Abstract
lavmolekylære inhibitorer mot protein geranylgeranyltransferase-I som P61A6 har blitt vist å hemme spredning av en rekke forskjellige humane kreftceller og oppviser antitumoraktivitet i musemodeller. Utvikling av disse hemmere kan bli dramatisk akselerert ved overdragelse svulst målretting og kontrollert frigjøring evne. Som et første skritt på veien mot dette målet, har vi innkapslet P61A6 inn i en ny type liposomer som kan åpnes og slipper laster bare under lav pH tilstand. Disse lave pH-frigivelse typen liposomer ble fremstilt ved å justere forholdet av to typer av fosfolipid-derivater. Lasting av geranylgeranyltransferase-I-inhibitor (GGTI) generert liposomer med gjennomsnittlig diameter på 50-100 nm. GGTI frigivelse i oppløsning var sterkt avhengig av pH-verdier, viser bare frigivelse ved pH lavere enn 6. Frigjøring av last i en pH-avhengig måte inne i cellen ble demonstrert ved anvendelse av en protonpumpeinhibitor bafilomycin A1 at økt lysosomale pH og hemmet frigjøring av et fargestoff som føres i pH-liposom. Levering av GGTI til humane kreft i bukspyttkjertelen celler ble demonstrert ved hemming av protein geranylgeranylation inne i cellen, og denne effekten ble blokkert av bafilomycin A1. I tillegg GGTI levert av pH-liposomer indusert proliferasjon hemning, G1 cellesyklus-stans som er assosiert med ekspresjonen av cellesyklusen regulator p21
CIP1 /WAF1. Proliferasjon hemming ble også observert med forskjellige lungecancercellelinjer. Tilgjengelighet av nanoformulated GGTI åpner opp muligheten til å kombinere med andre typer hemmere. For å demonstrere dette punktet, kombinert vi liposomal-GGTI med famesyltransferaseinhibitoren (FTI) for å hemme K-Ras signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre resultater viser at det aktiverte K-Ras signalering i disse celler kan være effektivt hemmet og den synergistiske virkning av de to legemidlene blir observert. Våre resultater tyder på en ny retning i bruken av GGTI for kreftbehandling
Citation. Lu J, Yoshimura K, Goto K, Lee C, Hamura K, Kwon O et al. (2015) Nanoformulation av Geranylgeranyltransferase-I hemmere for Cancer Therapy: Liposomalt Innkapsling og pH-avhengig Levering til kreftceller. PLoS ONE 10 (9): e0137595. doi: 10,1371 /journal.pone.0137595
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 23 april 2015; Godkjent: 18 august 2015; Publisert: 09.09.2015
Copyright: © 2015 Lu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH gi CA41996 (FT) og R01GM071779 og P41GM081282 (til OK), https://grants.nih.gov/grants/giwelcome.htm. En del av det arbeidet som er utført i denne artikkelen ble støttet av en sponset forskningsavtale med NOF, Inc (FT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. NOF Corporation gitt støtte i form av lønn for forfattere [Kohei Yoshimura og Ken Hamura ]. Deres bidrag til studiet er definert i avsnittet Forfatter bidrag. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
En klasse av kreft narkotika ment å hemme membran sammenslutning av signalanlegg proteiner har blitt utviklet gjennom årene . GGTI (geranylgeranyltransferase-I-hemmer) eksemplifiserer denne type kreft narkotika [1-3]. GGTI hemmer protein geranylgeranyltransferase I (GGTase-I), et enzym som gir en C20 geranylgeranyl gruppe til proteiner som RhoA, RhoC, Rap1 og Ral ved cystein i den karboksy-terminale tetrapeptid konsensussekvensen CaAl (C er cystein, er A en alifatisk aminosyre, og den C-terminale rest er leucin eller fenylalanin). Karakterisering av mus med betinget knockout av GGTase-I viste at GGTase-I-mangel resulterer i hemming av onkogene K-ras-indusert lungetumordannelse og dramatisk øker overlevelse av mus [4]. GGTase-I hemming fører hemming spredning forbundet med G1 arrest og akkumulering av cellesyklus regulatorer som p21
CIP1 /WAF1, og peker på viktigheten av GGTase-I i celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon [5-7].
etter screening en kjemisk forbindelse bibliotek konstruert av fosfin katalyse av allenoate forbindelser, vi tidligere identifisert flere GGTase-i-inhibitor (GGTI) forbindelser som blokkerer proteinet modifikasjon og hemmer membran foreningen og funksjon av Ral, Rho, og Rap underfamilien proteiner [8,9]. Disse forbindelser inhiberer GGTase-I ved å konkurrere med dets substrat-proteiner. Cell aktive forbindelser P61A6 og P61E7 forårsaket cellesyklus arrest og undertrykte veksten av humane kreftcellelinjer inkludert kreft i bukspyttkjertelen og ikke-småcellet lungekreft [10,11]. Effekt av GGTI P61A6 for å hemme tumorvekst ble demonstrert ved anvendelse av human kreft i bukspyttkjertelen xenotransplantat [10]. I dette eksperimentet, ble signifikant inhibering av tumorvekst observert med lite bivirkninger som bedømt ved nyre- og leverenzym profiler og ved hematologisk karakterisering. Inhibering av geranylgeranylation i tumoren ble demonstrert. En tilsvarende inhibering av tumorvekst ble observert ved anvendelse av lungekreft transplantater i mus [11].
En hovedutfordring for videre GGTI utvikling er å konferere tumor målretting evnen til disse forbindelsene. Selv om det er mulig å bruke lave mengder av GGTI å minimalisere potensielle bivirkninger, muligheten for at det er dosebegrensende toksisiteten av dette GGTI forbindelsen kan ikke utelukkes, ettersom GGTase-I er et enzym som virker også i normale celler. Derfor er det viktig å utvikle en ny generasjon av nano-formulert GGTI som fortrinnsvis leverer GGTI forbindelsen til tumorer. Dette ville gjøre det mulig tumor målretting redusere uønsket fordeling til andre deler av kroppen, og således unngå eventuelle effekter på normale vev.
A dramatisk forhånd i nanoteknologi har ført til utviklingen av en rekke medikamentavleveringssystemer, inkludert liposomer polymer miceller, virus og mesoporous silika nanopartikler [12-25]. Disse nanopartikler kan levere medikamentet til tumoren ved forbedret permeabilitet og retensjonseffekten [13], så vel som ved anvendelse av ligander som er rettet mot reseptorer på kreftceller, og dermed unngår uønsket systemisk chemotoxicity. Blant dem, liposomer har fordelaktige egenskaper som inkluderer effektiv innkapsling, relativt enkel tilberedning, nedbrytbarhet og biokompatibilitet [26-31]. I tillegg er det fosfolipid bilaget strukturen av liposomer egnet for å lage bio-relaterte funksjoner som membran destabilisering og /eller membranfusjon, fremme cellulær internalisering av membran-impermeable molekyler på tvers av cellulære membraner inn i cellene.
I tillegg til tumor målretting, er det viktig å oppnå kontrollert frigivelse, slik som anticancer legemidler slippes selektivt i tumoren. Nylig, tilnærminger for å syntetisere en ny type av liposomer med lav pH-utløserfunksjon er blitt rapportert [32,33]. Fordi intracellulær lysosomal pH er lav, og også fordi svulsten mikromiljøet har lav pH på grunn av hypoksiske forhold [34-36], gir denne funksjonen en fordel at stoffet utgivelsen er mer begrenset til kreftceller.
I denne utredningen, vi rapporterer utarbeidelse av liposomer som effektivt innkapsler bioteknologiske legemidler og fargestoffer og frigjør lasten når de støter på lave pH-forhold. GGTI P61A6 ble effektivt innkapslet i de pH-følsomme liposomer og ble levert til humane kreftceller. Hemming av protein geranylgeranylation samt hemming spredning, cellesykluseffekter og akkumulering av cellesyklusen inhibitor p21
CIP1 /WAF1 ble observert ved levering av GGTI av pH-følsomme liposomer. Vi utvider ytterligere bruk av liposomal GGTI for kreftbehandling ved å vise at liposomal-GGTI kan kombineres med famesyltransferaseinhibitoren (FTI) for å hemme K-Ras signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og Metoder
Material
A GGTI forbindelse P61A6 anvendt for denne undersøkelsen var avledet fra det allenoate-avledet forbindelsen bibliotek, som beskrevet i våre tidligere publikasjoner [9-11]. 20 mM stamløsning av GGTI P61A6 i DMSO ble holdt ved -20 ° C inntil bruk. FTI sammensatte BMS225975 ble beskrevet tidligere [37]. Denne forbindelse hemmer protein famesyltransferase spesifikt med lite hemming av protein geranylgeranyltransferase I og RabGGTase. COATSOME
® MC-6081 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glysero-fosfokolin (POPC)), Sunbright
® DSPE-PG8MG (kondensasjonsproduktet av N- (octaglycerol-glutaryl) distearoylphosphatidylethanolamine med 3- methylglutaric syre (DSPE-PG8MG)), ble levert av NOF CORPORATION (Tokyo, Japan). 1, 2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamin rhodamin B sulfonyl) (ammoniumsalt) (rhodamin-PE) ble anskaffet fra Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA).
design og klargjøring av lav pH-sensitive liposomer
pH-følsomme tomme liposomer ble fremstilt fra POPC og DSPE-PG8MG. Typiske fremgangsmåter er beskrevet nedenfor. POPC og DSPE-PG8MG (molforhold, 85:15) ble løst opp i en kloroform-metanol-blanding, og løsningsmidlet ble fjernet i en rotasjonsfordamper. Lipidblandingen ble vakuumtørket, og hydrert med en vandig oppløsning (10 ml) inneholdende sukrose som kryobeskyttende middel. Etter ekstrudering av liposom-suspensjonen gjennom membran (porestørrelse 0.22μm), den oppnådde suspensjonen ble frysetørket for å gi de pH-følsomme tomme liposomer [38].
Rhodamine fluorescens-merking av liposomer
rhodaminmerkede pH-følsomme tomme liposomer ble fremstilt fra POPC, DSPE-PG8MG, og rhodamin-PE (molforhold; 85: 15: 0,1). POPC og DSPE-PG8MG ble løst opp i en kloroform-metanolblanding. Rhodamin-PE ble løst opp i kloroform og tilsatt til lipider løsning, og løsningsmidlet ble fjernet i en rotasjonsfordamper. Lipidblandingen ble vakuumtørket, hydratisert med fosfatbufferløsning inneholdende sukrose. Etter ekstrudering av liposom-suspensjonen gjennom membran (porestørrelse 0.22μm), den oppnådde suspensjonen ble frysetørket for å gi de fluorescerende fargestoffmerkede pH-følsomme tomme liposomer.
Rhodamine-merket liposom-pulver ble rekonstituert i PBS -buffer ved 10 ug /ml, sonikert i sonikator (vannbad type) i 10 min, og tilsatt til MiaPaCa-2-celler som ble dyrket i 8 brønner glasscelle kammer i 4 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS-buffer og inkubert med 50 nM LysoTracker grønn, etterfulgt av inkubering i cellekultur kammeret i ytterligere 1 time før observerer med fluorescerende mikroskop.
stoffbelastede Liposome Fremstilling
En liten alikvot (130 pl) av oppløst GGTI (1,2 mg) i 75% EtOH med 10% DMSO (endelig konsentrasjon = 6,41 mg /ml), fortynnet i dH
2O til 10%, ble blandet med 1,3 mg tørt pulver av liposomer, og blandingen ble rotert ved 4 ° C i 4 timer etterfulgt av ultralydbehandling i 2 minutter ved bruk av en vann-bad-sonikator typen. Liposomsuspensjonen ble ekstrudert gjennom en polykarbonatmembran med en porestørrelse på 100 nm. På samme tid, ble 6 ml Sepharose 4B gel blandet med 2 ml PBS på is og ble tilført til 10 ml kolonne, pakket med en hastighet på 15 cm /time. Og deretter blanding av liposomet og GGTI ble anbragt på toppen av gelen i kolonnen. Etter å la prøven for å gå inn i harpiksen, ble kolonnen straks fylt med kald PBS-buffer, og pumping ble startet med en hastighet på 15 cm /time for å fjerne frie legemidler som ikke har blitt lastet inn i liposomer fra de medikamentinneholdende liposomer [32] . Elueringsmidlene ble oppsamlet og fraksjonene inneholdende liposomer ble identifisert ved deres turbiditet. Prøven ble holdt ved 4 ° C for videre forsøk.
Narkotika- og Dye versjonen fra liposomer
Offentliggjøring av legemidler fra liposom ble målt med væskekromatografi (HPLC). 400 ul av liposomer som innkapsler GGTI (oppsamlet fra Sepharose kolonne) ble blandet med 150 mM NaCl, sentrifugert ved 100.000 rpm i 10 min, 4 ° C, for å felle ut liposomal GGTIs. Bunnfallet ble resuspendert i 400 ul PBS. 73 ul av resuspenderte oppløsning ble tilsatt til 927 pl PBS-buffer med forskjellige pH-verdier, og deretter blandet ved 37 ° C i 15 min. Triton X-100 ble anvendt som 100% kontroll fordi Triton X-100 kan bryte ned liposomer (sluttkonsentrasjon: 0,1%). Blandingene ble tilsatt til de indre rør av ultrafilter Amicon ultra-4 (MWCO = 10 kDa, Millipore), sentrifugert ved 13000 g i 10 min ved romtemperatur. Eluatene ble utsatt for HPLC for å måle konsentrasjonen av frigjort GGTI (Waters Micromass LCT Premier massespektrometer). Frigjøring av fluorescerende fargestoff Pyranine ble utført som beskrevet tidligere [32]. En liten alikvot (500 pl) av 35 mM pyranine, 50 mM DPX (p-xylen-bis-pyridinium-bromid), og 25 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,4) ble blandet med 7 mg av liposomer, og blandingen ble sonikert i 2 min ved hjelp av et vannbad sonikator. Pyranine fluorescens ble stoppet ved DPX innsiden av liposomer, men vil avgi intens fluorescens etter å ha blitt frigjort fra liposom. Liposomer som innkapsler pyranine og DPX ble tilsatt til 25 mM fosfat og 125 mM NaCl-buffer med forskjellige pH-verdier og fluorescens-intensitet (512 nm) ble målt med et spektrofluorometer (416 nm, Jasco FP-6500). Den prosentvise frigjøring av pyranine fra liposomer ble definert som Slipp (%) = (Ft-Fi) /(Ff-Fi) x 100 hvor Fi og Ft bety de innledende og mellomstasjonen fluorescensintensiteter, respektivt.
Cell Culture
Den humane brystkreftcellelinje MCF-7, bukspyttkjertelkreft cellelinje: ff er den fluorescerende intensitet etter tilsetning av Triton X-100 (0,1% sluttkonsentrasjon). MiaPaCa2, ikke-småcellet lungecancer cellelinje H596, H358, A549 og en normal human bronkial epitel cellelinje BEAS-2B ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Alle kreftcellelinjer ble holdt i DMEM eller RPMI supplert med 10% FCS (Sigma), 2% L-glutamin, 1% penicillin og streptomycin 1%. BEAS-2B-celler ble dyrket med BEBM media tilsatt med spesielle vekstfaktorer (Lonza /Clonetics Co.). Mediet ble rutinemessig skiftes hver 3. dag, og cellene ble separert ved trypsinering før de nådde konfluens.
Levering av fargestoffer til kreftceller
Doksorubicin levering ble undersøkt som følger. Etter sentrifugering gjennom en Sepharose 4B kolonne for å fjerne frie legemidler, ble en homogen suspensjon av doksorubicin-liposomer lastet tilsatt til brystcancer MCF-7-celler som var dyrket i en åtte godt glasskammer. 6 timer etter inkubering ble cellene vasket og undersøkt med fluorescens mikroskopi av bildet fordelingen av doxorubicin i kreftceller. De pyranine belastede liposomer ble fremstilt som beskrevet ovenfor. MiaPaCa-2 celler (3 × 10
5 celler) ble dyrket i over natten i en 8 brønner glass cellekultur kammer. Liposom-suspensjoner ble tilsatt til cellene og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Etter inkuberingen ble cellene vasket med PBS to ganger og observert med et fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss). Bafilomycin behandling ble utført med 160 nM bafilomycin A1 i 6 timer før tilsetningen av liposomer. Acridine Orange (Sigma) farging ble utført ved 6 mikrometer konsentrasjon.
Proliferation hemningsmetoden
sprednings hemming analysen ble utført ved hjelp av en celle-telling kit fra Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kreftceller ble sådd ut i 96-brønners plater (5000 celler vel
-1) og inkubert i friskt kulturmedium ved 37 ° C i en 5% CO
2/95% luftatmosfære i 24 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS og ble mediet forandret til et friskt medium inneholdende GGTI belastede liposomer eller tomme liposomer med samme volum i buffer som kontroll ved de angitte konsentrasjoner. Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS for å fjerne liposomer som ikke ble tatt opp av cellene, og cellene ble deretter inkubert i friskt medium i ytterligere 48 timer. Cellene ble vasket med PBS og inkubert i DMEM med 10% WST-8-løsning i ytterligere 2 timer. Absorbansen for hver brønn ble målt ved 450 nm med en plateleser. Siden absorbansen er proporsjonal med antallet levedyktige celler i mediet, ble det levedyktige celletall bestemt ved å bruke en tidligere fremstilt kalibreringskurve (Dojindo Co.).
Western Blot analyse
Celler ble behandlet med GGTI-liposomer, tomme liposomer, eller GGTI i 24 timer, høstet, og lysert i lyseringsbuffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl ved pH 7,5, 1 mM EDTA, og 1 × proteasehemmer blanding). Proteiner ble separert ved gel-elektroforese på en SDS-polyakrylamidgel og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 5% (vekt /volum) skummet melk. Etter vasking med TBS som inneholdt 0,1% Tween 20 (Sigma), ble membranene inkubert over natten med det første antistoff (mot unprenylated form av rapi, Santa Cruz Biotechnology, California) fortynnet med TBS. Etter vasking ble membranene inkubert i 2 timer med det andre antistoff (Santa Cruz Biotechnology, California). Bånd ble detektert med et ECL system (Amersham Pharmacia Biotech K.K., UK). Fosforylering av ERK ble testet ved anvendelse av et antistoff mot phorphorylated form av ERK, så vel som mot total ERK (Cell Signaling, CA). Anti-aktin antistoff ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (CA).
Statistisk analyse
Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske sammenligninger ble gjort ved hjelp av Students t-test etter analyse av varians. Resultatene ble vurdert å være vesentlig forskjellig på P-verdi 0,05, som er merket med *.
Resultater
Design og klargjøring av lav pH-sensitive liposomer (pH-liposomer)
Våre pH-liposomer er stabile ved fysiologisk pH, men bli destabilisert under sure betingelser på grunn av protonering, og derfor svarer til lave pH-miljøer av endosomet-lysosomer inne i celler [32]. Liposomene ble fremstilt ved å anvende to forskjellige lipider, DSPE-PG8MG og POPC. En generell ordning av DSPE-PG8MG er vist i figur 1. Dette molekylet inneholder et fosfolipid som er knyttet til karboksylert polyglycerin gruppe (PG kjeden). Under sure betingelser, er PG-kjeden protonerte resulterer i destabilisering av liposomale membranene forårsake sammensmelting med endosomale membraner. Innholdet av liposomer vil da bli frigjort i cytosol. Ved å endre forholdet mellom de to lipider, er det mulig å lage liposomer som reagerer på forskjellige pH-verdier. Her blir polyglycerin modifisert med 3-metyl-glutarsyre kjent for å ha en pKa-verdi på 6,3 [39,40]. Derfor har DSPE-PG8MG en lignende pKa verdien av polyglycerin derivat, og vil ha en pH-respons nær pH 6. I vårt tilfelle ønsket vi å oppnå innhold utgivelsen ved pH under 6, men lite utslipp over pH 6. Dermed ble bestemt for å finne en passende lipidsammensetningen i lignende fremgangsmåte. Kort sagt ble dispersjoner av pH-liposomer som innkapslede pyranine fargestoff tilsatt til løsninger ved forskjellige pH-verdier. Og pH-responsivitet av liposomene ble evaluert ved å måle mengden av pyranine frigjort fra dem. Etter å ha testet forskjellige forhold, besluttet vi å bruke POPC og DSPE-PG8MG andel på 85 and15 (mol%).
Intracellulær lokalisering av pH-liposomer
For å undersøke cellulært opptak og intracellulær lokalisering av pH-liposomer, syntetiserte vi rhodaminmerkede pH-følsomme tomme liposomer (rhodamin fargestoff ble kovalent konjugert til lipidene under syntesen) som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Kreft i bukspyttkjertelen celler MiaPaCa-2 ble inkubert med rhodamin-merkede liposomer i 4 timer og liposomal fluorescens ble undersøkt med et fluorescerende mikroskop. Som vist i figur 2A, ble punktformet fluorescens observert ved et perinukleært region som indikerer lysosomal lokalisering. Dette punktet ble bekreftet ved bruk av Lysosensor Grønn DND-189 (Life Technologies). Lysosensor Grønn DND-189 viser grønn fluorescens bare når inne intracellulære sure avdelinger som lysosomer. Ko-lokalisering av rød fluorescens rhodamin og grønn Lysosensor fluorescens ble observert, noe som bekrefter lysosomal lokalisering av liposomene. Således, liposomer ser ut til å akkumulere i lysosomer når det tas opp av cellene.
GGTI belastede liposomer ble fremstilt og deretter utsatt for en løsning justert til forskjellige pH-verdier i 15 minutter, og frigivelsen av GGTI ble undersøkt ved HPLC. TritonX-100 ble anvendt som en fullstendig frigjøring kontroll. Symbolet * angir statistisk signifikant forskjell på P-verdi 0,05.
Drug Lasting og Slipp
Liposome lasteeffektivitet av narkotika og fargestoffer ble testet ved å blande med liposomer, ved hjelp av Sepharose 4B kolonne for å fjerne frie narkotika og slippe innhold fra liposomer av Triton X-100. GGTI konsentrasjonen ble målt ved å sammenligne med en standard GGTI prøve ved anvendelse av LC-MS. Vi beregnet at lastekapasitet på GGTI i liposomer er omtrent 30% av total GGTI. For å undersøke størrelsen på rekonstituerte liposomer, vi utsatt GGTI lastet liposomer til dynamisk lysspredning (DLS) måling. Som kan sees i figur 2B, har vi funnet at størrelsen av de GGTI belastede liposomer varierte 46-65 nm i diameter med gjennomsnittlig størrelse på 54,9 nm. Dermed har vår forberedelse en relativt smal størrelsesfordeling.
Offentliggjøring av GGTI fra liposomer ble undersøkt ved å laste GGTI, samle GGTI lastet liposomer og slippe innholdet ved å utsette til PBS buffer med forskjellige pH-verdier fra 4,5 til 8. Som vist i figur 2C, liposomer beholdt GGTI inne tett ved nøytrale eller basiske buffere. Lite frigjøring av GGTI ble observert ved en pH-området 6-8. Imidlertid, da pH-verdien var under 6, ble det observert en betydelig frigjøring av GGTI fra liposomer. Ved pH 5,5, ble mer enn 80% av loaded GGTI utgitt. På samme måte var nesten fullstendig frigjøring observert ved pH 5 og ved pH 4,5 (ikke vist). Disse resultater antyder at det pH-følsomme liposomer effektivt ble destabilisert ved sure betingelser. En skarp overgang mellom pH 5,5 og pH 6 tyder på at denne typen liposomer gir et egnet redskap for intracellulær kontrollert frigjøring.
Lav pH-avhengig Levering av Loaded Dye inne i cellen
doxorubicin lastet liposomer ble anvendt for å undersøke intracellulær legemiddelfrigjørelse-funksjon, ettersom doksorubicin avgir sterk rød fluorescens under UV-eksitering. Etter eluering fra en Sepharose 4B kolonne for å fjerne frie legemidler, ble en homogen suspensjon av doksorubicin-liposomer lastet tilsatt til brystcancer MCF-7-celler som var dyrket i en åtte-brønn glasskammer. 6 timer etter inkubering ble cellene vasket og undersøkt med fluorescens mikroskopi av bildet fordelingen av doxorubicin i kreftceller. Cellene ble behandlet med doksorubicin viste sterk rød fluorescens (figur 3A) i cytosol og i kjerner. Dette var lik den som ble observert med celler behandlet med gratis doxorubicin (data ikke vist). På den annen side, kontrollceller behandlet med liposomer uten doksorubicin forble ikke-fluorescerende
A.: Fluorescent mikroskopi bilder av MCF7-celler inkubert med doksorubicin-belastede liposomer i 6 timer (den røde fluorescens). Kontrollceller mottok ikke liposomer. B: Offentliggjøring av Pyranine fargestoff i MiaPaCa-2 celler blir undersøkt av sin fluorescens med eller uten behandling med bafilomycin A1. Fasekontrast bilde er vist. C:. Effekter av bafilomycin A1 på pH intracellulære organeller vises med Acridine Orange
De ovennevnte forsøk viser at liposomer kan lastes med fargestoffer og narkotika og vellykket og effektivt levere innhold til kreftceller. Vi ønsket for ytterligere å karakterisere den lave pH-avhengig frigjøring funksjon av liposomene inne i cellen. For å undersøke dette punktet, brukte vi Pyranine fargestoff lastet liposomer og behandlede celler med bafilomycin, et stoff som endrer lysosomal pH. Bafilomycin A1 (Baf) er en spesifikk hemmer av den intracellulære vacuolar protonpumpe, inhibering surgjøring av vacuolar systemet, for eksempel endo /lysosomer, og dermed øke lysosomal pH [41,42]. Kreft i bukspyttkjertelen celler MiaPaCa-2 ble behandlet med 160 nM Baf i 6 timer og deretter Pyranine dye-lastet liposomer ble lagt til cellene. Cellene ble inkubert i ytterligere 12 timer før undersøkelse ved fluorescens mikroskopi. Som vist i figur 3B, ved behandling med Baf fullstendig forhindret intracellulær frigivelse av Pyranine, demonstrert ved mangel på flekker, sammenlignet med den lyse grønn fluorescens av cellene ueksponert til Baf. For å bekrefte effekten av Baf på de-forsuring av endosomer, ble acridinoransje (AO) farging utført. AO er en fluoriserende svak base som er hyppig brukt som en sonde for overvåkning av forsuring av organeller. I nøytrale eller alkaliske miljøer dette fargestoffet avgir grønn fluorescens, men når de utsettes for sure avdelinger, er det ionisert og utslippsgjennomgår en rød skift. I de ubehandlede celler, ble rød fluorescens observert inne diskrete cytoplasma organeller, noe som indikerer at AO hadde akkumulert i sure organeller (figur 3C). Men den røde fluorescens dramatisk redusert etter 6 timers Baf behandling, noe som indikerer at BAF hadde økt pH i endosomer i MiaPaca-2-celler. Disse resultatene tyder på at utgivelsen av fargestoff fra liposomene er avhengig av lav pH forhold i intracellulære organeller.
Liposomalt GGTI hemmer protein Geranylgeranylation inne i cellen, og denne effekten er avhengig av lav pH i lysosomer
GGTI utslipp og effekt for å hemme protein geranylgeranylation inne kreftceller ble undersøkt. Figur 4A viser at leveringen av GGTI av liposomer i at inhibisjon av protein geranylgeranylation inne i cellen. I dette eksperimentet, ble MiaPaCa-2-celler ble behandlet med liposomal-GGTI i 3 timer, og proteiner ble oppsamlet fra cellelysat for Western-analyse. Som vist, behandling av celler med enten GGTI P61-A6 alene eller GGTI belastet liposomer førte til utseendet unprenylated Rap1 band, noe som indikerer at liposomer levere og slipp GGTI sammensatte innsiden av cellene til å fungere og hemmet protein geranylgeranylation. Siden pH-liposomer utviser signifikant destabilisering under pH 6, som svarer til pH-verdi på endolysosome indre, pH-liposomene var sannsynligvis vil bli destabilisert eller kondensert med endosomale membraner som resulterer i frigjøring av medikamentet lasten inn i cytosol, inhibering av GGTase-I og blokkerer Rap1 prenylation. For å undersøke pH-følsomheten GGTI utgivelsen, ble det samme eksperimentet gjentas etter å behandle cellene med pH-endring sammensatte bafilomycin A1. Som vist i figur 4A, behandling med bafilomycin A1 opphevet virkningen av liposomal-GGTI på Rap1 prenylation. Dette er i tråd med ideen om at øket pH i lysosomene forandret av bafilomycin A1 kunne ikke destabilisere pH-liposomer lenger derfor GGTIs ble holdt på innsiden av liposomene. Derfor, når det tas opp av cellene, er surheten i endosomer kritisk for destabilisering og /eller sammensmelting av pH-liposomer med endolysosome for effektiv frigivelse og overføring av innholdet inn i cytosol.
Liposomal GGTI årsaker hemming av spredning av bukspyttkjertelen og lungekreft celler
effekten av levering av legemidler fra pH-liposomer ble undersøkt med celleproliferasjon analysen. Bukspyttkjertelkreft cellelinje MiaPaCa-2 ble behandlet med ubelastede liposomer, GGTI belastede liposomer eller frie GGTI (samme volum i buffer) med forskjellige konsentrasjoner i 72 timer. Som vist i figur 4B, ble signifikant inhibering av proliferasjon observert med GGTI belastede liposom. Denne hemmingen var lik eller bedre enn det som ble sett med gratis GGTI. I motsetning til dette ble tomme liposomer ikke påvirke celle-proliferasjon, selv ved 180 ug /ml. Liposomene selv ser ut til å være ikke-giftig ved disse konsentrasjonene.
En av de viktigste funksjonene i GGTI er at de induserer cellesyklus arrest i G1 fasen. For å undersøke om dette gjelder til celle effekter ved hjelp av liposomal GGTI ble cellene behandlet med liposomal GGTI analysert ved flowcytometri. Som vist i figur 4C, behandling av MiaPaca-2-celler med enten GGTI oppløsning eller Lipo-GGTI i 24 timer forårsaket anrikning av G1 faseceller, mens andelen av S-faseceller ble redusert med disse behandlingene. Andel G2 celler ble endret bare litt.
Vi har tidligere vist at GGTI induserer uttrykk for en cellesyklus regulator p21
CIP1 /WAF1 [7]. Induksjon av denne cyklin-avhengige kinase inhibitor resulterer i akkumulering av G1 faseceller. Våre tidligere studier viste at RhoA er en av de viktigste målene for GGTI og at RhoA undertrykker p21
CIP1 /WAF1 uttrykk. For å undersøke om liposomal-GGTI induserer p21
CIP1 /WAF1 uttrykk, behandlet vi MiaPaCa-2 celler med liposomal GGTI og gjennomført Western analyse. Som vist i figur 4D, signifikant induksjon av p21
CIP1 /WAF1 ble observert ved behandling med liposomal GGTI.
I våre tidligere studier, viste vi at GGTI P61A6 hemmet både i bukspyttkjertelen og lungekreft celler i dyr modeller derfor vi også testet liposomal GGTI med forskjellig lungecancercellelinjer, H596, H358 og A549, så vel som med normal bronkial epitelcellelinje BEAS-2B. Som vist i figur 5, sammenlignet med losset liposomer, liposom-GGTI viste signifikant celleproliferasjon inhibering med en rekke ikke-liten lungecancer-cellelinjer som ble testet. Liposomal GGTI trykkes ca. 60-80% av celleproliferasjon, mens den samme konsentrasjon av tomme liposomer ikke. Interessant, den normale humane bronkiale epitel cellelinje BEAS-2B viste uventet sterk motstand mot liposomalt GGTI sammenlignet med lungekreftceller. Mekanismen for denne motstanden er fortsatt ukjent og garanterer videre etterforskning.
Cell tall etter 72 timers behandling er vist som prosentandel av ubehandlede celler. Tomme liposomer påvirker ikke proliferasjon. Symbolet * angir statistisk signifikant forskjell på P-verdi 0,05.
Liposomale GGTI synergizes med FTI (famesyltransferaseinhibitoren) for å hindre spredning av K-Ras Aktivert kreftceller
Resultatene ovenfor tyder på at liposomal-GGTI er en ny type kreft medikamenter som har potensial til å bli levert til tumor. Dette åpner muligheten for at det kan brukes til å inhibere K-Ras-signalisering som er aktivert i en rekke humane krefttilfeller inkludert pankreatiske, lunge og tykktarm kreft. Ras familie proteiner, spesielt K-Ras, kan alternativt prenylated enten FTase eller GGTase-I [43-45].
