Abstract
RUNX3 (runt relaterte transkripsjonsfaktor-3) har blitt rapportert å undertrykke svulst tumorigenesis og metastase i ulike kreft hos mennesker. I denne studien brukte vi tissue microarray (TMA) for å fastslå betydningen av RUNX3 i prostatakreft progession. Våre resultater viste ektopisk uttrykk for RUNX3 i prostata kreft vev sammenlignet med tumor tilstøtende normale prostata vev, og redusert RUNX3 farging ble signifikant korrelert med TNM stadium. Videre demonstrerte vi at RUNX3 overekspresjon hemmet prostatacancer cellemigrering og invasjon som følge av forhøyet oppregulering av tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 (TIMP-2), som deretter hemmet metalloproteinase-2 (MMP-2) ekspresjon og aktivitet in vitro. Slå ned av RUNX3 uttrykk brøt opp balansen av TIMP-2 /MMP-2, mens stillhet av TIMP-2 resulterte i inhibering av MMP-2-ekspresjon i prostataceller. Vi viste også at gjenopprettelse av RUNX3 redusert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og sekresjon undertrykkes endotelial cellevekst og rør formasjonen. Påfallende, RUNX3 ble demonstrert for å hemme tumormetastase og angiogenese in vivo. Til sammen våre resultater støtte svulsten undertrykkende rolle RUNX3 i human prostatakreft, og gi innsikt i utvikling av målrettet behandling for denne sykdommen
Citation. Chen F, Wang M, Bai J, Liu Q, Xi Y Li W, et al. (2014) Rolle RUNX3 i Demper metastase og Angiogenese of Human prostatakreft. PLoS ONE 9 (1): e86917. doi: 10,1371 /journal.pone.0086917
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 14. august 2013, Godkjent: 16 desember 2013; Publisert: 24 januar 2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet støttes av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (nr 81302207). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA [1]. Kirurgisk inngrep er fortsatt den mest effektive behandling for primær prostatakreft, selv om omtrent 30% av pasientene prostata sykdom oppstår tilbakefall og /eller metastase etter innledende behandling, noe som resulterer i relativt korte overlevelsesperioden (12-15 måneder) [2]. Metastase er en usedvanlig kompleks prosess, inkludert kreftceller migrerer ut av primære svulster og invadere i nabolandet vev, intravasate i blodet eller lymfesystemet sirkulasjon, overleve i blodet, og målrette bestemte organer til å initiere metastatisk utvekst [3]. Det er av betydning for å forstå den mekanistiske grunnlag av tumormetastase ved å identifisere viktige molekyler som er involvert i denne prosessen, som vil gi innsikt i utvikling av mer effektive strategier for å forebygge tumorprogresjon.
Rundt domene familie, bestående av RUNX1, RUNX2, og RUNX3, er master regulatorer av genuttrykk i celleproliferasjon og differensiering. RUNX familie proteiner inneholder den godt konserverte domene med 128 aminosyrer region (Rundt domene) og danne et stabilt kompleks med PEBP2b /CBFb for å utøve sin evne til transaktivering [4]. Alle tre RUNX familiemedlemmer spiller viktige roller i normale utviklingsprosesser og tumotigenesis [5]. RUNX proteiner regulerer ekspresjonen av cellulære gener ved binding til promotere eller forsterkere av mål-gener relatert til celle-skjebnen avgjørelser, som blir forstyrret i kreftceller [6].
Blant de tre RUNX familiemedlemmer, RUNX3 var opprinnelig klonet som AML2 og er lokalisert på kromosom 1p36.1. RUNX3 ble først rapportert å korrelere med genesis og progresjon av menneskelig magekreft som en tumor suppressor [7]. Dessmagekreft, er det blitt rapportert at ektopisk ekspresjon av RUNX3 ble observert i en rekke kreftformer, inkludert brystkreft, gliom [8], [9]. Analyse av kliniske vevsprøver fra peritoneal metastaser som følge av mage kreft gir bevis for at RUNX3 uttrykk sunket betraktelig i metastatisk vev, sammenlignet med normal mageslimhinnen eller primære hoved svulster. ([10]) Viktigere, nedgangen i RUNX3 protein uttrykk er signifikant assosiert med dårlig overlevelse av magekreft og melanom [11], [12]. I vår forrige undersøkelse, viste vi at RUNX3 kan fungere som en tumor suppressor ved å regulere cellemigrasjon, invasjon og angiogenese i nyrecellekreft [13]. Disse studiene tyder på en sentral rolle RUNX3 i tumorigenesis og progresjon. Men funksjonen RUNX3 i prostatakreft er ennå ikke godt undersøkt.
I denne studien undersøkte vi uttrykket av RUNX3 i forhold til clinicopathologic funksjoner ved hjelp av prostatakreft vev microarray. Vi har funnet at tap av RUNX3 uttrykk direkte korrelert med prostatakreft TNM stadium. I tillegg gjenopprettelse av RUNX3 uttrykk førte til undertrykkelse av MMP-2 og induksjon av TIMP-2, som utgjør, i det minste delvis, undertrykkelse av tumopr progresjon og metastasering. Disse resultatene er i overensstemmelse med rollen til RUNX3 i regulering av TIMP-2 /MMP-2 i normale prostataceller. Videre viste vi at reduksjon av VEGF-sekresjon indusert av RUNX3 gjeninnføring hemmet prostatakreft angiogenese. Våre kliniske og mekanistiske data indikerte at RUNX3 kan være en svulst suppressor involvert i utviklingen av prostatakreft og målretting av RUNX3 pathway utgjorde en potensiell behandlingsform for human prostatakreft.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Denne studien av vev microarray ble utført under en protokoll godkjent av Institutional Review styrene i Affiliated Hospital of Suzhou Medical College og alle undersøkelser ble utført etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke.
alle dyr forsøkene ble utført ved anvendelse av hann nakne mus (6-7 uker gamle). Musene ble kjøpt fra SLAC Forsøksdyr Ltd Co (Shanghai, Kina) og brydde seg ifølge National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle dyr eksperimentelle protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Xuzhou Medical College (IACUC nr 1201).
Pasienter og Prøver
En prostatakreft TMA ble kjøpt fra Shanghai Xinchao Bioteknologi ( Shanghai, Kina). Svulster ble iscenesatt i henhold til 2013 reviderte TNM-systemet som følger [14]: 139 tilfeller med stadium I-II og 79 tilfeller med etapper III-IV. I tillegg inneholder det 52 tilfeller av tumor ved normal prostata vev. Matrisen dot diameter var 1,5 mm, og hvert punkt representerer en vev sted fra en enkelt prøve som ble valgt og patologisk bekreftet.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi-farging ble utført som beskrevet tidligere [13]. Den primære kanin anti-RUNX3 antistoff (1:200) (medisinske og biologiske Laboratories, Nagoya, Japan), anti-VIII (1:100), anti-PAP (1:100) (Santa Cruz, CA, USA) og biotinylert anti-mus IgG (1:200) (BOOSTER Biotech, Wuhan, Kina) ble brukt. For TMA farging evalueringen ble immunreaktiviteten vurdert blindt ved to uavhengige observatører ved hjelp av lysmikroskopi (Olympus BX-51 lysmikroskop), og bildet ble oppsamlet ved Camedia Master C-3040 digitalt kamera. Ekspresjon av RUNX3 ble gradert som positiv når 10% av tumorcellene viste immunopositivity. Biopsier med 10% tumorceller som viser farging ble vurdert negativt [15].
Cellelinjer og Transfeksjon
Menneskelig prostatakreft cellelinjer PC3, DU145 og prostata celle RWPE-en ble kjøpt fra Shanghai institutt for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HUVECs ble innhentet fra Nanjing Kaiji Biotech. DU145-celler ble dyrket i F12-medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS). RWPE-1-celler ble opprettholdt i K-SFM mediun med 10% FCS. PC3-celler og HUVECs ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FCS. Cellene ble i et 37 ° C fuktet inkubator med 95% luft, 5% CO
2. De pflag-kontroll og pflag-RUNX3 ekspresjonsplasmider ble hentet fra Dr Pei-Jung Lu (National Cheng-Kung University, Tainan, Taiwan).
For transient transfeksjon, transfeksjon av pflag-kontroll og pflag-RUNX3 plasmider i PC3 og DU145 cellene ble utført ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Shanghai, Kina) etter produsentens protokoll. Transfeksjon av sil-RUNX3, si-TIMP-2 og tak siRNA inn i RWPE-1-celler ble utført ved hjelp av siLentFect Lipid Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For stabil transfeksjon, vektorer den lentiviral uttrykk LV5-RUNX3 og LV5-Control ble innhentet fra Shanghai Gene Pharma Company (Kina). De lentiviruses ble blandet med polybren (5 ug /ml) og tilsatt til DU145-celler for infeksjon. De positive kloner ble selektert på puromycin (5 ug /ml). De stabile RUNX3 transfektanter ble isolert etter 2 uker under valget.
migrering og invasjon Assay
Cell migrering og invasjon assay ble bestemt ved anvendelse av en modifisert to-kammer migrasjon analysen med en porestørrelse på 8 um . For migrering analyse ble 1 x 10
6 PC3 og DU145-celler sådd ut på serumfritt medium i det øvre kammer. Etter 12 timers inkubering ved 37 ° C, ble cellene i det øvre kammer fjernes forsiktig med en bomullsdott, og cellene som hadde gjennomløpt membranen ble fiksert i metanol, farget med hematoksylin og telles. For invasjon analysen ble cellene sådd ut i serum-fritt medium i det øvre kammer. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C, ble noinvasive cellene forsiktig fjernet fra toppen av Matrigel med en bomullspinne. Invaderende celler i bunnen av Matrigel ble fiksert i metanol og farget med leucocrystal fiolett. For kvantifisering, ble cellene telles under et mikroskop i fem felt (opp, ned, median, venstre, høyre. × 200).
HUVEC Vekst og Tube-analysen
Transfekterte PC3 og DU145 cellene ble dyrket i 6-brønns plate med friskt komplett medium i 24 timer, ble mediet oppsamlet og sentrifugert for å fjerne eventuelle cellerester før dens bruk som et kondisjonert medium. For cellevekstanalyse, 2 x 10
4 HUVECs suspendert i 100 ul kondisjonert medium og sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
4 i en 96-brønners dyrkingsplate og inkubert i 24 timer. Deretter celleproliferasjon ble oppdaget ved hjelp av Celletelling kit-8 (CCK-8) som er kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Shanghai, Kina). For rør formasjon assay, ble 48-brønners plate belagt med Matrigel (BD Biosciences, NJ, USA) og holdt på 37 ° C i 0,5 timer. Deretter ble 2 x 10
4 HUVECs ble suspendert i 100 ul kondisjonert medium og anvendt for å pre-belagte 48-brønns plate. Etter inkubering ved 37 ° C i ytterligere 24 timer ble antall kapillære lignende rør fra tre tilfeldig valgte felt tellet og fotografert under et Nikon invertert mikroskop (Nikon, Japan).
ELISA for VEGF
PC3 og DU145-celler ble sådd ut i 6-brønns vevskulturplater med en tetthet på 1 x 10
6-celler per brønn. Deretter ble cellene transfektert med pflag-kontroll og pflag-RUNX3 med serum sult. Supernatantene ble samlet 24 timer etter transfeksjon. VEGF Konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp Quantikine ELISA kits i henhold til produsentens instruksjoner (R reverse GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3; TIMP2 fremover, ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG; CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG og GAPDH fremover, TGAA GGTCGGAGTCAACGGATT; omvendt, CCTGGAAGATGGTGATGGGATT.
Western Blot analyse
Celle eller vevsekstrakter ble separert på en 10% SDS-polyakrylamidgel. Proteinene ble deretter overført til nitrocellulose membran og inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer: mus-anti-RUNX3, kanin anti-MMP-9, MMP-2, TIMP-1 og TIMP-2 (Cell Signaling Technology, MA, USA) og mus anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA). Membranene ble deretter vasket og inkubert med sekundært antistoff (geite-anti-kanin og geit-anti-mus IgG) i 2 timer, farget med fargevæske som inneholder 10 ml alkalisk fosfatase-buffer og utviklet ved hjelp av NBT /BCIP farge substrat (Promega, Madison, USA ).
in vivo eksperimentell metastase modeller
To grupper med 8 mannlige nakne mus ble plassert i SPF barriere anlegg under en 12 timers lys /mørke syklus. Mus ble injisert via halevenen med RUNX3 stabilt transfektert DU145-celler (1 x 10
6 celler pr flanke) i 100 ul PBS. En insulin nål ble anvendt for halevenen injeksjoner. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon og bare enkeltcellesuspensjoner mer enn 95% levedyktige ble anvendt. Musene ble avlivet ved 8 uker etter implantasjon, ble lungene fiksert i 10% formell dehyde, og hematoxylin og eosin (HE) farget for metastatiske knuter.
underhudssykdommer in vivo eksperimenter
For å evaluere tube dannelse, ble to grupper på 8 hann nakne mus injisert med RUNX3 stabilt transfektert DU145-celler (1 x 10
6 celler pr flanke) i 100 ul PBS /Matrigel (50:50) subkutant. Dyrene ble overvåket daglig. Kroppsvekten av hver mus ble registrert og tumorvolum ble bestemt ved verniercaliper hver dag, etter formelen A x B
2 x 0,52, hvor A er den lengste diameter av tumoren og B er den korteste diameter. Musene ble avlivet ved 8 uker etter implantasjon, og svulster ble kirurgisk fjernet og fiksert i 10% formell dehyde for histologi. Alle eksperimentelle dyre prosedyrer ble utført i samsvar med de institusjonelle etiske krav og godkjent av komiteen for Xuzhou Medical College for bruk og stell av dyr.
Statistical Analysis
Tall data er uttrykt som middel ± SD Statistiske forskjeller mellom middel for de forskjellige grupper ble evaluert med INSTAT 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) ved anvendelse av en-veis analyse av varians (ANOVA). For TMA, ble statistisk analyse utført med SPSS 11.5 programvare (SPSS). Sammenhengen mellom RUNX3 farging og clinicopathologic parametre av prostata kreftpasienter, inkludert alder, tumorstørrelse, grad av tumor og TNM trinn ble evaluert ved χ
2-test. Betydningen av in vivo-data ble bestemt ved hjelp av den tosidige Mann-Whitney U-test. Forskjeller ble vurdert som statistisk forskjellig på
P
. 0,05
Resultater
RUNX3 Expression er redusert i Human Prostate Cancer
Vi først avgjort om RUNX3 uttrykk endres i human prostatakreft. Immunhistokjemi farging ble utført i TMA lysbilde som inneholder kreft tilstøtende normale prostata vev og prostata kreft vev. De presentative Bildene ble presentert i Fig. 1A. Våre resultater viste at det var en betydelig lavere nivå av RUNX3 uttrykk i tumorer enn i tumoren tilstøtende normale vev prostata (
P
0,01, figur 1B.). Dette antydet at RUNX3 ble ofte uttrykt i normal menneskelig prostata vev, men redusert eller fraværende i prostata kreft vev.
En representant immunhistokjemiske bildene ble tatt ved forskjellige forstørrelser i tumor tilstøtende normal prostata vev og prostata kreft vev (Top panel × 100, nedre panel x 400). B Sammenlignet med det i svulsten ved normal prostata vev, den generelle uttrykk nivået RUNX3 i prostata kreft vev var signifikant lavere (
P
0,01, χ
2 test). C Redusert RUNX3 uttrykk ble korrelert med TNM stadium (
P
0,01, χ
2 test, sammenligne I-II versus III-IV).
Tap av RUNX3 Expression i prostatakreft er assosiert med Tumor Stage
i alle 218 pasienter med prostatakreft, er forholdet mellom RUNX3 uttrykk og patologiske og kliniske egenskaper vist i tabell 1. den gjennomsnittlige (SD) alder for pasientene var 58,7 år ( median, 66,5 år, range, 37-87 år). Fordi TNM stadium er en viktig prognostisk markør for pasienter med prostatakreft, vi har oppdaget at RUNX3 uttrykk i 139 tidlig stadium (I-II) og i 79 sent stadium (III-IV) kategorier av prostata kreft vev. Vi fant RUNX3 farging ble dramatisk redusert i sene stadier sammenlignet med tidlig stadium I-II (
P
. 0,01, figur 1C). Men vi fant ikke signifikant korrelasjon mellom RUNX3 uttrykk med andre clinicopathologic variabler, som alder, tumorstørrelse og tumor klasse.
Restaurering av RUNX3 Expression hemmet Prostate Cancer Celler Migrasjon og Invasion in vitro
Siden RUNX3 ekspresjon er relatert til TNM stadium med prostatakreft, kan RUNX3 spiller viktige roller i ett eller flere trinn av prostata cancer metastase. Vi først undersøke effekten av RUNX3 gjeninnføring på prostatakreftceller migrasjon og invasjon. Vi transient transfektert PC3 og DU145 celler med pflag-kontroll og pflag-RUNX3 plasmider. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble protein betydelig overuttrykt i kreftceller (Fig. 2A og B). Transfekterte celler ble underkastet cellemigrering analyse og invasjon assay. I celle migrasjon analysen, fant vi at RUNX3 restaurering i PC3 og DU145 cellene redusert evne til å migrere gjennom Boyden kammer med 55% og 63%, henholdsvis (figur 2C og D). (
P
0,05) . I celle invasjon analysen, RUNX3-transfekterte celler viste signifikant lavere invasiv potens enn kontrollgruppen, med invasive celler med 57% og 82% i PC3 og DU145 cellene henholdsvis (Fig. 2E og F) (
P
0,05, ANOVA)
Invasive evne til kreftceller kan reguleres ved MMP.. For å studere mulige rolle MMP i RUNX3-indusert hemming av celle invasjonen, utførte vi gelatin zymografi å måle MMP-2 og MMP-9 aktiviteter. MMP-2 Enzymaktiviteten ble undertrykket etter å ha tvunget ekspresjon av RUNX3 i PC3 og DU145-celler (fig. 3A). Western blot ble anvendt for å undersøke de TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 og MMP-9 uttrykk i prostatakreftceller. Våre resultater viste at inhibering av MMP-2-protein-nivå er på grunn av den økte ekspresjon av TIMP-2 etter RUNX3 overekspresjon i begge cellelinjer (Fig. 3B). For ytterligere å bekrefte rolle RUNX3 i regulering av TIMP-2 /MMP-2, ble normal prostata celle RWPE-1 anvendt i vårt studium og våre data viste at slå ned på RUNX3 uttrykk brøt opp balansen av TIMP-2 /MMP -2 (fig. 3C), mens taushet av TIMP-2 resulterte i inhibering av MMP-2-mRNA og protein ekspresjon i prostata celle (fig. 3D og E). Disse resultatene viste at RUNX3 var involvert i reguleringen av TIMP-2 /MMP-2.
A Aktiviteten til MMP-2 og MMP-9 ble evaluert ved Gelatin zymografi. B Western blot-analyse av de relative protein nivåene av MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 og β-aktin i RUNX3 re-ekspresjon og kontrollgruppe for både PC3 og DU145 cellelinjer. C Western blot for proteinet ekspresjon av MMP-2, TIMP-2 og β-aktin i RUNX3 kutting og kontrollgruppe for RWPE-1 cellelinje. D Western blot-analyse for MMP-2 og β-aktin uttrykk etter slå ned av TIMP-2. E Real time PCR for MMP-2 mRNA uttrykk etter slå ned av TIMP-2. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. *
P
. 0,05
Restaurering av RUNX3 Expression Redusert Angiogenese in vitro
For ytterligere å bestemme effekten av restaurerte RUNX3 uttrykk på angiogenic potensialet for menneskelig prostata kreftceller, den angiogene potensialene av supernatanten av PC3 og DU145-celler transfektert med pflag-kontroll eller pflag-RUNX3 ble bestemt ved endotelcelle proliferasjonsanalyse og rør formasjon assay. I celleproliferasjonsanalyse, har vi funnet at kondisjonert medium fra PC3 og DU145-celler transfektert med pflag-RUNX3 inhiberte proliferasjon av endotelceller sammenlignet med de fra kontrollceller (Fig. 4A og B). I røret formasjonen analysen, ble graden av røret formasjon måles som prosentandel av celleoverflatearealet i forhold til totalt overflateareal. Som vist på figur 4C og D, var det gjennomsnittlige antall komplette rørformede strukturer som dannes ved HUVECs signifikant redusert i kondisjonert medium fra RUNX3 over-uttrykker PC3 og DU145-celler sammenlignet med vektor-kontroller (
P
0,05).
A og B CCK-8-celle proliferasjonsanalyse ble utført for å påvise den HUVECs proliferasjon. C og D Representative bildene ble tatt i situ for tube-formasjonen i supernatanten av PC3 og DU145 celler transduced med pflag-kontroll og pflag-RUNX3. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer. E ELISA for utskillelsen av VEGF i PC3 og DU145 celler transduced med pflag-kontroll og pflag-RUNX3. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. *
P
. 0,05
VEGF er en viktig mitogen og overlevelse faktor for endotelceller. Som svar på angiogene stimulering, endotelceller inngå en aktiv proliferativ tilstand. For å evaluere mekanismen for RUNX3 regulerer angiogenese, ble ELISA utført for å påvise VEGF utskilt i kulturmediet avkjølte av prostatakreftceller. Som vist på fig. 4E, betydelig reduksjon i VEGF-sekresjon ble observert i kondisjonert medium fra PC3 og DU145 cellene transfektert med pflag-RUNX3 sammenlignet med kontrollceller (
P
0,05).
Restaurering av RUNX3 Expression hemmet metastaser in vivo
Fordi RUNX3 uttrykk redusert svulst celle migrasjon og invasjon in vitro, ble en halevene metastatisk test som benyttes for å analysere in vivo effekter av RUNX3 uttrykk på metastatisk styrken av DU145 cellene. Sammenlignet med kontroll-celler infisert med tom virusvektor, HE-farging viste at haleveneinjeksjon av celler som stabilt infisert med LV5-RUNX3 inn i atymiske nakne mus førte til betydelig færre antall noduler i lungene (Fig. 5A og B). For ytterligere å bekrefte dette fjernmetastaser, utførte vi immunhistokjemi å oppdage kritiske markører for prostatakreft. Prostata spesifikt antigen (PSA) og prostata syre fosfatase (PAP) anses for å være kritiske markører for diagnose av prostatakreft [16]. Imidlertid er PSA ikke uttrykkes i DU145-celler [17]. Derfor brukte vi PAP i vår studie for å undersøke årsaken til kreft noder i lungene. Som vist i fig. 5C, PAP positiv i lungevev indikerte at fjernmetastaser i dyremodellen var fra DU145 celler som ble injisert fra hale fartøyet. Resultatene viste bemerkelsesverdig hemmende effekter av RUNX3 på lungemetastaser fra prostatakreft celler.
En Mus ble injisert med ble injisert via halevenen med DU145 celler transfektert med de angitte uttrykk plasmider. Grupper inneholdt 8 mus. Åtte uker senere ble musene avlivet og lungemetastase av DU145-celler ble målt ved makroskopisk etter obduksjon. Histologisk analyse av metastatiske lesjoner i ribbeina av nakne mus ble båret av HE farging. B Kvantifisering av knuter i lungene med endrede RUNX3 nivåer. Antallet knuter ble blindt evaluert i 5 tilfeldige felt per implantat på 200 forstørrelser. Data er vist som gjennomsnitt ± S.D. *
P
0,05. C Representant immunhistokjemiske fotografier av PAP uttrykk i lungevevet (forstørrelser, × 200 og × 400). * Svulstvev.
Restaurering av RUNX3 Expression Trykt tumorigenesis in vivo
For å undersøke effekten av RUNX3 behandling på tumorvekst in vivo, etablerte vi en subkutan svulst i nakne mus. Fig. 6A viste at RUNX3 protein var over-uttrykt etter stabilt infisert med LV5-RUNX3. Svulster i mus stabilt infisert med LV5-RUNX3 hadde fått en betydelig vekst arrest sammenlignet med kontrollene (
P
0,05). Et representativt fotografi som viser tumorvekst i kontroll og RUNX3 uttrykt mus (Fig. 6B).
En naken mus ble injisert subkutant med DU145-celler som stabilt uttrykker LV5-RUNX3 eller LV5-Control. Western blot ble anvendt for å undersøke RUNX3 proteinnivå. B Tumorene ble målt for totalt åtte uker. Tumor diameter ble målt med en passer hver uke, og tumorvolumet ble beregnet etter formelen A x B
2 x 0,52, hvor A er den lengste diameter av tumoren og B er den korteste diameter. Svulsten Volumet var betydelig større på 8 uke i mus som fikk kontroll lentiviruses sammenlignet med de gitte RUNX3 lentiviruses (*
P
0,05). C Representative mus med svulster behandlet med kontroll i forhold gruppe med RUNX3 gruppe. D Uttrykket nivåer av RUNX3 og VIII ble analysert i tumorvev ved immunhistokjemi med representative bilder viste (forstørrelser, × 400). E Kvantifisering av microvessel formasjonen i svulster med endrede RUNX3 nivåer. MVD ble vurdert gjennom fartøyet telling. Antallet farget microvessels ble blindt evaluert i 5 tilfeldige felt per implantat 200 × forstørrelser. * Indikerer signifikant forskjell fra kontrollene (
P
0,05).
For å undersøke om undertrykkelse av tumorvekst er knyttet til effekten av injiserte RUNX3 stabilt transfekterte celler, svulster ble dissekert å undersøke RUNX3 uttrykk ved immunhistokjemisk analyse. Som vist i fig. 6C, er RUNX3 protein ble overexpressesed i RUNX3-injisert xenograft sammenlignet med lav RUNX3 ekspresjon i kontrollgruppen. Disse resultatene styrker ytterligere signifikant effekt av RUNX3 undertrykkelse på prostatakreft vekst.
Restaurering av RUNX3 Expression Redusert Angiogenese in vivo
Siden RUNX3 ikke påvirker tumor celleproliferasjon in vitro, er det sannsynlig at RUNX3 trykt tumorigenesis in vivo gjennom blokkerer VEGF i endotelceller (angiogenese). Vi testet derfor effekten av RUNX3 på angiogenese. DU145-celler som stabilt uttrykker RUNX3 eller kontroll vektorer ble blandet med Matrigel og injisert i begge flanker på de nakne mus. Musene ble avlivet 56 dager etter implantasjon. Antallet VIII-positive microvessels var mye lavere i seksjoner fra xenotransplantater av RUNX3-uttrykk DU145-celler (Fig. 6C og D), som indikerer at RUNX3 dempes prostatakreft celle-induserende angiogenese. Resultatene antydet at den endrede tumorvekst og metastasering av restaurert RUNX3 uttrykk ble korrelert med endret angiogenese.
Diskusjoner
Rollen RUNX3 i tumorigenesis har blitt studert mye i de siste årene. Tidligere rapporter har vist at RUNX3 ekspresjon ble redusert i mange typer av humane kreftformer, slik som brystkreft, tykktarmskreft, nyrecellekarsinom, melanom [8], [11], [13], [18]. Det har vært bevis for at RUNX3 metylering var spesielt hyppig i ulike kohorter av prostata kreft, men ikke i normal prostata slimhinne [19], [20]. Disse observasjonene tyder på en viktig rolle for RUNX3 i humane kreftformer, blant annet prostatakreft. Imidlertid har funksjonen av RUNX3 i prostatakreft ikke blitt undersøkt. Bedre å forstå den eksakte rolle RUNX3 i prostatakreft utvikling, brukte vi TMA teknologi, in vitro cellemodell og in vivo dyremodell for å undersøke hvilken rolle RUNX3 i prostatakreft. Våre kliniske resultater viste at RUNX3 gikk tapt i prostatakreft og korrelert med TNM stadium. Våre in vitro-studier viste at RUNX3 i prostatakreftceller reduserer cellemigrering, invasjon og angiogenese-egenskaper, som var i overensstemmelse med funksjonen av RUNX3 in vivo.
Kirurgisk reseksjon er den mest populært brukt strategi ved behandling med den primære prostatakreft [2]. Men for pasienter med avansert sykdom, viser det kirurgiske inngrepet mindre benifits [21]. Således er det viktig for å forutsi risikoen for tilbakefall for å minimalisere de ugunstige virkninger og maksimere den terapeutiske effekten av behandling av prostatakreft. Imidlertid, av de tilgjengelige prognostiske faktorer for prostatakreft, er den viktigste International Union mot kreft TNM trinn som bestemmes av dybden av invasjon, involvering av lymfeknuter, og nærværet av fjernmetastaser [14]. I denne studien fant vi at RUNX3 uttrykket ble tapt i prostata kreft vev. Videre RUNX3 protein ble signifikant redusert i sent stadium (fig. 1). Vår kliniske bevis klart støttet tanken om at endrede uttrykk for RUNX3 bidrar til prostatakreft utvikling og metastasering. Det har blitt rapportert at redusert ekspresjon av RUNX3 er ofte forårsaket av CpG øy hypermethylation [19]. Videre ble punktmutasjoner av RUNX3 observert i mage og blære kreft [22], [23].
