Abstract
Bakgrunn
Den raskt voksende feltet av målrettet kreftbehandling ofte benytter et antistoff, noen ganger merket med en svulst -ablating materiale som radioisotop, rettet mot et bestemt molekyl.
metodikk /hovedfunnene
Denne rapporten beskriver oppdagelsen av ni nye dekapeptider som kan bli radioaktivt merket, binder seg til, og levere
32P til tykktarmskreftceller. De dekapeptider variere fra hverandre med en til tre aminosyrer og viser vesentlig forskjellige bindings egenskaper. Den mest ivrig binding dekapeptid kan permanent levere meget høye nivåer av radioisotop for å bringe adenokarsinom-cancercellelinjer ved en effektivitet 35 til 150 ganger større enn for en rekke andre celletyper, inkludert cellelinjer avledet fra andre typer kreft eller fra normalt vev.
Konklusjon /Betydning
Dette eksperimentell tilnærming representerer et nytt eksempel på en strategi, betegnes peptid binding terapi, for potensialet behandling av tykktarms og andre adenokarsinomer
Citation. Abraham JM, Sato K, Cheng Y, Paun B, Kan T, Olaru A, et al. (2007) Nye dekapeptider som Bind ivrig og levere radioisotop til Colon kreft celler. PLoS ONE 2 (10): e964. doi: 10,1371 /journal.pone.0000964
Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 11 juli 2007; Akseptert: 12. september, 2007; Publisert: 03.10.2007
Copyright: © 2007 Abraham et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 og 7R21 /R33CA106763 fra National Cancer Institute
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Sykdom og død på grunn av tykktarms og spiserørskreft utgjør en monumental helsetjenester utfordring i USA og over hele verden [1], [2]. Aktuelle behandlinger inkluderer strålebehandling, kirurgi og kjemoterapi. Det finnes en rekke immunterapier som er godkjent for anvendelse i behandlingen av forskjellige typer kreft (
f.eks, etter Herceptin, Rituxin, Avastin, og andre.) [3] – [6]. Alle disse immunterapier anvende et monoklonalt antistoff rettet mot en spesifikk cellulær molekyl [7], [8]. Destruktiv virkning mot tumorceller er antatt å involvere ADCC (antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet), cellulær lysering via komplementreaksjonsvei, eller induksjon av apoptose [9], [10]. Avastin er et monoklonalt antistoff rettet mot VEGF (vaskulær endotelial vekstfaktor) og er godkjent for behandling av tykktarmskreft [11] – [13].
I tillegg Non-Hodgkins lymfom (NHL) er for tiden behandlet med to godkjente radioimmunotherapeutic regimer: Bexxar og Zevalin. Begge benytter et monoklonalt antistoff rettet mot den B-celle-markør CD20 og kan levere enten
131I (Bexxar) eller
90Y (Zevalin) isotoper for å målrette mot lymfomceller [14], [15]. Beta-partikler (elektroner) som genereres av disse isotopene kan trenge dypt celler og skader DNA, noe som fører til celledød. Men det er ikke radioimmunotherapies godkjent for behandling av pasienter med tykk- og endetarmskreft.
De dekapeptider beskrevet her binde til og overføring isotop (
32P) til cellelinjer som er dyrket fra flere kolorektal karsinom. Under identiske eksperimentelle betingelser, meget lite (
nemlig.,
Mindre enn 1% av koloncancer-cellelinjer «priser) av den mest effektive
32P-merkede dekapeptider binder seg til cellelinjer etablert fra en rekke andre kreftformer eller til normal tykktarm, nyre, eller esophageal celler.
Resultatene
Vi har identifisert ni dekapeptider, som skiller seg fra hverandre ved hjelp av bare noen få aminosyrer, som når merket med
32P kan binde seg til et antall av kolorektale carcinom cellelinjer. Alle dekapeptider inneholde en proteinkinase A substrat sekvens og er betegnet som MAs (modifisert Adjuvant). Figur 1 er en skjematisk fremstilling av fremstillingen av
32P-merkede peptider og den eksperimentelle utforming av analyser for å måle binding av peptider til cellelinjer.
En bakterie rekombinant ekspresjon system produsert ulike gluthathione-S- transferase decapeptid-fusjonsproteiner som ble bundet til glutation og merket med
32P anvendelse av protein kinase A. etter vasking ble de merkede dekapeptider gjenvunnet etter trombin fordøyelse og inkubert ved ulike tider med flere forskjellige cellelinjer.
figur 2 viser antallet
32P tellinger per minutt (cpm) gjenværende bundet til atten forskjellige cellelinjer og tomme brønner etter en to timers inkubering med MA5, den mest effektive binding dekapeptidet (se nedenfor). Den Caco-2 colon adenokarsinom cellelinje beholdt flest radioaktive tellinger etter en to-timers inkubasjon og påfølgende vask med komplett medium, den gjennomsnittlige verdien av tredoble brønner tilsvarer 298 639 kopier per 10.000 celler. HCT116 tykktarm adenokarsinomceller beholdt en gjennomsnittlig verdi på 131 998 cpm per 10.000 celler. Tomme brønner og ikke-bindende cellelinjer som hadde gjennomsnittsverdier på mindre enn 550 cpm; barer representerer disse verdiene ikke er synlige på skalaen som brukes i Figur 2. For eksempel, HeLa S3 livmorhalskreftceller bare beholdt et gjennomsnitt på 534 kpm per 10 000, HT1080 fibrosarkom celler beholdt 367 spm, og den menneskelige embryonale nyrecellelinje 293H beholdt 429 cpm per 10.000 celler.
32P-merket dekapeptidet MA5 ble inkubert i to timer med 10.000 celler, ble vasket tre ganger, og de radioaktive tellinger i cellene bestemt ved scintillasjonstelling. Syv cellelinjer viste ivrig binding av MA5 og er vist som søylediagrammer av gjennomsnittet og ett standardavvik i tre eksemplarer brønner. De resterende elleve cellelinjer, sammen med en blank vel i gjennomsnitt bare 365 kopier. Disse verdiene er så små at de ikke være synlige på den skala som brukes i denne figuren. Ytterligere informasjon om de enkelte cellelinjer er gitt i tilleggsinformasjon.
Syv av de atten cellelinjer viste veldig sterk oppbevaring av radioaktivitet når inkuberes med MA5 (Modifisert Adjuvant radioaktivt peptid) med fem av disse er kolon adenocarcinoma cellelinjer (Caco-2, HCT15, HCT116, LoVo, HT29), ene er en øsofageal adenokarsinom-cellelinje (SEG1), og en som en Barretts øsofagus cellelinje (QHTRT). I kontrast til elleve-bindende cellelinjene var for det meste squamous cellelinjer avledet fra karsinomer i livmorhalsen (HeLa S3), tykktarm (RKO), lunge (1271, A549), spiserør (KYSE-70), en fibrosacroma (HT1080), eller celler dyrket fra normal nyre (293H), kolon (1459), eller spiserør (HEEpiC). Ikke-bindende cellelinjer inkludert T84, avledet fra et kolon adenocarcinom metastatisk til lungene, og SK-BR-3, isolert fra et bryst adenocarcinoma. Forholdet mellom cpm holdes tilbake av Caco-2 (298639) med gjennomsnittet av de elleve ikke-bindende cellelinjer (365) ble 818:1. Caco-2-celler opprettholdt ca. 18% av den totale radioaktive tellinger som er tilstede i inkubasjonsblandingen brønnen etter to timers inkubasjon.
Ni MA varianter ble undersøkt med hensyn til overholdelse av Caco-2-celler etter to timers inkubasjon. Den relative bindingsnivået og aminosyre-sammensetningen av hver MA varianten i figur 3A. Endring av bare ett til tre aminosyrer i peptid resultert i oppbevaring forskjellene så store som 70-fold,
f.eks, etter i variant MA2
vs.
Variant MA5.
(A) Ni
32P-merket forskjellige dekapeptider, varierende fra hverandre ved hjelp av kun én til tre aminosyrer, ble inkubert med Caco-2-celler i to timer, cellene ble vasket tre ganger, og tallet, men bundet til cellene er vist som en prosentandel av den totale mengden av tellinger for hver dekapeptid anvendt. Aminosyresubstitusjoner for hver variant (i forhold til MA1) er understreket og uthevet. (B) De varianter, MA1, mA4, og MA5 ble inkubert med Caco-2-celler for intervaller som varierer fra fem minutter til to timer, vasket, de adherente celler oppløst i gel lastebuffer og en alikvot kjørt på en 10% -20% gradient polyakrylamid-SDS gel. De tre baner som er merket «24» (banene 5, 10 og 15) ble inkubert med de respektive merkede dekapeptider (MA1, mA4, MA5) i to timer, vasket, og cellene ble inkubert med fullstendig medium i 24 timer. Cellene ble behandlet som beskrevet for de andre baner av dette tallet.
For å undersøke hvor raskt
32P isotopen kunne overføres fra peptid varianter og innarbeidet i cellulære proteiner, de tre mest ivrig bindende MAs (se figur 3A) ble tilsatt til brønner inneholdende replikere Caco-2-celler, deretter vasket bort ved varierende tidsintervaller og cellene og supernatanten ble analysert. Som vist i figur 3B, betydelige prosentandeler av disse
32P-merket variant dekapeptider bundet til cellene i løpet av bare noen få minutter, med store mengder av radioaktivt merkede celleproteiner som opptrer på to timer etter eksponering av celler til de merkede peptider. Spesielt, ble et parallelt eksperiment hvor betingelsene beskrevet i figur 3 dupliseres, men vaskede celler ble inkubert
over natten
i komplett medium (data ikke vist), fremdeles viste tilsvarende nivåer av
32P-dekapeptidet frigivelse og retensjon for alle ni MAs, som beskrevet for MA5 i Figur 2.
peptid binding, vasking og analyse eksperiment beskrevet for Figur 2 ble deretter gjentatt i de sju mest ivrig bindende cellelinjer ved hjelp MA5, bortsett fra at etter tre vasker av medium, ble 200 ul av fullstendig medium tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert
over natten
ved 37 ° C. Figur 4A viser cpm holdt tilbake av celler eller frigjort i mediet etter denne inkubering over natten. Omtrent 88% av MA5 radioaktive tellinger i utgangspunktet beholdes av tykktarmskreft cellelinjer ble sluppet inn i mediet, mens ca 12% av opprinnelig beholdt radioaktive tellinger ble beholdt av celler. De to esophageal cellelinjer som opprinnelig tilbakeholdte store mengder av radioaktive tellinger, QH-TRT og SEG1, beholdt 39% og 37% av deres opprinnelige tellinger, respektivt, etter inkubasjon over natten. Caco-2 celler beholdt flest teller, gjennomsnitt 58 305 kopier i tre eksemplarer brønner som inneholder 10.000 celler hver. Dette tallet representerer ca 5,8 kpm, eller 348 tellinger per time, per celle (
vil si, etter når ekstrapolert over en potensiell to-ukers eksponering, tilsvarer over 87 000 tellinger per celle).
(A)
32P-merket dekapeptidet MA5 ble inkubert i to timer med syv forskjellige cellelinjer, ble cellene vasket, og komplett medium ble tilsatt. Etter en 24 timer inkubasjon og antallet tellinger pr minutt frigis inn i mediet (R) samt det antall tellinger som forble bundet til cellene (B) ble bestemt. Hver søyle viser midlere og ett standardavvik av tre paralleller brønner. (B) Tid kurs for utgivelsen og oppbevaring av
32P-merket dekapeptid MA5. MA5 ble inkubert i to timer med Caco-2-celler, cellene vaskes, og cpm frigjort (stiplet linje), så vel som gjenværende bundne (heltrukket linje) til cellene bestemmes for tidsintervaller etter vask. Hvert punkt viser middelverdi pluss /minus ett standardavvik av triplikat-bestemmelser. C) Radioaktive vel innholdet beskrevet som bindes (heltrukket linje) på figur 4B ble kjørt på en 16,5% polyakrylamid-SDS-gel og eksponert til film. Umiddelbart etter vask (
dvs.,
På 0 timer), de fleste av tellingene ble visualisert som
32P-peptid. I løpet av de neste 48 timene, teller peptid sterkt redusert, med de fleste av bundet radioaktivitet inkorporert i cellulære proteiner. (D) Porsjoner av medium inneholdende det frigjorte (prikket linje)
32P-peptid MA5 ble analysert ved tidsintervaller etter vask, som beskrevet i figur 4B. Etter hvert mer av
32P-peptid ble utgitt, og nådde et platå med 24 timer etter vask.
4B viser tidsforløpet av utgivelsen av MA5 fra Caco-2 adenokarsinom-cellelinje i løpet av en 48-timers periode. De fleste av de totale tellinger gitt ut over 48 timers periode er utgitt av ni timers inkubering. Figurer 4C og 4D består av to autoradiogrammene som viser plasseringen av de radioaktive molekyler som er beskrevet i figur 4B på polyakrylamid-SDS-geler. Størrelsene på de cellulære radioaktive proteiner i cellene er vist i figur 4C;
32P-merket MA5 frigjort i mediet er vist i figur 4D. Det er tydelig enighet om distribusjon og radioaktivitet i å sammenligne figur 4B og figurene 4C og 4D. Så snart som to timer etter innføringen av det radioaktive peptid, vises en vesentlig del av isotopen å ha blitt overført til høymolekylære proteiner.
Diskusjoner
Denne rapporten beskriver oppdagelsen av dekapeptider det kan merkes med en høy energi (1,7 MeV) beta-emitter (
32P), og kan binde seg kraftig til flere forskjellige adenokarsinom-cellelinjer, effektivt levere dette potensialet tumor-ablating materiale til cellene. De dekapeptider, kalt MA for Modifisert Adjuvans, er protein kinase underlag. Tidligere hadde det ikke vært vist, eller mistanke om at dette substrat, når merket med en tumor-ablating materiale slik som
32P, kan binde seg til og overføre radioisotopen til en cellelinje etter en til to timers inkubasjon. Videre har vi vist for første gang at overføring av isotopen fra disse dekapeptider er begrenset til celletyper som stammer fra primær tykktarm og esophageal adenokarsinomer. For eksempel, eksponering av visse tykktarmskreftcellelinjer
(f.eks
. Caco-2) til den mest begjærlig bindingen merket peptid, MA5, for en to-timers periode resulterte i overføring av en radioaktiv dose på over 29 tellinger per minutt per celle etter en to timers inkubasjon, vaske, og umiddelbar bestemmelse av den bibeholdte radioaktivitet.
inkubasjon av
32P-merket dekapeptidet med visse cellelinjer førte til store mengder peptid blir beholdt etter en to-timers inkubasjon, men en betydelig del av denne bundne peptid ble frigjort etter en inkubasjon over natten. For eksempel, etter inkubering av det merkede variant MA5 med Caco2-celler i to timer, tre vasketrinn, og inkubering over natten i medium, 88% av den opprinnelig beholdt
32P isotop ble utgitt. Imidlertid er 12% som ble tilbakeholdt av cellene representert fremdeles 5,8 cpm per celle, ekstrapoleres til over 8300 tellinger per celle per dag. I tillegg radioaktivitet som fortsatt var tilbakeholdt av cellene etter inkubering over natten medium ble permanent inkorporert i en rekke cellulære proteiner, som demonstrert ved polyakrylamidgelelektroforese av post-eksponerings cellulære lysater
Blant 18 cellelinjer analysert for deres evne å binde dekapeptider, sju demonstrert meget høy retensjon av isotopen etter to timers inkubasjon. Selv om alle syv av disse linjene frigjort fra 63% til 88% av den radioaktivitet etter en inkubasjon over natten, mengden isotop som ble opprettholdt over natten var fremdeles betydelig. Av disse syv cellelinjer, fem ble avledet fra kolorektal adenokarsinomer, en fra en esophageal adenokarsinom, og en fra en Barretts metaplasi prøven. De 11 cellelinjer som ikke binder det radioaktivt merkede dekapeptidet MA5 var avledet fra en rekke forskjellige vev opprinnelse. Disse inkluderte squamous cell carcinoma av cervix, lunge, bryst, og en fibrosarkom, så vel som normal nyre, tykktarm, og spiserøret vev.
De fleste godkjente immunterapeutiske regimer for kreft innebære et antistoff rettet mot en spesifikk cellular molekyl [16]. Disse midler kan virke ved binding til celleoverflaten, og kan benytte ADCC, komplementaktivering, eller cellulær apoptose. Antistoffene kan også bli koblet til et tumor-ablating middel, slik som toksiner eller radioisotoper [17] – [21]. Tilsetningen av isotopen til peptider og deres anvendelse for både diagnostiske og terapeutiske formål, er et aktivt område i biomedisinsk forskning [22] – [25]. Vårt arbeid benytter protein kinase A underlag merket med
32P isotop. En høy energi beta-utslipp radioisotop resulterer i et elektron veilengde rekkevidde på opp til 5 mm, tillater vesentlig inntrengning av faste tumorer. På grunn av en forutsagt «bystander» -effekt, vil en betapartikkel trenge inn i hundrevis eller tusenvis av celler i tumoren, selv de som ikke er direkte binding dekapeptidet. Dessuten, ettersom molekylvektene for disse ørsmå dekapeptider proteinene er langt lavere enn den ekskluderende molekylvektgrense på filtrerings nyrer, disse peptidene bør bli hurtig fjernet i urinen, som fører til redusert systemisk toksisitet. Således bør det være mulig for både en radioaktiv dose og ubundet radioaktivitet som skal elimineres enkelt og på en forholdsvis kort tidsperiode. Vi regner med at andre kjente enzymsubstrater kan eventuelt bli identifisert som mulige bærere for den enkelte leveranse av anti-tumormidler til kreftceller, og at potensialet cancerterapiregimer ved anvendelse av dette peptid, eller andre tilsvarende stoffer kan være den siste strategi for peptid-binding terapi.
Materialer og metoder
Produksjon av
32P-merket dekapeptider: ulike DNA oligomerer ble klonet inn i pGEX-4T-en (GE Healthcare) som gir ulike dekapeptider etter trombin cleavage utpekt MA1 gjennom MA9 (Modifisert Adjuvant). De proteinsekvenser er: MA1, GSRRASVGSA; MA2, GSRGASVGGA; MA3, GSRRGSVGSA; MA4, GSRRGSVASA; MA5, GSRRASVASA; MA6, GSRRASVGSG; MA7, GSRGGSVGSA; MA8, GSRGGSVASA; MA9, GSRGGSVGSG. DH5-a-bakterier som inneholder disse klonene ble dyrket natten over i LB (som inneholdt 100 ug /ml ampicillin), fortynnet 1/10 i LB-Amp og dyrket ved 37 ° C i to timer. IPTG ble tilsatt til 1 mM og kulturen dyrket ved 37 ° C i fem timer. Ti ml av hver kultur ble sentrifugert og cellepelleten ble resuspendert i 1 x TBS inneholdende 100 ug /ml lysozym. Etter to sykluser med frysing og tining, ble lysatet sentrifugert, og supernatanten ble blandet med 100 ul Sepharose-glutation i to timer ved RT. Hver pellet ble vasket tre ganger med 1 X TBS, og de bundne rekombinante fusjonsproteiner ble merket med
32P ved hjelp av proteinkinase A og
32P-γ-ATP i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma, St. Louis, Mo .). . Pelleten ble vasket fire ganger med 1 X PBS og den merkede dekapeptidet ble spaltet og sluppet ut i supernatanten med trombin (GE Healthcare)
-analyse av bindingen av
32P-merkede dekapeptider til cellelinjer: celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP ble dyrket i komplett medium inneholdende 10% bovint fosterserum (varmeinaktivert). I hver brønn av en 96-brønners plate, ble 10.000 celler fra forskjellige cellelinjer dyrket over natten i fullstendig medium. Ti pl av den merkede-peptid i 1 x PBS og 90 ul av fullstendig medium ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C til forskjellige tider på opptil to timer. Peptid-mediet ble fjernet og en pl tilsatt til 100 ul gel lastebuffer og tellet ved scintillasjons-telling for kontroll-proben eller kjøre på en polyakrylamid-SDS-gel (Biorad) .De adherente celler var kort og forsiktig vasket med fullstendig medium tre ganger og noen brønner ble analysert umiddelbart etter tilsetning av 100 ul gel lastebuffer til hver brønn og kjørt på en gel eller tellet i en scintillasjonsteller. Andre brønner hadde 100 pl komplett medium tilsatt og inkubert i en ytterligere periode. Prøvene ble enten talt i en væskescintillasjonsteller eller kjøre på polyakrylamid-SDS-geler, utsatt for x-ray film, og filmen utviklet.
Takk
Vi takker Dr. Yutaka Shimada (Hyogo College of Medicine, Japan) for gaven av cellelinje KYSE-70.
