrering vs kastrering pluss dutasterid innenfor hver gruppe . Spesielt, betydelig bedring i median overlevelse formidles av dutasterid på hele LuCaP35 kohorten (fra 152 til 337 dager, HR for progresjon 2.8 [95% CI 1.4 til 4.6], p = 0,0015, figur 3A), dukket hovedsakelig på grunn av en innvirkning på svulster som var minste ( 250 mm
3) på tidspunktet for registrering (HR for progresjon 7.3 [95% CI 2,2 til 30], p 0,0015, vs. kastrering alene, figur 3B). I motsetning til den kombinasjon av kastrering pluss 8 uker dutasterid ikke statistisk innvirkning PFS i tumorer som måler 250-400 mm
3 eller 400 mm
3 ved påmelding (ikke vist); men dette kan reflektere redusert makt forbundet med post-hoc sub-klassifisering av gruppene
Kaplan-Meier plott av progresjonsfri overlevelse. (definert som tumorstørrelse 750 mm3) i alle LuCaP35 svulster behandlet med kastrering alene (Cx) vs. kastrering + dutasterid (Cx + Dut) (A), og i tumorer inkludert i behandlings når svulstene var 250 mm
3 (B). P-verdier for kurve sammenligninger ble generert ved hjelp av Mantel-Haenszel logrank test. Gjennomsnittlig tumorvolumet vekstkurver på de angitte dager etter innmelding i LuCaP35 svulster som deltok i behandlingen når svulstene var 250 mm
3 (C), mellom 250-400 mm
3 (D), og 400 mm
3 (E). Dutasterid behandling ble fortsatt i 8 uker (markert med svart strek over x-aksen) i kastrering + dutasteridgruppen.
Kontroll av tumorvolumkurver foreslo en undertrykkende effekt av dutasterid ble opprettholdt også etter seponering av terapi for svulster 250 mm
3 ved innmelding (Figur 3C). I motsetning til dette ble undertrykket tumorvekst i forhold til kastrering i tumorer 250 mm
3 ved inklusjon (figur 3D, 3E), men bare mens tumorene var under behandling. Etter seponering, tumorstørrelse i disse kohortene tatt opp til svulster behandlet med kastrasjon alene, slik som ble observert til slutt ingen forskjell i overlevelse. Starttumorvolumet var ikke assosiert med overlevelse i LuCaP96 svulster behandlet med dutasterid (ikke vist).
Systemisk androgen undertrykkelse pluss SRD5A hemming betydelig redusert svulst DHT nivåer i forhold til androgen undertrykkelse alene
For å finne ut hvorvidt den differensielle virkningen av SRD5A inhibering av tumorvekst reflekteres en forskjell i undertrykkelse av intratumorale androgener, målte vi T- og DHT-nivåer i tumorer resekterte etter behandling. I begge LuCaP35 og LuCaP96 tumortyper, mener kreft DHT nivåer målt til 3-21 dager (angitt med to spisser piler i figur 4A og 4B) var vesentlig lavere i kastrering pluss dutasterid vs kastrering alene gruppene, med verdier i LuCaP35 undertrykte fra 0,40 ± 0,56 ng /g til 0,02 ± 0,04, p = 0,007 og i LuCaP96 fra 0,10 ± 0,08 ng /g til 0,02 ± 0,01, p = 0,005 (oppsummert i tabell S1).
Tissue testosteron (T , svarte søyler) og DHT (grå søyler) ble målt ved massespektrometri i LuCaP35 (A) og LuCap96 (B) tumorer resekterte fra intakte mus (No Cx), og ut fra mus behandlet med kastrering alene (Cx) eller kastrering + dutasteride (Cx + Dut) på tidlige tidspunkter (d3-21, mens de fortsatt på terapi, angitt med tohodet piler), eller ved kastrering-resistente re-vekst (definert som 750 mm
3). P-verdier beregnet fra Welch er to utvalgs t-test (p 0,05 ble betraktet som signifikant). Enkelt Stjernene viser en statistisk signifikant forskjell i DHT nivåer mellom Cx vs. Cx + Dut behandlede prøver på d3-21 av behandlingen. Doble Stjernene viser en betydelig forskjell i DHT nivåer mellom Cx vs. Cx + Dut behandlede prøver selv etter kastrering-tilbakevendende ettervekst. Ingen andre sammenligninger mellom Cx vs. Cx + DUT behandlede gruppene var signifikant. Ekspresjon av full lengde (FL) AR og AR varianten 7 (ARV7) avkortet spleisevariant ble målt i LuCaP35 (C) og LuCaP96 (D) ved tidspunktet for tumor re-vekst til 750 mm
3. Avskrift uttrykk ble målt ved QRT-PCR og normalisert til uttrykk av husholdningsgenet RPL13A innenfor hver prøve å gi deltaet syklus terskel (dCt). Den relative forskjellen i uttrykket mellom de angitte behandlingsgruppene ble beregnet ved hjelp av deltaet dCt metoden (endring = 2∧ddCt). P-verdier beregnet fra Welch er to utvalgs t-test (p 0,05 ble betraktet som signifikant)
Interessant, mens T nivåer i LuCaP35 svulster forble undertrykt i noen av behandlingsgruppene (figur 4A, svarte striper), DHT. nivåer i LuCaP35 svulster gjentakende etter kombinasjonsbehandling (gjennomsnitt 211 dager etter seponering av dutasteride) var lik svulster tilbakevendende etter kastrering alene (0,54 ± 0,46 ng /g og 0,61 ± 0,63 ng /g, henholdsvis grå søyler). I motsetning til DHT nivåer i LuCaP 96 svulster gjentakende etter kombinasjonsbehandling (gjennomsnittlig 96 dager etter seponering av dutasteride) forble undertrykt måneder etter opphør av dutasterid (figur 4B, 0,04 ± 0,04 ng /g sammenlignet med 0,53 ± 0,46 ng /g for kastrering alene ), mens T nivåer viste signifikant rekonstituering etter enten kastrering alene eller etter å ha kombinert terapi (1,34 ± 0,89 ng /g og 0,79 ± 0,71 ng /g, henholdsvis, og Tabell S1). Av notatet, er halveringstiden av dutasteride i mus er mindre enn 2 dager, [33] som utelukker en residual effekt av SRD5A hemming på steroidkonsentrasjoner i 96 versus 35 svulster på tidspunktet for reseksjon. Tumor androgen nivåer i LuCaP35 svulster på tidspunktet for re-vekst var ikke forbundet med tumorstørrelse ved påmelding (data ikke vist).
tendens til tilberedning av DHT nivåer i LuCaP35 og av T i LuCaP96 er konsistent med den iboende variasjon i androgen metabolisme program som begunstiger DHT vs. T identifisert i de ubehandlede tumorer (figur 1E). Videre den relative uttrykk for steroidogenic gener i LuCaP35 vs. LuCaP96 svulster gjentakende etter kastrering vs kastrering pluss dutasterid var svært lik de uttrykk mønstre observert hos ubehandlede tumorer (Figur S2). Til sammen viser disse data at dutasterid effektivt hemmet DHT produksjon i begge tumortyper, og at LuCaP35 tumorvekst er utsatt for den forbedrede pre-reseptor undertrykkelse av DHT oppnådd med kombinasjonen av kastrering pluss SRD5A hemning, mens LuCaP96 er ikke.
Systemisk androgen undertrykkelse pluss SRD5A inhibering er assosiert med tumortypespesifikke forskjeller i induksjon av full lengde AR og AR spleisevarianter
kastrering motstandsdyktig prostatakreft blir ofte karakterisert ved økt ekspresjon av full-lengde AR ( AR
FL), og som nylig rapportert ved økt uttrykk av AR
sv som mangler LBD og dermed gi konstituerende ligand-uavhengig AR aktivitet. Forskjeller i AR
FL og AR
sv nivåer kan bidra til variasjon i tumorvekst responser etter pre-reseptor ligand undertrykkelse. Derfor vurderte vi uttrykk for AR
FL og utbredt AR
sv identifisert i menneskelige CRPC prøver, AR
V7 (som koder for det samme proteinet som AR
V3) i LuCaP35 og LuCaP96 svulster gjentakende etter ADT og dutasterid [13], [14], [16], [17], [34].
i forhold til svulster resected fra intakte mus, LuCaP35 svulster tilbakevendende etter kastrering eller etter kastrering pluss dutasteride vist en 2,0 ganger høyere uttrykk for AR
FL, og ingen økning i AR
V7 (figur 4C, og Tabell S3). I motsetning til dette, mens LuCaP96 tumorer periodisk etter kastrering alene viste en lik 1,9 ganger øket ekspresjon av AR
FL, de viste også en betydelig 10-gangers økning i ekspresjon av AR
V7 (figur 4D).
