Abstract
Bakgrunn
Lite er kjent om de molekyler som bidrar til vekst av epitel eggstokkreft karsinom (EOC), som fortsatt er den mest dødelige gynekologisk kreft hos kvinner. Den chemokine Fractalkine /CX
3CL1 har vært mye rapportert å spille en biologisk relevant rolle i tumorvekst og spredning. Vi rapporterer her den første undersøkelsen av uttrykket og rolle CX
3CL1 i EOC.
Resultater
Epitelceller fra overflaten av eggstokken og egglederne og fra benign, borderline og ondartede svulster alle farget positivt for CX
3CL1. I vevsprøver fra 54 kvinner som gjennomgikk kirurgisk behandling for EOC diagnose, ble CX
3CL1 immunoreaktivitets ujevnt fordelt i epiteliale kreftceller, og varierte fra sterk (33%) til fraværende (17%). Denne ujevne fordelingen av CX
3CL1 ikke gjenspeiler den morfologiske heterogenitet av EOC. Det var positivt korrelert med spredning indeks Ki-67 og med GILZ (glukokortikoid-indusert leucin zipper), tidligere identifisert som en aktivator av proliferasjon av maligne celler EOC. Hierarkisk clustering analyse, inkludert alder ved diagnose, tumor klasse, FIGO stadium, Ki-67-indeksen, CX
3CL1, SDF-1 /CXCL12 og GILZ farging score, fornemme to store klynger tilsvarende lave og høye nivåer av spredning og ulik i form av GILZ og CX
3CL1 uttrykk.
GILZ
overekspresjon i carcinoma-avledet BG1 cellelinje resulterte i parallelle endringer i CX
3CL1 produkter. Omvendt, CX
3CL1 fremmes gjennom sin binding til CX
3CR1 AKT-aktivering og spredning i BG1 celler. I en mus subkutan xenograft modell, overekspresjon av
GILZ
var assosiert med høyere uttrykk av CX
3CL1 og raskere tumorvekst.
Konklusjon
Våre funn markere tidligere verdsatt konstituerende uttrykk for CX
3CL1 foregående tumorigenesis i eggstokkene epitelceller. Sammen med GILZ, fremstår dette chemokine som en regulator av celledeling, som kan være av potensiell klinisk relevans for valg av den mest hensiktsmessige behandlingen for EOC pasienter
Citation. Gaudin F, Nasreddine S, Donnadieu AC, Emilie D, Combadière C, Prévot S, et al. (2011) Identifikasjon av chemokin CX
3CL1 som en ny regulator av ondartet Cell Proliferation i ovarialcancer. PLoS ONE 6 (7): e21546. doi: 10,1371 /journal.pone.0021546
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: May 23, 2011; Godkjent: 01.06.2011; Publisert: 07.07.2011
Copyright: © 2011 Gaudin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ligue contre le cancer (Comité Val d’Oise), Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM), Université Paris-Sud, og EU FP6 (INNOCHEM, gi nummer LSHB-CT -2005-518167). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) utgjør den sjette vanligste kreftformen og den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner i utviklede land [1]. På grunn av den tause natur tidlig stadium sykdommen, har de fleste kvinner med EOC disseminert sykdom (
dvs.
ekspansjon i bukhule og metastase i omentum) ved diagnosetidspunktet og nåtid avansert sykdom, med en fem- års overlevelse under 30% [2]. Til tross for den høye forekomsten og dødeligheten av EOC, forblir etiologiske faktorer involvert i eggstokkene karsinogenese dårlig definert, noe som begrenser effekten av behandlingsprotokoller.
epitelial tumor mikromiljøet består av en kompleks vev som inneholder flere celletyper. De fleste av disse celler produserer og /eller svare på kjemokiner, som kan spille viktige roller i utvikling og progresjon av primær epiteltumorer [3] – [5]. Vi har for eksempel vist at den α-CXC kjemokin stromal celle-avledet Faktor-1 SDF-1 /CXCL12 bidrar til den immunosuppressive nettverk innenfor tumormikromiljøet, i særdeleshet ved orchestra rekrutteringen av pre-DC2s [6]. Vi har også vist at CXCL12 regulerer tumor angiogenese, og at dette er kritisk for tumorvekst [7]. I motsetning lite om noe er kjent om rollen som chemokine Fractalkine /CX
3CL1 i EOC, selv om det har blitt dokumentert å formidle sterke celle adhesjon [8] og sin tilstedeværelse i epitelvev er viden dokumentert [9] – [10]. CX
3CL1 finnes i to former. Membranen-forankret formen formidler den faste adhesjon av celler som uttrykker eget reseptor, CX
3CR1, til endotelet under fysiologiske strømning gjennom sin egen iboende adhesjon funksjon og gjennom integrin-aktivering [11] – [12]. Den oppløselige formen blir frigjort gjennom spaltning ved et område i nærheten av membranen [13]. I likhet med andre konvensjonelle chemokiner, rekrutterer den immunceller som bærer CX
3CR1, slik som T-lymfocytter og cytotoksiske NK-celler, dendrittiske celler eller en stor undergruppe av CD14
+ monocytter [8]. Som et resultat av både adhesjon og kjemotiltrekkende aktiviteter av kjemokin, CX
3CL1 /CX
3CR1 komplekset kan mediere enten pro- eller anti-tumoreffekter [14]. Bukspyttkjertelen duktale adenokarsinom celler som bærer CX
3CR1 spesielt følge CX
3CL1-uttrykke celler av nevrale opprinnelse og migrere som respons på CX
3CL1 produsert av nevroner og nervefibre, som bidrar til perinevral formidling i bukspyttkjertelkreft [15 ]. Prostata kreftceller som uttrykker CX
3CR1 holde humane benmarg endotelceller og migrere mot et medium kondisjonert ved osteoblaster, som skiller ut den oppløselige formen av chemokine bidrar til høy sannsynlighet for prostata kreftceller metastasizing til skjelettet [16] – [17]. I motsetning til dette kan løselig CX
3CL1 (SCX
3CL1) frigitt i tumoren mikromiljøet være en aktiv komponent av det anti-tumorrespons [18] – [21], noe som gjør vaksinasjon av mus med carcinoma celler modifisert for å produsere CX
3CL1 en potent anti-tumorrespons på grunn av chemoattraction av NK-celler [22], eller gjør CX
3CL1 uttrykk ved tykktarmskreftceller en faktor som drastisk redusert sin metastatiske potensial [23].
i dette arbeidet har vi undersøkt uttrykk for CX
3CL1 hos friske og ondartede eggstokkvevet og dens rolle i spredning av ondartede eggstokkene epitelceller. Dette chemokine ble produsert av både friske og ondartede eggstokkene epitelceller, og produksjonen i EOC var positivt korrelert til celleproliferasjon indeksen. Interessant ble det også korrelert til ekspresjon av glukokortikoid-indusert leucin zipper (GILZ), et 17 kDa-leucin- glidelås-protein oppdaget som en deksametason-indusert transkripsjon i murine thymocytter, og som vi nylig har vist seg å forbedre celle-proliferasjon i EOC og til aktivere AKT, en avgjørende signalmolekyl i tumorgenese [24], [25]. Våre funn ble støttet av parallelle og komplementære data fremkommet i vevsprøver fra pasienter diagnostisert for EOC, i BG-en eggstokkreft cellelinje og i en mus subkutan xenograft modell. De gir ytterligere innsikt i rollen som CX
3CL1 i ondartet cellevekst og tumorvekst, nært forbundet med GILZ.
Resultater
Påvisning av CX
3CL1 i sunn og ondartet eggstokkreft vev
Den cellulære uttrykk for CX
3CL1 ble undersøkt av immunohistochemisty (IHC) i seksjoner isolert fra tre friske eggstokker, åtte serøs og mucinkjertler godartede svulster (noen fortsatt inneholder normal eggstokkvev), åtte serøs og mucinkjertler borderline tumorer, to svulster på eggstokkene granulosa- celle, og fra 54 eksemplarer av invasiv EOC. CX
3CL1 var tydelig påvist i eggstokken overflaten epitel (OSE) celler og i epitelet i egglederne (Figur 1a). I serøse og mucinkjertler godartede og borderline tumorer, ble CX
3CL1 immunoreaktivitet detektert i prolifererende tumorceller avledet fra epitelet (figur 1, B og C). CX
3CL1 uttrykk ble oppdaget i EOC eksemplarer, inkludert serøs, klar celle, endometrioid og mucinkjertler histologiske undergrupper (figur 1D). I disse svulstene, ble det oppdaget meste i ondartede celler, noe som gjør kreftceller den viktigste kilden til CX
3CL1 i EOC. I samsvar med dette funnet, CX
3CL1 ble påvist i epitelceller fra maligne ascites, med høyere nivåer av uttrykk i CD326
+ fraksjon (figur 1E). CX
3CL1 ble begrenset til cytoplasma av ondartede epitelceller og ble ikke påvist i kjerner. CX
3CL1 var fraværende fra ikke-epiteliale eggstokkreft granulosa celle svulster (figur 1F).
(A) sunn eggstokk, CX
3CL1 immunoreaktivitets i OSE (i) og eggleder (ii) . (B) Serøs (i) og mucinkjertler (ii) benigne epiteliale tumorer eggstokkene. (C) Serøs (i) og mucinkjertler (ii) grense ovarian epiteliale tumorer. (D) Ondartede epiteliale ovarietumorer: mucinous (i), endometrioid (ii), klar-celle (iii) og serøs (iv), CX
3CL1 immunreaktivitet i epitel-celler er begrenset til cytoplasma, ingen farging i kjernen tumorceller. (E) Cytocentrifuged CD326
– ikke-epiteliale (i) og CD326
+ epitel (ii) celler isolert fra malign ascites oppsamlet fra en pasient diagnostisert med invasiv EOC. CX
3CL1 er oppdaget i CD326
+ celler og også i noen CD326
– celler. (F) Ikke-epitelial eggstokkreft granulosa celle svulst, fravær av CX
3CL1 farging. (A-F) Forstørrelse x 40.
Messenger RNA for CX
3CL1 ble visualisert ved RT-PCR, som genererte et produkt av den forventede størrelse (387 bp) fra tre sunne eggstokk prøver i seks prøver fra godartede ovarietumorer, tre border prøver og ni EOC prøver. Det ble også påvist i BG1, SKOV3 og OVCAR3 ovarian cancer-cellelinjer. Representative data er vist i figur 2A. Mengden av mRNA ble kvantifisert ved sanntids-PCR på fem EOC prøver. Det var positivt korrelert med intensiteten av IHC flekker på en syv-punkts skala (Spearmans test,
P
0,05, r = 0,88) (figur 2B). En 90-kDa-proteinet, tilsvarende den forventede størrelse av full-lengde CX
3CL1, ble påvist i EOC biopsiprøver, i CD326
+ epitelceller av ondartede ascites og i SKOV3, BG1 og OVCAR3 celler (figur 2C). CX
3CL1 er et membranbundet molekyl med kjemokinet domene på et mucin-lignende stengel. Spalting ved foten av denne stilk av metalloproteinaser genererer et oppløselig kjemokin, som fungerer som en klassisk kjemotiltrekkende [13]. Vi deretter undersøkt om SCX
3CL1 ble løslatt fra eggstokkreft celler. Det ble påvist i ondartede ascites (varierende 1,3 til 1,5 ng /ml). Vi har også utført ELISA-analyser på kultursupernatanter. De største mengder SCX
3CL1 ble utvunnet fra kultursupernatanten OVCAR3 celler, som ga det sterkeste signalet på vestlige blotter (figur 2D). Våre funn markere tidligere verdsatt konstituerende uttrykk for CX
3CL1 på sunn epithelia av eggstokken overflate og egglederne, noe som indikerer at EOC kan stamme fra en av disse epitel. Vi avslører videre at CX
3CL1 produksjon av ondartede epitelceller forut tumorigenesis.
(A)
CX
3CL1
mRNA ble oppdaget av konvensjonell PCR på den forventede størrelse (387 bp ) i representative prøver fra 2 friske eggstokker, 5 cystadenomas (godartede svulster), 2 borderline tumorer, 5 adenokarsinomer (ondartede svulster) og i EOC-avledede cellelinjer, SKOV3, OVCAR3 og BG1. Den hvite vertikale linjen som skiller banene ikke kjøres på samme gel. (B)
CX
3CL1
mRNA nivåer ble kvantifisert ved real-time PCR og er uttrykt som
CX
3CL1
innhold normalisert til at av
SS-aktin
. Diagrammet viser fordelingen av farging score mot mengden av
CX
3CL1
mRNA normalisert til de av
SS-aktin
for 5 EOC prøver. Hvert symbol representerer en enkelt prøve med ballen i triplikat (middelverdi); Spearmans test,
P
0,05, r = 0,88. (C) CX
3CL1 immunoblot av totale proteinlysatene fra EOC prøver, fra CD326
+ epiteliale celle beriket ondartet ascites prøver, og fra SKOV3, BG1 og OVCAR3 cellelinjer. CX
3CL1 protein er indisert som en ~90 kDa band. ß-aktin nivåer er vist for normalisering. (D) Påvisning av ELISA av SCX
3CL1 i 24 h kulturmediet av BG1, OVCAR3 og SKOV3 celler (data er midler ± SEM av tre separate forsøk); undetectable SCX
3CL1 i kulturmediet av HEK-293T celler (HEK), brukt som en negativ kontroll.
CX
3CL1 er korrelert med Ki-67 og GILZ i EOC
CX
3CL1 farging var heterogen i EOC prøver, som spenner fra fravær av påvisbare farging (skår 0, 9/54) til sterk immunoreaktivitets (score 5-7, 18/54). Vi har derfor undersøkt om forskjeller i CX
3CL1 uttrykk nivåer var assosiert med uttrykk for to markører for spredning: Ki-67, som rutinemessig brukes for diagnose [26] og GILZ, som vi nylig identifisert som en faktor kontrollere spredning av maligne EOC celler [25]. Immunoreaktivitets for CX
3CL1, GILZ og Ki-67 ble scoret på en syv-punkts skala på grunnlag av fargeintensitet og graden av farging av seriesnitt av fragmenter av EOC fra 54 pasienter. Det var en meget signifikant positiv sammenheng mellom resultatet for Ki-67 og de for GILZ, som forventet (tabell 1). Interessant, ble signifikante positive korrelasjoner funnet mellom CX
3CL1 og Ki-67 og mellom CX
3CL1 og GILZ, for hele kullet av 54 pasienter (figur 3 A og B). De farging score for disse proteinene ble også korrelert i serøs karsinom og ikke serøs karsinom (tabell 1).
(A og B) CX
3CL1 og Ki-67 final score (A, Spearman test,
P
0,01, r = 0,38) og CX
3CL1 og GILZ endelig score (B, Spearman test,
P
0,0001, r = 0,59) var positivt korrelert i 54 EOC eksemplarer inkludert serøs (svarte firkanter) og ikke serøs (hvite firkanter) prøver. (C) dendrogram generert av hierarkisk agglomerative klyngeanalyse for de 54 EOC prøvene studert, mot alder ved diagnose, FIGO stadium, klasse, Ki-67, GILZ, CX
3CL1 og CXCL12 immunoreaktivitets nivåer. To grupper er identifisert, med lav (øverst) og høye (nederst) nivåer av proliferasjon. Aktuelle prøver som er merket med tall.
CXCL12, et kjemokin som produseres av eggstokkreft celler [6], har vært innblandet i kontrollen av proliferasjon i disse celler [27]. Som vi tidligere har vist i en kohort av 183 pasienter [28], CXCL12 immunoreaktivitets i kreftceller var heterogen, med score til 0 (ikke målbart produksjon) oppnådd i 16 pasienter og 5-7 (sterk immunoreaktivitets) oppnådd hos åtte pasienter i vår kohort av 54 pasienter. Det var ingen signifikant sammenheng mellom endelig score for CXCL12 og CX
3CL1, eller mellom endelig score for CXCL12, GILZ og Ki-67. En analyse av syv datasettene, inkludert alder ved diagnose: Figo stadium, gradering, GILZ, Ki-67, CX
3CL1 og CXCL12 immunoreaktiviteter, basert på en agglomerative hierarkisk clustering tilnærming avslørte to hovedklyngene, som vist ved den dendrogram som genereres fra den statistiske analysen (Figur 3C). De viktigste karakteristika som skiller de to store grupper, tilsvarende lave og høye nivåer av proliferasjon, er presentert i tabell 2. Som ventet fant CXCL12 produksjon ikke signifikant forskjellig mellom de to gruppene. I motsetning CX
3CL1 og GILZ immunoreaktivitetene i kreftceller var høyere for gruppen med høyere grad av spredning. Til tross for det forholdsvis lite antall pasienter, antall kreftformer ved FIGO trinn III og IV var signifikant høyere i høy spredning gruppe. Derimot, gjorde alder ved diagnose og grad ikke skiller mellom de to gruppene. Dermed ble høyere forekomst av spredning knyttet til oppregulering av GILZ og CX
3CL1 uttrykk.
GILZ oppregulerer CX
3CL1 uttrykk
Immunohistokjemiske data klart indikerte at GILZ nivåer i ondartede celler ble positivt korrelert med CX
3CL1 nivåer, noe som tyder på en mulig rolle for GILZ i å regulere CX
3CL1 produksjon. Vi testet denne hypotesen ved å bestemme mengden av CX
3CL1 mRNA og protein i pGILZ (overekspresjon GILZ) og CTRL (produsere lav mengde GILZ) BG1 celler. Som forventet, GILZ innhold (mRNA og protein) var signifikant høyere i pGILZ enn i CTRL kloner. Parallelle økninger i CX
3CL1 mRNA og protein ble avbildet på RT-PCR, IHC og Western blots (figur 4, A, B og C). I tillegg pGILZ cellene frigjøres større mengder av SCX
3CL1 enn kontrollcellene (Figur 4D). Ved hjelp av et Ab rettet mot det ekstracellulære domenet av CX
3CL1, western blot av lysater av BG1 celler behandlet med forbol-12-myristat-13-acetat (PMA), en proteinkinase C (PKC) aktivator, viste et fravær av 90 kDa-båndet svarende til full-lengde CX
3CL1. Motsatt denne behandlingen økt frigjøring av SCX
3CL1 i supernatanten. (Figur 4, C og D). Til sammen våre resultater tyder på at CX
3CL1 produksjon av eggstokkene epiteliale ondartede celler er oppregulert ved GILZ.
(A)
CX
3CL1
PCR signalintensitet i CTRL og pGILZ BG-1 celler ble kvantifisert ved densitometri med normalisering mot signalet for
SS-aktin
; Resultatene er uttrykt som
CX
3CL1 /ß-aktin
forholdstall. Ett eksperiment representant av tre. (B) farging for CX
3CL1 på CTRL og pGILZ BG1 cytocentrifuged celler. Forstørrelse x 40. (C) Total cellulær proteinekstrakter av CTRL og pGILZ BG1 celler dyrket med eller uten 100 ng /ml PMA i 24 timer ble analysert ved western blotting med en spesifikk Ab å gjenkjenne det ekstracellulære domene av CX
3CL1. CX
3CL1 nivåer ble kvantifisert ved densitometri, med normalisering mot signal for ß-aktin; Resultatene er uttrykt som CX
3CL1 /ß-aktin forholdstall. Ett eksperiment representant for tre. (D) histogrammer viser frigjøringen av SCX
3CL1 inn i supernatanten av celler behandlet eller ikke med PMA, som målt ved ELISA. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. *
P 0,05
, fravær kontra nærvær av PMA og
#
P 0,05
, CTRL versus pGILZ BG1 celler (unpaired
t
test)
CX
3CL1 øker ondartet cellevekst
Vi viste at SCX
3CL1 er utgitt av eggstokkreft celler fra utstøtingen av membranbundne kjemokin som tyder på at SCX
3CL1 kan være en aktiv komponent av tumoral mikromiljøet. Her spurte vi om dette chemokin har en innvirkning på tumorcellevekst, som foreslått av korrelasjon av CX
3CL1 og Ki-67 immunostainings i EOC prøver. Dette proliferativ virkning kan resultere fra en autokrin virkning av CX
3CL1, som er avhengig av ekspresjonen av sin unike reseptor, CX
3CR1 [8]. Vi oppdaget
CX
3CR1
mRNA ved konvensjonell RT-PCR ved den forventede størrelse (340 bp) i alle EOC prøvene som ble testet (n = 14) og i de tre EOC cellelinjer, BG1, og SKOV3 OVCAR3. Flow-cytometri analyserer videre avdekket membran CX
3CR1 uttrykk i både CD45
+ og CD45
– celler av ondartede kreftprøver. I CD45
– fraksjon, som er sterkt anriket på maligne epiteliale ovarieceller, prosentandelen av CX
3CR1
+ celler varierte fra 20% til 95% (figur 5A). I BG1 celler, steady-state nivå av membran CX
3CR1 uttrykk var svak ( 10% av totalt antall celler) under basale forhold (figur 5B). Interessant, brøkdel av CX
3CR1
+ -celler ble markert øket ved sur behandling, en prosess som er kjent for å dissosiere liganden fra dens reseptor. På en annen side, å redusere konsentrasjonen av FBS fra 10% til 1% i kulturmedium førte til økt ekspresjon av membran CX
3CR1 i BG1 celler (figur 5C). I kontrast, nivået på overflaten CX
3CR1 var lavere i pGILZ celler som produserer større mengder av SCX
3CL1 enn CTRL celler. Basert på disse funnene, brukte vi CTRL BG1 celler dyrket i medium supplert med 1% FBS å måle proliferativ effekt av rekombinant humant (rh) CX
3CL1 etter [
3H] -tymidin inkorporering. Resultater fra ni uavhengige eksperimenter viste at rhCX
3CL1 omtrent doblet frekvensen av celledeling etter 24 timer behandling (Figur 6A). Denne respons ble opphevet ved tilsetning av en CX
3CL1 analog med et modifisert N-terminus som binder seg til CX
3CR1 og virker som en antagonist (figur 6B) [29]. Disse resultatene viser en proliferativ virkning av eksogene CX
3CL1 gjennom sin binding til CX
3CR1. Vi neste undersøkt om endogen CX
3CL1 stimulerer tumor celleproliferasjon. For dette formål pGILZ BG1 celler, som genererer store mengder av endogen CX
3CL1, ble behandlet med CX
3CL1 analog fornyet hver 24 time i 72 timer. Under disse betingelser, ble frekvensen av celleproliferasjon markert redusert, underliggende en rolle for endogen CX
3CL1 ved regulering av tumorcelleformering (figur 6C).
(A) Nivåer av CX
3CR1 og av pan-blodkreft markør CD45 ble bestemt ved flowcytometri i 2 nylig dissosierte prøver av EOC prøver. Tall tyder på frekvenser av CX
3CR1
+ CD45
– celler. (B) Representative FACS profiler for CX
3CR1 nivåer i BG1 celler. Venstre, overflate uttrykk for CX
3CR1 henhold basale forhold; midten, overflate uttrykk for CX
3CR1 i celler etter surt behandling; rett, uttrykk for CX
3CR1 i permeabilized celler. Tallene angir prosentandel av CX
3CR1
+ celler (gjennomsnitt ± SEM) for 3 uavhengige eksperimenter. (C) histogrammer viser fluorescens-intensiteten av CX
3CR1 flekker på overflaten av CTRL BG1 celler dyrket i nærvær av 1% eller 10% FBS, og av CTRL og pGILZ BG1 celler dyrket i nærvær av 1% FBS. Tallene angir prosentandelen av CX
3CR1
+ celler for en representant eksperiment av tre.
(A-C) sprednings ble målt etter [
3H] -tymidin inkorporering (A) i CTRL-celler inkubert med eller uten 10 ng /ml rhCX
3CL1 i 24 timer, 9 uavhengige eksperimenter. Histograms representerer betyr ± SEM, paret t-test,
**
P
0,001; (B) i CTRL-celler inkubert med eller uten 10 ng /ml rhCX
3CL1 i 24 timer, i nærvær eller fravær av 10 pg /ml CX
3CR1 antagonist; hvert symbol representerer en enkelt prøve kjøre i tre eksemplarer, linjene representerer middelverdier, *
P
0,05,
t
test, en representant eksperiment av tre; (C) i pGILZ-celler med og uten behandling med 10 ug /ml CX
3CR1 antagonist erstattet hver 24 time i 72 timer, hvert symbol representerer en enkelt prøve løp i tre paralleller, linjene representerer middelverdier, *
P
0,05,
t
test, en representant eksperiment med 3. (D) Total cellulær proteinekstrakter av CTRL celler dyrket i nærvær og fravær av 10 ng /ml rhCX
3CL1 analysert ved hjelp western blotting med spesifikke Abs. pakt nivåene ble kvantifisert ved densitometri, med normalisering mot signalet for total AKT. Resultatene er uttrykt som Pakt /AKT forholdstall. En blot, representative av tre utført, er vist.
AKT hyperaktive blir ofte observert i eggstokk-kreft og er relatert til kontroll av celleproliferasjon i EOC [30], [31] [32] – [33]. Nivåer av Pakt, som er den aktive AKT form, var høyere i rhCX
3CL1-behandlede BG1 celler (Figur 6D). Disse resultatene tyder sterkt på at den proliferative effekten av CX
3CL1 /CX
3CR1 par er forbundet med AKT aktivering. GILZ tidligere er blitt identifisert som en proliferativ faktor aktiverende AKT i EOC [25]. For å bekrefte at CX
3CL1 handling innebærer AKT aktivering
in situ
, målte vi Ki-67 og Pakt score på EOC prøver scoret 0 for GILZ og enten produsere eller ikke CX
3CL1. Som vist i tabell 3, spredning og AKT-fosforylering var høyere i prøver som produserer CX
3CL1. Til sammen er disse funnene tyder på at den proliferative effekten av CX
3CL1 på eggstokkene epiteliale ondartede celler er sammenhengende til CX
3CR1 bindende som aktiverer AKT.
In vivo
virkningen av GILZ overekspresjon
til slutt undersøkte vi effekten av GILZ og CX
3CL1 på tumorvekst
in vivo
ved å bruke en mus subkutan xenograft modell. BG1 celler enten overekspresjon GILZ (pGILZ) eller ikke (CTRL) ble injisert subkutant i atymiske nakne mus og tumorvekst ble fulgt i 35 dager. De gjennomsnittlige tumorvolumer er representert grafisk i figur 7A. Svulstene utviklings fra pGILZ celler hadde betydelig større volumer enn de som utvikler fra CTRL, til enhver tid punkt. Western-blot av ekstrakter xenograft og immunfarging viste parallelle økninger i GILZ og CX
3CL1 proteinnivåer (figur 7, B og C). Dermed
GILZ
overekspresjon er klart assosiert med høyere nivåer av CX
3CL1 produksjon i tumorer, noe som resulterer i høyere forekomst av spredning og tumorvekst.
(A) pGILZ eller CTRL BG1 celler (40 x 10
6 celler /ml) ble injisert subkutant inn i høyre flankene av nakne mus. Tumorstørrelse ble målt hver 5. dag, i 35 dager (N = 3 mus per gruppe). Tumor volum [mm
3] ble beregnet som følger: (lengde [mm]) × (bredde [mm])
2 × 0,5 **
P
0,001 (unpaired
t
test). (B) Total cellulær proteinekstrakter av xenopodet tumorer ble analysert ved western blotting med spesifikk Abs. CX
3CL1 og GILZ nivåene ble kvantifisert ved densitometri, med normalisering mot signal for ß-aktin; Resultatene er uttrykt som CX
3CL1 eller GILZ /SS-aktin forholdstall. En klatt representant for tre utført vises. (C) Serial deler av pGILZ og CTRL xenopodet svulster ble farget for CX
3CL1, GILZ og Ki-67. Negativ kontroll: ingen merking ble oppdaget da hver primær Ab ble utelatt. Forstørrelse x 40.
Diskusjoner
I denne studien, avduket vi at CX
3CL1 ble konstitutivt produsert i EOC og undersøkt hvilken rolle denne chemokin i tumorvekst. Produksjonen av denne chemokin innledes malignitet i OSE, og ble også funnet i egglederne av friske kvinner og godartede svulster. Immunhistokjemi analyser viste at CX
3CL1 produksjon i EOC prøver ble korrelert med nivåer av Ki-67 og GILZ, to markører for spredning i maligne eggstokkene epitelceller. Hierarkisk clustering analyse identifisert to store klynger, med høye og lave nivåer av spredning, ulik i GILZ og CX
3CL1 nivåer.
In vitro
fører GILZ over til en økning i CX
3CL1 produksjon i BG1 celler. CX
3CL1 øker BG1 celleproliferasjon via sin reseptor, CX
3CR1, og en parallell økning er observert i pakt nivåer. I xenopodet mus, overekspresjon av både GILZ og CX
3CL1 er assosiert med hurtigere tumorvekst. Disse resultatene markere et forhold mellom GILZ og CX3CL1 som en viktig regulator av ondartet cellevekst og tumorvekst.
Ifølge nyere hypoteser om opprinnelsen og histogenesis av EOC, type I svulster, som antas å omfatte alle større histotypes, stammer fra OSE, som ble tradisjonelt ansett for å være kilden til neoplastisk transformasjon. I motsetning til type II tumorer, som er tenkt består nesten utelukkende høyverdige serøs karsinom, antas å oppstå fra den distale delen av egglederne [34] – [36]. Både OSE og egglederne er for tiden antatt å være mulige kilder til neoplastisk EOC, og begge er avledet fra det embryoniske Mullerian kanalen [37]. CX
3CL1 har blitt oppdaget i den menneskelige endometrium [38] og egglederne [39]. Vi har også oppdaget CX
3CL1 i OSE, videre indikerer at produksjonen av CX
3CL1 av epitelovarialcancer celler forut tumorigenesis. CX
3CL1 ble også påvist i gunstige og borderkreftceller, noe som tyder på at produksjonen ikke er assosiert med malignitet.
Eggstokk epiteltumorer er morfologisk heterogene og er klassifisert av patologer til serøs, klarcellet, endometrioid og mucinkjertler subtyper på grunnlag av histopatologiske undersøkelsen. Hver undertype er karakterisert ved en spesifikk mRNA-profil, genetiske risikofaktorer og molekylære egenskaper [34] [40] – [41], som tyder på at ovarialt karsinom er en heterogen sykdom [42]. Til tross for dette heterogenitet, fant vi ingen signifikant sammenheng mellom CX
3CL1 nivåer og histologiske type i vår serie, som inkluderte representative eksemplarer av alle de fire viktigste histologiske typer EOC. Som GILZ og CXCL12, CX
3CL1 er allment uttrykt i EOCs og sin tilstedeværelse reflekterer ikke den morfologiske heterogenitet av EOC [25] [28].
chemokiner, inkludert CXCL12, er produsert lokalt i eggstokkene tumorer og bidra til svulstens mikro [5] – [6]. Her identifiserer vi CX
3CL1 som en annen del av EOC mikromiljøet. Epitelceller fra maligne ascites, vevsprøver og fra tre eggstokkreft cellelinjer, nemlig BG1, OVCAR3 og SKOV3, vises farging for CX
3CL1. CX
3CL1 ble begrenset til cytoplasma og var fraværende fra cellekjerner. Cellene inneholdt CX
3CL1 med en molekylvekt på 90 kDa svarende til membranform av CX
3CL1, hvorfra den oppløselige formen blir utledet ved å belyse [8]. Produksjonen av SCX
3CL1 i kultursupernatantene parallell at av membranbundne form, noe som tyder på at produksjonen av SCX
3CL1 i EOC mikromiljø ble forsterket i svulster med sterk CX
3CL1 immunoreaktivitets. Interessant, den lokale frigjøring av CX
3CL1 kan også avhenge av CXCL12, stilles av epitel eggstokk maligne celler i EOC og er kjent for å regulere spaltning av CX
3CL1 fra nerveceller [43]. Vi kan ikke utelukke at CXCL12 stimulerer metalloproteinaser involvert i CX
3CL1 spalting i EOCs, som det gjør i nevronale kulturer. Faktisk er videre undersøkelser av dette aspektet som kreves for å konkludere.
Intensiteten av CX
3CL1 flekker og brøkdel av tumorceller farget for CX
3CL1 var variabel i vår kohort med 54 pasienter med avansert primære EOC. Denne heterogenitet i produksjon av CX
3CL1 ble positivt korrelert med GILZ nivåer.
