PLoS ONE: Bidrag av Multiparameter Flowcytometri immunfenotyping til diagnose Screening og klassifisering av Pediatric Cancer

Abstract

Pediatric kreft er en relativt sjelden og heterogen gruppe av hematologiske og ikke-hematologiske maligniteter som krever flere prosedyrer for sin diagnostisk screening og klassifisering. Inntil nå, flowcytometri (FC) er ikke systematisk brukt til utredning av slike kreftformer, spesielt for solide svulster. Her vurderte vi en FC panel av markører for diagnostisk screening av barn kreft og videre klassifisering av pediatriske solide tumorer. Den foreslåtte strategien tar sikte på differensialdiagnose mellom tumor

vs

. reaktive prøver, og hematologisk

vs

. ikke-hematologiske maligniteter, og underklassifikasjon av solide svulster. I alt ble 52 prøver fra 40 pasienter mistenkelige av som inneholder kreftceller analysert av FC parallelt med konvensjonelle diagnostiske prosedyrer. Den samlede samstemmighet mellom begge metoder var på 96% (50/52 diagnostiske prøver), med 100% overensstemmelse for alle reaktive /inflammatoriske og ikke-infiltrert prøvene så vel som for de tilsvarende faste tumorer (n = 35), med bare to falske negative tilfeller diagnostisert med Hodgkins lymfom og anaplastisk lymfom, henholdsvis. Videre klar diskriminering mellom prøvene infiltrert av blodkreft

vs.

Ikke-hematopoetiske tumorceller ble systematisk oppnådd. Distinkte undergrupper av solide svulster viste forskjellige protein uttrykk profiler, slik at for differensialdiagnose av neuroblastom (CD56

hi /GD2

+ /CD81

hi), primitive neuroectodermal svulster (CD271

hi /CD99

+), Wilms tumor ( en cellepopulasjon), rabdomyosakrom (

nuMYOD1

+ /

numyogenin

+), karsinom (CD45

– /EpCAM

+) , svulster bakterie celle (CD56

+ /CD45

– /NG2

+ /CD10

+) og til slutt også hemangiopericytomas (CD45

– /CD34

+). Oppsummert viser våre resultater at multiparameter FC gir raske og nyttige utfyllende data til rutine histopatologi for diagnostisk screening og klassifisering av barn kreft

Citation. Ferreira-Facio CS, Milito C, Botafogo V, Fontana M, Thiago LS, Oliveira E et al. (2013) Tilskudd av Multiparameter Flowcytometri immunfenotyping til diagnose Screening og klassifisering av Pediatric Cancer. PLoS ONE 8 (3): e55534. doi: 10,1371 /journal.pone.0055534

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

mottatt: 20 september 2012; Godkjent: 27 desember 2012; Publisert: 05.03.2013

Copyright: © 2013 Ferreira-Facio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet er delvis støttet av følgende tilskudd: EO ble delvis støttet av stipend fra CNPq- brasilianske National Research Council (Brasília, Brasil). MF ble delvis støttet av en bevilgning fra FAPERJ- Forskning støtte stiftelsen av Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Brasil) og nå hun er delvis støttet av en bevilgning fra CAPES /Ministerio da Educação (Brasília, Brasil). VB ble delvis støttet av FAPERJ- Forskning støtte stiftelsen av Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Brasil). ESC ble delvis støttet av stipend fra CNPq- brasilianske National Research Council (Brasília, Brasil) og FAPERJ- Forskning støtte stiftelsen av Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Brasil). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Mer enn 200.000 pediatriske pasienter ( 15.. år) er diagnostisert med kreft hvert år [1]. Til tross for kreft er den ledende årsak til sykdomsrelatert død hos barn i de fleste land [2], individuelle resultater i stor grad er avhengige av rask svulst diagnose, klassifisering og iscenesettelse, for adekvat behandling valg og maksimert kur priser [3]. Ettersom en betydelig del av pediatriske tumorer mangler morfologiske tegn på differensiering og histologisk opprinnelse, et batteri av immunocytokjemiske markører og in situ hybridisering, ultrastructural og molekylære diagnostiske prosedyrer, er vanligvis nødvendig for den diagnostiske klassifisering av sykdommen [3] – [7].

i flere tiår, multiparameter flowcytometri (MFC) immunfenotyping har vist seg å være avgjørende for rask diagnose, klassifisering og overvåking av behandlingen av de fleste hematologiske maligniteter, inkludert barn leukemi og lymfom. Motsatt, er det fortsatt et forskningsverktøy for pediatriske solide tumorer [8] – [15]. En slik begrenset bruk av MFC i diagnosen av pediatriske faste tumorer sannsynligvis vedrører behovet for en enkelt cellesuspensjon og tilgjengeligheten av forholdsvis begrensede paneler av pålitelige og validerte markører, blant andre faktorer [16] – [18]. Således bruk av strømningscytometri pediatriske faste tumorer er blitt nesten begrenset til vurdering av tumorcelle DNA innhold i begge parafininnstøpte og frosne vevsprøver, i kombinasjon eller ikke med samtidig farging for en eller noen få fenotypiske markører [19] – [24]. Følgelig, mens immunophenotypic studier er rutinemessig brukt i de fleste pediatriske lymfomer for differensialdiagnose mellom B- og T-celle forløper lymfoblast lymfomer og Burkitt lymfom 25-28, noen få studier har blitt rapportert så langt, der MFC systematisk anvendes i studiet av de fenotypiske egenskapene til pediatriske solide tumorer [29] – [31]. I tillegg er det rapportert noen studier har hovedsakelig fokusert på beskrivende analyser av de fargemønstre for en eller et par markører, vanligvis i en enkel diagnostisk undertype av sykdommen.

Til tross for alle de ovennevnte, preliminære studier har vist at nevroendokrine svulster vise en CD45

– /CD56

+ fenotype [32] – [35]; i sin tur, tumorceller fra neuroblastoma coexpress GD2 [35], mens primitive neuroektodermale tumorer (PNET) coexpress CD57 og CD99, samt CD56 [31], [34], [36] – [38], og rhabdomyosarkom tumorcellene myogenin

+ [31], [39] – [41]. Til tross for dette forblir spesifisiteten av disse fenotypene blant distinkte subtyper av pediatriske faste tumorer å bli etablert, og ingen studie er blitt rapportert hittil, i hvilken et omfattende panel av markører rettet mot diagnostiske screening, differensiell diagnose og klassifisering av forskjellige typer pediatriske svulster, har blitt foreslått og vurdert.

Her har vi evaluert en ny omfattende MFC panel av markører for diagnostisk screening av barn kreft og riktig tildeling av barn solide tumorer til spesifikke sykdomsenheter.

materialer og metoder

pasienter og prøver

totalt 52 prøver fra 40 pasienter mistenke av barn kreft -21 menn (52,5%) og 19 kvinner (47,5%) – ble samlet mellom november 2009 og desember 2011, i tre forskjellige sentre: Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira /Universidade Federal do Rio de Janeiro (IPPMG /UFRJ) og Hospital Servidores do Estado (HMS), begge fra Rio de Janeiro (Brasil), og Hospital de Clínicas /Universidade Federal do Paraná (HC /UFPR) i Curitiba (Brazil). Median pasientens alder var på 5 år (range: 1-14 år). De fleste prøver (48/52; 92,3%) ble analysert ved diagnose

I alle tilfeller endelig diagnose og klassifisering ble etablert basert på morfologisk og immunhistokjemisk analyser utført ved et referanselaboratorium, som følge av Verdens helseorganisasjon (WHO. ) kriteriene [42] – [44] Trettien pasienter (78%) hadde kreft, 17 av disse (55%) viste metastatisk sykdom; de resterende 9 barn (23%) hadde inflammatoriske /reaktive sykdommer. Ifølge histopatologiske /immunhistokjemiske diagnose, 11 pasienter (12 prøver) hadde nevroblastom, 3 (4 prøver) hadde rhabdomyosarkom, 2 (2 prøver) en primitiv nevroektodermal tumor (PNET), 8 (9 prøver) hadde lymfom, 2 (2 prøver) Wilms svulster, 2 (3 prøver) bakterie celle svulster, og en pasient hadde en binyrekarsinom, en en nasofaryngeal karsinom, og en en hemangioperycitoma; de andre 17 prøvene tilsvarte 9 reaktive prøver og 8 prøver fra pasienter med neoplastiske sykdommer, som ikke viste noen tumor infiltrering. Den spesifikke opprinnelsen av prøvene er beskrevet i tabell S1.

Etikk erklæringen

Studiet ble godkjent av etikkomiteen av IPPMG og HMS sykehus og prøvene ble oppnådd etter informert samtykke ble gitt av barna og deres foreldre eller foresatte, i henhold til Helsinkideklarasjonen protokollen. Foreldre /foresatte dersom deres skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien og dette skriftlig informert samtykke ble godkjent av de lokale etiske komiteer.

Utarbeidelse av vevsprøver og kroppsvæsker

Vevsprøver fri fra fett og nekrotisk vev (gjennomsnittlig vekt: 144 mg; område~~POS=HEADCOMP: 3 til 3600 mg) var samlet på kirurgisk enhet. De ble direkte evaluert av et erfarent patolog, og delt i to sammenhengende blokker. En blokk ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin og behandles rutinemessig for histopatologi, mens den andre ble plassert i kaldt (4 ° C) fosfatbufret saltvann (PBS; pH = 7,4) for videre strømningscytometrisk analyse. Den senere prøve ble veiet, lagt i en petriskål med PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA; Calbiochem, La Jolla, CA), hakket opp i små biter (2-4 mm) med et skalpellblad og mekanisk disaggregert med to sterile nåler; etterpå, ble det filtrert gjennom et sterilt FILCON sprøyte (100 um porestørrelse) for å fjerne celleklumper og rusk, sentrifugert (10 minutter ved 540 g) og resuspendert i PBS som inneholdt 1% BSA ved en sluttkonsentrasjon på 10

6 celler /ml. Etterpå prøven ble umiddelbart farget for MFC immunfenotyping. Benmarg (BM) og andre kroppsvæskeprøver ble farget enten direkte eller etter et sentrifugeringstrinn (for eksempel urin), som beskrevet nedenfor.

Multiparameter Flow Cytometry Immunophenotypic Studies

Hver prøve ble farget med følgende kombinasjoner av fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer (MAbs) – fluoresceinisotiocyanat (FITC) /fykoerytrin (PE) /PE-cyanin7 (PECy7) /peridinin klorofyll-protein Cy5.5 (PerCP-Cy5.5) /allofykocyanin (APC) /APC-Hilite7 (APC-H7) /Pacific blue (PacB) /pacific orange (Paco) – viet samtidig identifisering av kreftceller og normal /reaktiv B- og T-lymfocytter, monocytter og nøytrofile: i) cytoplasma (Cy) MPO /

CyCD79a /CD19 /CD34 /CD7 /overflatemembran (Sm) CD3 /

CyCD3 /CD45 [45]; ii) CD8-overflaten membran immunglobulin (

SmIg) λ /CD56-sIgκ /- /CD19 + CD4 /CD3 /- /CD20 /CD45 (orientering panel i tabell S2). Når det mistenkelige tumorceller ble detektert etter at portstyringsstrategi som er vist i figur 1, ble ytterligere fenotypiske karakteriseringen av slike mistenkelige tumorceller utført med forskjellige karakterisering paneler avhengig av innholdet av cellene: ikke-hematopoietiske vs B vs T vs andre hematopoetiske celler (tabell S2). Farging av celler fra faste vev eller BM, perifert blod (PB) og andre kroppsvæsker ble utført som tidligere beskrevet i detalj [46], [47]. I korthet, ble prøvene (50 ul per rør) ble inkubert i 15 min ved værelsestemperatur i mørket, i nærvær av 3-20 ul av hver av de ovenfor nevnte monoklonale antistoffer (MAb), i henhold til anbefalingene fra produsentene. Etterpå, 2 ml FACS-lysende løsning (Becton Dickinson) fortynnet 1:10 (v /v) i destillert vann ble tilsatt, og prøvene ble inkubert i ytterligere 10 minutter under de samme betingelser som de som er nevnt ovenfor, for å lyse ikke- -nucleated røde celler. Deretter ble cellene sentrifugert (5 minutter ved 540 g), og cellepelleten ble vasket to ganger med 4 ml PBS. Til slutt, ble cellene resuspendert i 0,5 ml PBS. For evaluering av cytoplasmatic (Cy), eller nukleære (NU) antigener ble cellene fiksert, umiddelbart etter at de ble inkubert med MAb rettet mot celleoverflatemembranmarkører (se ovenfor); da de ble permeabilized og farget med MAb rettet mot cytoplasmatiske og /eller kjernefysiske antigener ved hjelp av Fix Perm reagenssettet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), strengt å følge produsentens anbefalinger. For ukonjugert MAb, etter inkubering med de spesifikke MAbs, et vasketrinn etterfulgt av en andre inkubasjon trinn med et FITC-konjugert anti-mus IgG-reagens (Cytognos SL, Salamanca, Spania), ble utført (15 min) i mørket. For å bekrefte spesifisiteten av de labelings, ble en negativ kontroll med en umerket prøve systematisk parallelt. Fargede celler ble ervervet ved lav hastighet i en FACSCanto II flowcytometer -Becton /Dickinson biovitenskap (BD), San José, California, USA, – med FACSDiVa programvare (BD). Alle unntatt to prøver, ble behandlet i løpet av de første 4 timer etter operasjonen. For dataanalyse ble INFINICYT ™ programmet (Cytognos SL) anvendt. Antigen-ekspresjon ble brukt til å identifisere de forskjellige typer celler som er tilstede i prøven, og hver cellepopulasjon som er identifisert ble klassifisert som å være negative (-), svak positiv (+ lo), mellomliggende positive (+) og sterkt positiv (+ hi) ved hjelp av vilkårlige relativ lineær bety fluorescens intensitet (MFI) verdier av 10

0-10

2, 10

2-10

3, 10

3-10

4, 10

4, henholdsvis, avhengig av MFI-verdiene observert vs referanse autofluorescens nivåene funnet i kontrollrøret; antigen uttrykk for en gitt markør ble beskrevet som å være heterogene, når variable ekspresjonsnivåer ble påvist for det markør i en cellepopulasjon.

I panel A, viser et eksempel på portstyringsstrategi og bivariate dot tomt kombinasjoner anvendt for identifikasjon av tumorceller CD45-, CD45- rest stromale celler (for eksempel endotelceller og mesenquimal celler) og infiltrerende hematopoetiske celler (f.eks nøytrofiler, B- og T-celler) er vist. I sin tur, i panelene B til J den immunophenotypic profilen til CD45- tumorceller fra en neuroblastom (panelene B og H), en PNET (panelene C og I) og en rhabdomyossarcoma (panelene D og J) tumor er vist sammen med representative bilder av histophathological og immunohistokjemiske profiler av de samme tumorer farget med hematoksylin eosin plus cromogranin (neuroblastom celler i panel E), CD99 (PNET celler i panel F) og

(nu) myogenin (rhabdomyossarcoma celler i panel G).

Utelukkelse av ikke-levedyktig tumor celler var basert på deres lavere fremover (FSC) og sideveis (SSC) lys scatter funksjoner; median-cellelevedyktighet vevsprøver var på 75%. I 19/33 (57,5%) av faste vevsprøver, parallelt farging med propidiumjodid (PI, Sigma, St. Louis, MO, USA) ble utført for å evaluere celle levedyktighet, 90% av PI-farget døde celler systematisk tilsvar til hendelser som ble ekskludert som ikke-levedyktige celler i FSC /SSC gate

Histologiske og Immunohistokjemiske Analyser

Histophatological undersøkelse ble utført på hematoksylin /eosin (H E). farget vevssnitt ( 3 mikrometer). I alle prøvene der tumorinfiltrasjon ble mistenkt og /eller oppdaget, ble vevssnitt også farget av konvensjonell immunhistokjemi for CD99, atom

(NU) MYOD1,

(NU) myogenin, synaptophysin, chromogranin, NSE, LCA, CD20, CD19, Ki67 og CD10 markører. Stained lysbilder ble uavhengig vurdert av to erfarne patologer. For BM, PB og urinprøver, ble konvensjonell cytologisk analyse utført.

statistiske metoder

For å kunne etablere statistisk signifikans av forskjeller observert mellom grupper, Mann-Whitney U-test ble benyttet ( kontinuerlige variabler, SPSS program, versjon 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Antallet sann-positive (TP, prøver med nærværet av en tumorcellepopulasjon som detektert ved både konvensjonelle diagnostiske teknikker og flowcytometri), sann-negative (TN; prøver uten tumorcellepopulasjonen som målt ved konvensjonelle metoder og flowcytometri) , falske positive (FP, prøver med nærværet av en tumorcellepopulasjon ved strømningscytometri ikke oppdages av referansemetodene) og falske negative tilfeller (fn; prøver med upåvisbare tumorceller ved strømningscytometri, men positiv ved referanse metoder), ble beregnet. Sensitivitet og spesifisitet ble definert som TP /TP + FN og TN /TN + FP henholdsvis, mens den positive (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) ble beregnet som TP /TP + FP og TN /TN + FN, henholdsvis.

Resultater

Differential Diagnosis mellom reaktiv /Non-infiltrert og Tumor /infiltrert prøver

Basert på screening panel (panel 1 i tabell S2), 9/52 prøver (17 %) samsvarer reaktive prøver; en annen 8 (15%) eksempler hentet fra kreftpasienter for sykdom iscenesettelse eller overvåkingsformål, var også negativ for malignitet. Alle andre prøver (n = 35; 68%) viste infiltrasjon av tumorceller. Den totale samstemmighet mellom MFC og konvensjonell histopatologiske, immunhistokjemiske og /eller cytologiske diagnostiske prosedyrer var på 96% (50/52 prøver). I detalj, ble en 100% enighet oppnådd for de 17 reaktive /inflammatoriske og ikke-infiltrert prøver, mens en 94% samstemmighet (33/35 prøver) ble oppnådd ved MFC for infiltrert tumorprøver. De to viste prøver som ble feilsorterte av MFC samsvarer prøver infiltrert av Hodgkin lymfom celler og en anaplastisk lymfom, henholdsvis. Alle prøvene infiltrert av faste tumorer og B- eller T-celle lymfomer ble korrekt identifisert (tabell 1). Derfor ble en samlet virkningsgrad på 96% (100% spesifisitet og sensitivitet 94%) oppnådd (PPV på 100% og NPV på 90%). Den cellulære sammensetning av både reaktive /inflammatoriske og andre ikke-infiltrert prøvene er vist i tabell S3, mens fordelingen av stromale celler (inflammatorisk, endotelial og fibroblaster /mesenchymale celler) i 14/26 prøver som inneholdt ikke-hematopoietiske faste tumorer er vist i tabell S4.

Identifikasjon av lymfom

Versus

Non-blodkreft tumorceller

i alt 35 prøver (fra 31 pasienter) inneholdt kreftceller basert på screening panel (panel 1 i Tabell S2) og karakterisering paneler (paneler 2 til 5 i tabell S2). Fra dem, 9 tilsvarte maligne hematopoetiske celler og 26 til ikke-hematopoietiske faste tumorer. I de to falske negative Lymfekreft tilfeller, ble en rik polyklonale lymfocytt infiltrere observert av MFC, uten et klart definert tumorcelle befolkning. I sin tur, kunne alle B-celle lymfom tilfeller (5/5) lett kan skilles fra pediatriske solide tumorer med screening panel 1 (tabell S2) av uttrykket av B-cellemarkører (CD19

+, cyCD79a

+ , CD22

+) i forbindelse med CD45

+ lo eller CD45

+, mens disse markørene var systematisk fraværende i alle 26 pediatriske solide tumorer. Med B-celle-karakterisering panel (panel 3 i Tabell S2) i tre B-celle lymfom prøvene viste overflatemembran

(Sm) Ig-lettkjede-restriksjons (2 tilfeller

SmIgλ

+ og en

SmIgκ

+) sammen med en TDT

+, CD20

+ hi, CD38

+ hi, CD10

+ hi, cyBcl2

– immunfenotypen som er svært karakteristisk for barndommen Burkitt lymfom, bortsett TdT uttrykk. De andre to B-celle svulster presentert med en CD45

+ lo, CD19

+, CD20

-, CD22

+, CD10

-, CD38

+, CD58

+, CD81

+, CD9

+

SmIg

CyIgμ

– fenotype kompatibel med B-celle forløper akutt lymfatisk lymfom (BCP-ALL) av både MFC og histopatologi. I sin tur kan 2 T-cellelymfom prøvene være lett skilles fra både barn solide tumorer og B-cellelymfom med screening panel (panel 1 i tabell S2) basert på deres CD45

+ lo,

SmCD3

+ lo og

CyCD3

+ fenotype; i tillegg er disse cellene viste også en CD4

+, CD8

-, CD1a

+, CD99

+, CD2

+, CD5

+, CD27

+, CD71

+ og CD81

+ fenotypisk profil, mangler CD7

-, CD117

– og B-celle markører når de passende screening og karakterisering paneler (paneler 1 og 4 i tabell S2, henholdsvis) ble anvendes. Alle de 26 ikke-hematopoietiske faste tumorer som ble analysert, var negative for alle B- og T-celle-spesifikke antigener undersøkt med screening panel (panel 1 i Tabell S2), og de var CD45

-. Tjueto av disse senere tilfeller (84%) uttrykte CD56

+, sammen med variable mønstre for ekspresjon av andre markører assosiert med forskjellige ikke-hematopoietiske vev som var inkludert i den karakteriser panel for faste tumorer (panel 2 Tabell S2) som beskrevet nedenfor

Immunophenotypic Karakterisering av ikke-Hematopoietic tumorceller

Nesten halvparten av de ikke-hematopoietiske tumorer samsvarer med neuroblastom. (12/26; 46%). De viste en ensartet befolkning på CD45

-, CD56

+, CD9

+, CD81

hei, GD2

+ kreftceller med heterogene uttrykk for CD57

– /+ og CD58

+ /++; CD90 var positive i alle bortsett fra en tumor, mens CD271 ble delvis uttrykt i bare en tumor (Tabell 2). Interessant, den eneste ganglioneuroblastoma tumor analysert viste to tydelig forskjellige populasjoner av kreftceller: 39% hadde en immunfenotypen identisk med den for de andre neuroblastomer, mens de gjenværende celler (61%) som vises høyere lysspredning (FSC og SSC) og økt ekspresjon av CD56, CD81 og CD57. Ingen av de andre markører som ble testet (f.eks CD99, CD38, CD19, CD20,

CyCD79a, CD34,

numyogenin,

nuMYOD1) ble uttrykt av neuroblastom celler. Fra alle tumorer, neuroblastom var den eneste GD2

+ hi neoplasi, samtidig som det viste også høyere CD56 nivåer per celle (tabell 2, figur 1 og 2). Selv PNET svulster viste en fenotype som lignet som neuroblastom (CD45

-, CD56

hei, CD90

+, CD9

+, CD81

+

nuMYOD1

– ,

numyogenin

– i fravær av B-, T- og myeloide-assosierte markører), de var negative for GD2, med unntak av en med lav ekspresjon i en liten tumor befolkning 48%, og hadde en sterkere ekspresjon av CD99

hei og CD271

hi (tabell 2, figur 1 og 2)

Panel A:. Heat kartet oppsummering av intensitet og mønster av uttrykk for ulike markører i forskjellige diagnostiske undergrupper av barn solide tumorer basert på gjennomsnittlig fluorescerende intensitet per /cellenivå. Panel B: Sammenligning av den midlere fluorescensintensitet ekspresjonen av individuelle markører pr /celle i ulike WHO-undertyper av pediatriske solide tumorer. Bokser strekker seg fra 25. til 75-percentil, linjene i midten representerer medianverdier mens horisontale linjer tilsvarer 95% konfidensintervall.

Bilder

Basert på de samme screening og karakterisering paneler (paneler 1 og 2 i tabell S2, henholdsvis), alle fire rhabdomyosarcomas (RMS) viste en spesifikk

nuMYOD1

hei,

numyogenin

hi fenotype. Videre RMS tilfellene var også CD45

-, CD56

+ lo, CD90

+ og CD57

-; to uttrykte CD81

+, CD9

+ og CD58

+ og en var delvis positiv for CD99 (40% av tumorceller), en fenotypisk mønster som var spesifikk for tumor-undertype (tabell 2; Fig 1 og 2)

De resterende 8 tumorprøver samsvarer med 5 forskjellige kreft undergrupper (Wilms tumor, 2 tilfeller;. bakterie celle tumor, 3, binyrekarsinom, nasofaryngeal karsinom og hemangiopericytoma, ett tilfelle hver). Sterk EpCAM uttrykk var begrenset til de to karsinomer, mens hemangiopericytoma celler var den eneste som viser CD34

+ hi uttrykk; begge grupper av tumorer systematisk manglet CD45, B- og T-celle markører (tabell 2; figur 1 og 2). I sin tur, alle bakterie celle svulster presentert med en distinkt CD45

-, CD56

+, CD10

+, CD38

-, CD19

-, CD22

-, NG2

+ fenotype, med unntak av CD10 og NG2 som var negative i 1/3 tilfeller (tabell 2 og figur 2). Motsatt, de to Wilms svulster viste to klart atskilte (sykdoms) svulst celle populasjoner med en felles CD56

+ og CD58

+, CD45

-, CD99

-, GD2

nuMYOD1

-,

numyogenin

-, CD10

– og NG2

– fenotype, men tydelig reaktivitet (negativ versus positiv uttrykk) for CD90, EpCAM og CD57 (tabell 2; Tall 1 og 2).

Totalt disse resultatene viser at distinkte pediatriske kreft subtyper var assosiert med unike og spesielle fenotyper.

NuMYOD1 og

numyogenin uttrykk var begrenset til RMS (figur 1 J, Figure2), CD99 ble uttrykt på et betydelig høyere nivå i PNET og en undergruppe (embryonale) RMS (Figur 1I, figur 2), mens sterk reaktivitet for GD2 ble bestemt for neuroblastoma (figur 1 H, figur 2), og en CD34

hi CD45

– fenotype var begrenset til den hemangiopericytoma tilfelle studert (figur 2). Andre mindre spesifikke markører som CD56, CD9, CD57, CD81, CD99 bidro også til noen differensialdiagnoser, f.eks skillet mellom neuroblastom og RMS (CD56, CD57, CD81) og mellom PNET og begge RMS (CD9) og neuroblastom (CD99, CD56, CD81 og CD57) (Figur 1I-J, figur 2)

Diskusjon.

Pediatric kreft stammer hovedsakelig fra tidlig lymfoide forløpere og embryonale mesenchymale og neuroectodermal forløpere, som kan vise tilsvarende morfologiske og histopatologiske mønstre [3], [5] – [7]. Følgelig er diagnose av et pediatriske tumorer krever ofte ytterligere karakterisering av de neoplastiske celler på f.eks immunophenotypical /immunocytokjemiske begrunnelse. I sin tur, er rask diagnostisering av slike tilfeller avgjørende, siden det direkte påvirker behandlingen beslutningsprosessen og pasient utfall [2], [3]. Derfor tilgjengeligheten av raske teknikker for å nettopp screene for tumorcelle avstamning og etablere relevante differensialdiagnoser, er stort sett velkommen.

Til nå få studier har blitt rapportert som vurdere nytten av MFC immunfenotyping for diagnostisk screening og underklassifikasjon av pediatriske faste tumorer [11] – [13], [27] – [28], [31], [35] – [39], [41], [48] – [51] Bemerkelsesverdig, et forholdsvis lavt (59%) samstemmighet mellom immunfenotyping av fin-nål aspirasjon eksemplarer av flow-cytometri og konvensjonelle cytologiske analyser har blitt rapportert, på grunn av lav prøven cellularity [36]. Interessant, her fikk vi nok levedyktige celler i hver prøve analysert ved hjelp av mekaniske Disaggregering prosedyrer for ferskt innhentet og bearbeidet prøver, støtter forestillingen om at mekanisk disaggregation holder antigen uttrykk sammen med en akseptabel celleviabilitet [16] – [18], [52 ].

av notatet, ingen av prøvene klassifisert som reaktiv /inflammatorisk av cytologiske /histopatological kriterier ble feildiagnostisert som kreft ved MFC. I sin tur, alle vevsprøver, men to ganske uvanlig lymfom prøver, ble identifisert som inneholder svulsten ved MFC. De to falske negative tilfeller observert kan skyldes mangelen på spesifikke markører for Reed-Stenberg og anaplastiske lymfomceller (f.eks CD30) i vår screening panel (panel 1 i Tabell S2) og forholdsvis lav frekvens og /eller levedyktigheten til disse cellene i en enkelt cellesuspensjon. Prospective inkludering av flere markører (f.eks CD30) i screening panel for identifisering av disse cellene kan potensielt overvinne denne begrensningen [53], [54].

Hos barn, MFC er i hovedsak brukt til studiet av PB og BM prøver fra pasienter mistenke for lider av akutt leukemi. Til tross for dette tidlige studier i neuroblastom pasientene viste allerede BM infiltrasjon av CD45

– /CD56

+ tumorceller, i fravær av proteiner betegner hematopoetiske engasjement [29], [33]. På grunn av den relativt høye frekvensen av metastatisk BM engasjement i neuroblastom, er dette langt den ikke-blodkreft hos barn svulst hovedsakelig studert av MFC. Faktisk har fenotypen av neuroblastom-celler vært tilbakevendende undersøkt i enkle eller flerfarget (3- eller 4-farge) antistoff-kombinasjoner både i BM og tumor vevsprøver [35], [48] – [51], [55]. Men, de fleste av disse studiene tar sikte på å vurdere minimal restsykdom nivåer i BM av neuroblastom pasienter, uten å utforske nytten av immunfenotyping for diagnostisk screening og differensialdiagnose av neuroblastom

vs

. Andre pediatriske svulster, som ferdig her

Fra alle markører evaluert så langt i pediatriske solide tumorer, CD56 (NCAM) er oftest undersøkt [31] -. [34]. Interessant er CD56 uttrykkes ved de fleste barn solide svulster [37] – [39], [51], som også finnes i våre saker. Imidlertid er mengden CD56 ekspresjon i stor grad varierte mellom forskjellige tumor subtyper. Neuroblastom og PNET var de svulster som viste de høyeste CD56 nivåene, støtte nytten av CD56 både å diskriminere ikke-blodkreft vs. blodkreft svulster [31], [34], og for differensialdiagnose mellom ulike undergrupper av CD45

– non-blodkreft pediatriske solide tumorer. Tilsvarende har flere studier evaluert nytten av CD81 og CD9 (sammen med CD45

– og CD56

+), for diskriminering mellom neuroblastom celler og BM hematopoetiske celler, for staging formål [13], [48] – [49], [55], uten å strekke seg slik analyse til andre undertyper av pediatriske solide tumorer. Blant våre saker, CD81 og CD9 viste en variabel og heterogen mønster av uttrykk med begrenset nytte som individuelle markører, som differensialdiagnose mellom neuroblastom og andre pediatriske svulster. Imidlertid, når kombinert med andre molekyler, CD81 bidratt til diskriminering av neuroblastom og PNET. Til tross for dette, GD2 og CD271 var de to mest nyttige markører for å skille mellom neuroblastom (GD2

+ hi CD271

– /lo) og PNET (GD2

– /lo CD271

+ hi). Samlet disse resultatene støtter forestillingen om at CD271

hi uttrykk identifisert på PNET kan være forbundet med mesenchymale stamceller opprinnelsen til disse svulstene [56]. Interessant, i den eneste neuroblastom pasienten som viste CD271

– /+ lo tumorceller, CD271 ekspresjon var begrenset til den primære tumor, mens negativ i metastatiske BM celler; Dette kan potensielt være på grunn av en annen grad av tumorcellemodning i begge områder, fravær av CD271 er assosiert med en mer umodne og aggressiv oppførsel tumor [57] – [58]. Av notatet, CD99 ble også høyt uttrykt i PNET, mens typisk negativ i de andre svulster, noe som tyder på at i tillegg til CD271, kan CD99 også bidra til diagnostisering av PNET.

Få MFC immunophenotypic studier av RMS har blitt rapportert så langt. I tråd med våre observasjoner slike studier viste at RMS celler vanligvis vise en CD45

-, CD56

+, CD90

+

numyogenin

+ fenotype med variabel uttrykk for CD57, desmin, vimentin og CD99 [31], [36], [39], [41].

Legg att eit svar