Abstract
Flere unike biologiske funksjoner av HIV-1 VPR gjøre det til en potensielt kraftig agent for anti-kreft terapi. Først hemmer VPR celleproliferasjon ved induksjon av cellesyklus G2 arrest. For det andre induserer apoptose det gjennom flere mekanismer, som kan være av betydning da det kan være i stand til å overvinne apoptotisk motstand som oppvises av mange kreftceller, og, til slutt, VPR selektivt dreper raskt voksende celler i et p53-uavhengig måte. For å demonstrere potensialet nytten av VPR som en anti-kreft agent, gjennomførte vi proof-of-concept studier
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene fra våre foreløpige studier vist at VPR induserer cellesyklus G2 og apoptose i en rekke krefttyper. Videre er de samme VPR virkninger kan også påvises i enkelte kreftceller som er resistente mot anti-kreft-medikamenter slik som doxorubicin (DOX). For ytterligere å illustrere den potensielle verdien av VPR i tumorvekstinhibering, vi innført en DOX-resistent neuroblastom modell ved å injisere SK-N-SH-celler i C57BL /6N og C57BL /6J-scid /scid-mus. Vi antok at VPR er i stand til å blokkere celleproliferasjon og indusere apoptose uavhengig av legemiddelresistens status av tumorene. Faktisk produksjon av VPR
via
adenovirus levering til neuroblastom celler forårsaket G2 og apoptose i både narkotika naive og DOX-resistente celler. I tillegg pre-infeksjon eller intratumoral injeksjon av
VPR
-expressing adenovirus partikler i neuroblastom svulster i SCID-mus markert hemmet tumorvekst. Derfor VPR kunne muligens bli brukt som en supplerende viralt terapeutisk middel for selektiv hemning av tumorvekst i anticancerterapi, spesielt når andre behandlinger slutte å virke
relasjon:. Zhao RY, Liang D, Li G, Larrimore CW , Mirkin BL (2010) Anti-kreft effekt av HIV-1 Viral Protein R på doxorubicin Resistant neuroblastom. PLoS ONE 5 (7): e11466. doi: 10,1371 /journal.pone.0011466
Redaktør: Fatah Kashanchi, George Mason University, USA
mottatt: 6 mai 2010; Godkjent: 08.06.2010; Publisert: 07.07.2010
Copyright: © 2010 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Chicago Medical Research Council, Illinois Department of Public Aid og US Department of Human Health Services og University of Maryland Medical Center (til Ryz). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om det har vært store fremskritt i kreftbehandlingen i løpet av de siste tiårene, er det fortsatt eksisterer en rekke store hindringer som begrenser bruken av noen av disse nye behandlingsformer. De hindringer som presenteres innbefatter, men er ikke begrenset til, 1) tjener side-effekt på grunn av ikke-spesifikk cytotoksisitet av de behandlinger, 2) utvikling av medikamentresistens, og 3) utvikling av tumorresistens til apoptose. Derfor vil en hvilken som helst anti-cancer middel som kan enten unngå eller overstyre ulempene ved noen av de eksisterende anti-kreft-behandling være av stor betydning for den videre utforming av anti-kreftterapi. Ideelt sett bør et effektivt middel mot kreft har følgende egenskaper. Det bør være i stand til å 1) blokkere bare av unormal cellevekst som et resultat av tap av normal cellesyklusregulering, f.eks cellulær sjekkpunkt mutasjoner; 2) indusere varig cellesyklus arrest som kan føre til celledød eller apoptose; 3) indusere spesifikk celledrepende til kreftceller med minimal eller ingen effekt på normale celler; 4) være i stand til å overstyre apoptotisk motstand, et typisk trekk ved mange kreftceller; 5) har celledrepende effekt uavhengig av vanlige onkogene mutasjoner som for eksempel p53; 6) gi samme arrestere og celledød effekter i legemiddelresistente celler, dvs. når andre kjemoterapeutiske stoffet svikter; og 7) absorberes lett eller utskilt av cellene ved den opprinnelige bioaktive form.
viralt protein R (VPR) laget av det humane immunsviktvirus type 1 (HIV-1) kan potensielt oppfylle mange av de ovennevnte krav. Fordi, 1) VPR blokkerer proliferasjon av kreftceller etter induksjon av cellesyklus G2 rest [1], [2], og dette arrestere effekten er uavhengig av de klassiske DNA sjekkpunkter [3], [4]; 2) VPR induserer apoptose gjennom flere veier som ikke er avhengig av verts cellulære responser [5], [6]; og 3) VPR selektivt dreper raskt voksende celler i et p53-uavhengig måte [7], [8], som tyder på VPR-indusert celledød kan tilby mer selektivt kraft i å drepe kreftceller enn normale celler, og dette cytotoksiske egenskap bør være effektiv i mange av kreft, hvor p53-genet er mutert. 4) VPR i seg selv er ikke smittende; 5) VPR er et løselig protein som også er naturlig transdusert. Proteinets naturlige tranducing evne gjør at den kan tas opp og skilles ut av cellene uten hjelp av en hvilken som helst spesiell levering kjøretøy [9]; og 6) VPR er et virion-tilknyttet protein. Dette gjør mulig levering av VPR protein for å målrette bestemte svulster som nevroblastom eller glioma bruker spesialdesignet virale vektorer [For anmeldelser, se [10]].
HIV-1 VPR er et lite tilbehør viral protein med en midlere lengde på 96 aminosyrer og en beregnet molekylvekt på 12,7 kD. VPR er et unikt protein som viser ingen kjent homologi til andre aktuelle cellulære proteiner. En tertiær struktur av VPR foreslått på grunnlag av NMR-analyse består av en α-heliks-sving-α-heliks domene i den amino-terminale halvdel mellom aminosyrene 17 til 46 og en lang α-heliks fra aminosyrer 53 til 78 i den karboksyl-terminale halvdel [11]. Disse tre a-helikser er foldet rundt en hydrofob kjerne i en struktur som tillater interaksjon mellom VPR og andre forskjellige cellulære proteiner [12]. Samspillet mellom VPR og cellulære proteiner understreker de mangefasetterte roller i sin innblanding med vertscellefunksjoner som beskrevet ovenfor [For anmeldelser, se [8], [13], [14]].
En av de vanskeligste formene for kreft er neuroblastom. Denne dødelige sarkom består av ondartede neuroblast celler som enten vises i det autonome nervesystemet eller i binyremargen. Neuroblastom regnes som en type neuroepithelial svulst som hovedsakelig påvirker spedbarn og barn opp til 10 år. Det er en av de mest vanlige faste tumorer i tidlig barndom. Svulsten typisk kommer i binyremargen, med de mest vanlige område blir magen (nær binyrene), men det kan også bli funnet i huden, bryst, nakke, bekken, eller andre områder. Selv om det er enighet om at genetiske mutasjoner enten under fosterutviklingen eller de som har blitt arvet føre til neuroblastom, den eksakte årsaken til disse genetiske mutasjoner er fortsatt ukjent. Behandlingstilbud som er tilgjengelige i hovedsak omfatte kirurgi, cellegift, strålebehandling og benmargstransplantasjon. Men til tross for ulike behandlingsmuligheter, er sykelighet av denne kreftformen fortsatt svært høy og er for tiden nær 100%. Den primære årsaken til en slik høy sykelighet er fordi de fleste pasienter har utbredt sykdom ved diagnose og disse svulstene utvikler rask motstand mot kjemoterapi og strålebehandling.
En hovedtilnærming for kreftbehandling innebærer ofte kjemoterapi. Kjemoterapi virker ved å drepe raskt fordelt celler, som er en viktig egenskap av kreftceller. Dessverre, utvikler neuroblastom motstand raskt til kjemoterapi og gjør behandlingen vanskelig. Det er flere mulige årsaker til kjemoterapi motstand, de inkluderer 1) celler som ikke er drept av kjemoterapi mutere og bli motstandsdyktig, 2) proteiner som transporterer narkotika til kreftceller slutter å fungere, 3) cellene kan begynne å pumpe narkotika ut av cellen som fort de kan gå inn i cellen, 4) gener som utløser en overproduksjon av proteiner som gjør et stoff ineffektiv kan bli forsterket, og 5) kreftceller kan begynne å reparere DNA pauser forårsaket av behandlingen. Med tanke på hurtig legemiddelresistens av neuroblastom og et begrenset antall medisiner er tilgjengelige for behandling av nevroblastom, er det et stort behov for en ny behandling som kunne fortsette å eliminere maligne celler når disse cellene utviklet resistens mot andre anticancer legemidler. En mulig ny løsning på dette dilemmaet er potensialet bruk av HIV-1 VPR med sin unike biologiske funksjonene som er beskrevet ovenfor.
For å demonstrere potensialet nytten av VPR som en anti-kreft agent, har vi gjennomført proof- of-concept foreløpige studier
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene fra våre studier viser at VPR induserer cellesyklus G2 og apoptose i et stort utvalg av krefttyper. Vi har videre demonstrert at de samme VPR virkninger kan også påvises i kreftceller som er resistente mot anti-kreft-medikamenter slik som DOX. Videre har vi vedtatt en neuroblastom musemodellsystem som tillater oss å vise den undertrykkende effekt av VPR på tumorvekst
in vivo
.
Resultater
VPR induserer cellesyklus G2 arrest i ulike kreftceller
VPR har blitt observert å indusere cellesyklus G2 arrest i et bredt utvalg av eukaryote celler som spenner fra fisjons gjær til menneskeceller [15], [16]. Disse observasjonene er tankevekkende at svært konservert cellulære aktiviteter i eukaryote celler er faktisk påvirket av VPR. I denne studien ble det adenovirus infeksjoner system valgt å måle den potensielle effekten av HIV-1 på cellesyklus G2 induksjon i ulike krefttyper (tabell 1) som vi tidligere beskrevet [17] – [19]. De adenovirale systemer gjør det mulig for nesten 100% av cellene til å bli infisert av transduksjon og påvisning av VPR effekter er i stand til å bli observert så tidlig som i 5 timer [18]. Ved hjelp av dette systemet, testet vi den potensielle effekten av VPR på ulike typer kreft cellelinjer. Disse krefttypene omfatter cervikal (HeLa), bryst (MCF-7), eggstokk (A2780), og T- eller B-celle-lymfomer (Jurkat og SU-DHL-4). Som vist i Figur 1 og Tabell 1, VPR indusert cellesyklus G2 arrest i alle kreftcelletyper som ble testet med unntak av at bare delvis G2 skift ble observert i MCF-7-celler (figur 1 – midten). Den funksjonelle relevansen av denne delvise G2 induksjon er antatt i diskusjonen. I tillegg vises det G2 induksjon for å være uavhengig av p53-genet status, som er forenlig med en rekke tidligere rapporter [7], [20]
Alle cancercellelinjer (se tabell 1 for detaljer;. Bare 3 cellelinjer er vist her som eksempler) ble dyrket som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Celler ble transdusert med Adv eller Adv-VPR med MOI på 1,0. Cellene ble høstet 48 timer etter infeksjon (
p.i.
), Ble cellene deretter fremstilt som beskrevet i Materialer og Metoder. Cellulært DNA-innhold ble analysert ved strømningscytometri FACScan (Becton Dickinson) som vi tidligere beskrevet [4], [19]. Cellesyklus profiler ble modellert ved hjelp ModFit programvare (Verity Software House, Inc.).
VPR induserer cellesyklus G2 arrest og celledød uavhengig av legemiddelresistens status doksorubicin
doxorubicin (adriamycin, hydroxydaunorubicin, DOX) er et anticancer medikament som har vært brukt i behandling av en rekke kreftformer, inkludert bryst, mage, lunge, ovarie og blærekreft samt leukemi, mange typer av kreft, og bløtvev sarkomer. Den nøyaktige molekylære mekanisme av DOX er ikke blitt godt etablert. Imidlertid er det kjent å intercalate DNA og avbryter DNA-replikasjon og dermed fører til celledød [21]. Selv om DOX fortsetter å være en viktig del av førstelinjeledere anti-kreft terapi i behandling av mange typer svulster, utvikling av svulst resistent til DOX og andre kreft regimer er et stort hinder for å oppnå vellykkede anti-kreft behandlinger [22], [23]. For å undersøke om VPR kan blokkere celledeling av G2 arrest og drepe disse anti-kreft narkotika-resistente kreftceller, uttrykte vi
VPR
genet
via
Adv-VPR transduksjon i tre par narkotika naive (WT) og DOX-resistente (DOX-R) kreftceller. De er menneskelige neuroblastom (SK-N-SH), osteosarkom (SaOS2), og bryst adenokarsinom (MCF-7). Disse DOX-resistente cellelinjer ble generert ved kontinuerlig inkubasjon av foreldrecellelinjer med trinnvise økninger på DOX konsentrasjoner i området fra 10
-9 til 10
-6 M i løpet av en periode på 3 til 6 måneder. Detaljert fremgangsmåte for å generere disse DOX-resistente cellelinjer er blitt beskrevet tidligere [24]. Som vist i tabell 1, bevirker ekspresjon av VPR cellevekstarrest i alle celler som ble testet uavhengig av legemiddelresistente status til DOX. Videre måling av celleproliferasjon og levedyktighet ved MTT-analysen, som metaboliserer tetrazoliumsalt (MTT), viste liten celleproliferasjon eller levedyktige celler igjen 5 dager etter Adv-VPR transduksjon (figur 2); Tilsvarende bestemmelse av cellemembranintegritet ved trypan blå, som flekker bare døde celler, indikerte at VPR overfører meget potent cytotoksisitet for de celler (figur 2).
Tre par medikament naive (WT) og DOX-resistente (DOX-R) cancerceller ble testet for VPR-induserte G2 rest (tabell 1) og celledød. Disse kreftcellelinjer ble dyrket som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Celler ble transduced med Adv eller Adv-VPR med MOI på 2,5. Cellelevedyktigheten ble bestemt enten ved trypanblått eksklusjon assay, som identifiserer døde celler (øverste figur) eller ved MTT-assay for å måle celleoverlevelse (nederste figur). Celler ble undersøkt 5 dager
p.i
intials. WT, hvete; Dox-R, doxorubicin-resistente; 1, Mock; 2, Adv og 3, Adv-VPR.
VPR induserer doseavhengig celledød og apoptose i DOX-naive og resistente neuroblastom celler
For ytterligere å forstå VPR-indusert celledreping i narkotika naive og motstandsdyktig kreftceller og for å forberede for en
in vivo
studie av potensialet VPR effekt på tumorvekst i en musemodell, har vi besluttet å fokusere vår studieinnsats på neuroblastom. Neuroblastom ble valgt som modellsystem fordi neuroblastom er en av de mest vanlige faste tumorer i tidlig barndom vanligvis finnes i babyer eller små barn. En annen grunn til å velge den neuroblastom modellen er at den menneskelige neuroblastom xenograft mus modell systemet er godt etablert [25], [26].
Før gjennomføre
in vivo
musestudier, må vi først bestemt potensielle doseavhengige reaksjoner fra VPR-indusert celledreping i både villtype (WT) og medikamentresistente (DOX-R) SK-N-SH neuroblastom celler. Den trypanblått og MTT-analyser ble brukt for å måle cellevekst og levedyktighet 5 dager etter Adv kontroll og Adv-VPR transductions. Oppsummering av disse resultater er vist i figur 3A-en. Mens økningen av mangfoldet av infektivitet (MOI) på Adv kontroll ikke forårsake signifikant celledød, ble en klar dose-avhengig celledreping er vist i både WT og DOX-R-celler som indikert ved trypanblått-analysen. Ved lave enden, MOI 1.0 forårsaket ca 40-80% celledød; mens alle cellene (100%) ble avlivet ved MOI 10,0. MTT-analyse viste den tilsvarende doseavhengig reduksjon av celle proliferasjon og overlevelse av celler, og Western blot-analyser bekreftet at VPR ble produsert i de Adv-VPR-infiserte celler (figur 3A-b). For ytterligere å forstå dynamikken i VPR effekt på celleproliferasjon ble celleproliferasjon og levedyktighet målt over tid (opp til 5 dager) med MOI 2.5. Som vist i figur 3B, mock eller Adv-infiserte celler viste normal celleproliferasjon og nådde et platå etter 3 dager med lite eller ingen celleproliferasjon påvises i Adv-VPR infiserte celler. Den reduserte metabolsk aktivitet over tid foreslått øket celledød over tid. For ytterligere å evaluere måten VPR-indusert celledreping i neuroblastom-celler (med eller uten VPR dreper disse cellene ved apoptose eller annen mekanisme) potensiell caspase-3 spaltning virkning ble målt som en indikasjon på apoptose. For å skille VPR-indusert celledød fra dets virkning på cellesyklusen, ble en VPR mutant (F34I) som fører til G2 induksjon, men ikke induserer celledød også inkludert i denne studien som en kontroll [18], [27], [28] . Etter adenovirus infeksjoner, status for caspase-3 ble overvåket fra 6 til 36 timer med Western blot analyse ved hjelp av antistoffer mot total caspase-3 (Figur 3C, topp kjørefelt) eller spesifikt spaltes caspase-3 (Figur 3C – midten kjørefelt). No caspase-3-spaltning ble påvist i Adv-F34I VPR-infiserte celler (indikert med «m») over hele testperioden; caspase-3 cleavage ble tydelig sett fra 24-36 timer i celler som var infisert med villtype (angitt med «w») VPR.
A. VPR induserer doseavhengig celledød i narkotika-naive og resistente SK-N-SH celler. en. Nivå av VPR-indusert celledød ble undersøkt ved å infisere DOX-naive og resistente SK-N-SH celler ved hjelp av økt MOI av Adv eller Adv-VPR virus. Celledød ble målt ved å bestemme cellemembranintegritet og spredning ved hjelp av Trypan blå strai (venstre) eller cellelevedyktigheten ved MTT-assayet (til høyre). Celler spredning og levedyktighet ble undersøkt 5 dager
p.i
. b. VPR proteinproduksjon ble bekreftet ved Western blot-analyse. Legg merke til at det er svært vanskelig å oppdage VPR protein ved lav MOI. Vellykket infeksjon av Adv-VPR ble bekreftet ved forstørrede kjerner av celler som tidligere rapportert [43]. B. VPR induserer celledød over tid i narkotika naive og resistente SK-N-SH celler. Begge legemiddel-naive og resistente SK-N-SH-celler ble behandlet på samme måte som A. Bare MOI2.5 ble anvendt her. C. VPR induserer apoptose i narkotika-naive og motstandsdyktig SK-N-SH celler. Caspase-3-spalting ble overvåket inntil 36 timer. Initialer: Csp3, caspase-3; cl-Csp3, kløyvde caspase-3; m, Adv-VprF34I; w, Adv-VPR.
Sammen resultatene av disse
in vitro
studier støtter ideen om at VPR blokker neuroblastom celle spredning av cellesyklus G2 arrest og celledød
via
apoptose. Enda viktigere, overfører VPR disse cytotoksiske effekter på neuroblastom-celler på et sammenlignbart nivå uavhengig av deres medikamentresistens status.
In vivo
virkning av VPR på neuroblastom tumorvekst i en musemodellsystem
neste undersøkt VPR effekt på tumorvekst av neuroblastom-celler i den C57-SCID-musemodell system [29], [30]. To ulike tilnærminger ble brukt til å introdusere VPR i svulstene, dvs. pre- viral transduksjon før celle inokulasjon i mus eller post-intratumoral injeksjon. For pre-transduksjon, villtype og DOX-resistent SK-N-SH ble injisert med Adv, Adv-VprF34I og Adv-VPR
s.c.
I venstre flanke av C57-SCID mus. Tumorstørrelsen ble målt etter 7 dager. Slutttumorstørrelsesmåling var 26 dager etter transduksjon og musene ble deretter ofret for videre analyse. Som vist i figur 4A, en gjennomsnittlig tumorstørrelse på ca.. 2 cm ble tydelig sett i mus som ble inokulert med WT eller DOX-resistente SK-N-SH celler 26 dager etter transduksjon. Lignende tumor størrelser ble også observert i Ad-F34Ivpr infiserte mus. Derimot ble veldig små knuter på injeksjonsstedet sees i Ad-VPR-omsatte mus, noe som tyder uttrykk for VPR i disse cellene forhindret deres vekst i C57-SCID mus. For å minimalisere potensiell variant av individuelle mus, ble individuelle mus injisert med alle de tre transduse virus
s.c.
I mageområdet, som vist i figur 4B. I likhet med hva vi har observert hos mus inokulert med enkel behandling, omtrent lik størrelse av svulster ble sett på nettstedene til Adv eller Adv-F34Ivpr injeksjoner, mens lite eller ingen knuter ble sett på nettstedene til Adv-VPR injeksjoner.
Undertrykkelse av neuroblastom tumorvekst med VPR er demonstrert her enten ved pre-transduksjon av Adv-VPR (AB) eller post-intratumoral injeksjon (C). For pre-transduksjon, ble villtype (WT) eller DOX-resistente SK-N-SH dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS ved 37 ° C med en 95% luft /5% CO
2 atmosfære. Friske celler ble først dyrket i en 12-brønners plate i 36 timer og adenoviral transduksjon ble foretatt 5 timer før celle inokulering med MOI på 2,5, noe som ble bestemt empirisk. Cellene ble deretter behandlet med Trpsin- EDTA, resuspendert i DMEM og vasket med PBS 3 ganger. Endelige Cellene ble suspendert i DMEM for inokulering. Omtrent 2 x 10
6 celler i volum på 100 ul ble injisert
s.c.
I den venstre flanke av C57-SCID-mus. 3-4 mus ble injisert for hver behandling. Disse behandlingsgruppene inkluderer Adv viruskontroll, Adv-VPR og Adv-F34IVpr. Den F34IVpr mutant ble her brukt som kontroll, siden en enkelt aminosyre forandring av aminosyre 34 fra Fenylalanin (F) for å Isoleucin (I) gjengir VPR ute av stand til å forårsake apoptose (figur 3C), men gjør det mulig for cellesyklus for å angi en forlenget G2 fase [18], [27], [28]. Svulsten størrelse ble målt hver 7. dag ved å måle to vinkelrette Tumordiametere hjelp calipers. Endelig tumormåling var 26 dager etter transduksjon og musene ble deretter ofret for videre analyse. For intra-angrepne injeksjon av VPR, WT og DOX-R SK-N-SH neuroblastom-celler ble fremstilt i det vesentlige på samme måte som beskrevet ovenfor. 200 pl av Adv, Adv-VPR eller Adv-F34Ivpr ble deretter injisert diskre, 3-ganger inn i tumorene 2 uker etter inokulering celle med en viruskonsentrasjon på 1,012 /ml. Tumorstørrelsen ble målt etter 7 dager. Endelig måling av tumorstørrelsen var 39 dager etter injeksjon, og musene ble deretter ofret for videre analyse. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og resultatene av disse forsøk med gjennomsnittlig tumorstørrelse med standardavvik (SD) er presentert i tabell 2.
En av de potensielle argumentene om resultatene som genereres fra pre-transduksjon er som uttrykk for VPR
in situ
kan raskt drepe SK-N-SH celler og dermed forebygge tumordannelse og dermed testing av VPR effekt på selve tumorvekst. For å omgå dette problemet, ble en alternativ post-intratumoral injeksjon metode som brukes. WT og DOX-R SK-N-SH neuroblastom-celler ble preparert og inokulert i det vesentlige på samme måte som beskrevet ovenfor. Den Adv, Adv-VPR eller Adv-F34Ivpr ble deretter injisert diskret 3 ganger i svulstene 2 uker etter celle inokulasjon. Tumorstørrelsen ble målt etter 7 dager. Endelig måling av tumorstørrelsen var 39 dager etter injeksjon, og musene ble deretter ofret for videre analyse. Statistiske tester ble gjennomført for å evaluere potensielle forskjeller i tumorstørrelse med samme eller i løpet av hele eksperimentperioden. De endelige resultatene er presentert i tabell 2. Selv om VPR redusert 44,1 ± 11,8% av tumorvekst i villtype SK-N-SH tumorer ved uke etter en intratumoral injeksjon, statistiske analyser indikerte en
t
– verdi på 2,35 (p = 0,10), dvs. ingen statistisk forskjell; på samme måte, ble det ikke tumorvekst forskjell sett i Dox-R tumorer ved uke 1. Imidlertid ble det ikke observert statistiske signifikante forskjeller både i tumorene villtype og Dox-R ved uke 2 og uke 3. Særlig i de WT neuroblastom cellene , VPR redusert 64,2 ± 6,7% eller 76,4 ± 5,9% av tumorvekst ved uke 2 eller 3 etter intratumoral injeksjon, henholdsvis; på samme måte, en tilsvarende prosent av reduksjon (67,1 ± 4,5% eller 75,6 ± 1,8%) ble også påvist i DOX-R-celler i den samme tidsperioden. Sammenligning av tumorvekst under hele forsøksperioden ved å bruke veide gjennomsnittlige summer [31] foreslåtte generelle forskjeller i tumorvekst mellom annonsekontrollbehandlede mus og Ad-VPR injisert mus (p 0,05). I motsetning ble ingen statistiske forskjeller funnet mellom annonsekontroll og Ad-F34IVpr grupper. Derfor er det klart at ekspresjonen av VPR i tumorer har redusert tumorvekst og ekspresjon av VPR faktisk hemmer tumorveksten av humane neuroblastom-celler uavhengig av legemiddelresistente status.
diskusjon
i den foreliggende undersøkelse har vi vist at et HIV-1 viral protein VPR blokkerer celleproliferasjon ved å arrestere de celler i G2-fasen av cellesyklusen i forskjellige cancercelletyper som ble testet (tabell 1; figur 1). I tillegg induserer VPR celledød i tre av disse kreftcellelinjer, uansett om de er motstandsdyktige eller følsomme overfor DOX (figur 2). Ytterligere analyser av VPR effekt på neuroblastom-celler indikerte at VPR induserer celledød på en doseavhengig måte (figur 3A B-)
via
apoptose som antydet med caspase-3-spalting (figur 3C). Ved å bruke en neuroblastom musemodell, har vi ytterligere demonstrert at levering av VPR
via
adenovirus levering til neuroblastom svulster, enten ved pre-infeksjon (figur 4A-B) og intratumoral injeksjon (figur 4C), markert hemmet svulst vekst. Dermed de beskrevne resultatene demonstrerer ved proof-of-concept som VPR kan være en god kandidat for videre undersøkelser på sin rolle i tumor undertrykkelse, spesielt i de som er motstandsdyktig mot kreft narkotika.
Selv om VPR induserer cellesyklus G2 arrest i alle kreftcelletyper som ble testet, ble det lagt merke til at nivået av G2 stansede celler i brystkreftcellelinjen MCF-7 ble sterkt redusert (figur 1 – midten). Det er uklart i øyeblikket hvorfor denne cellelinjen er delvis motstandsdyktig mot VPR-indusert G2 arrest. Men det synes å være en interessant sammenheng mellom VPR-indusert G2 arrestasjonen og den enzymatiske status av protein fosfatase 2A (PP2A). Som vi har rapportert tidligere, er en av de unike funksjonene til VPR-indusert G2 arrest at det krever funksjon PP2A [2], [4], [16], [32]. Søk litteratur viste at A regulatoriske underenhet av PP2A er enten betydelig redusert eller tapt i MCF-7 cellelinje [33], [34]. Reduksjonen av G2 arrest i MCF-7-celler støttet oppfatningen at VPR inhiberer celleproliferasjon ved induksjon av G2 arrest gjennom en PP2A-mediert mekanisme [4], [32]. Videre antyder denne observasjonen at VPR ikke kan være i stand til å blokkere celledeling av G2 arrest i alle kreftceller, spesielt de kreftceller som inneholder PP2A relaterte mutasjoner. Videre undersøkelser av denne oppfatningen er absolutt berettiget spesielt i sammenheng med å bruke VPR som en anti-kreft agent.
VPR induserer celledød og apoptose gjennom flere mekanismer [For deg, se [5], [6]] . Siden VPR er i stand til å indusere celledød og apoptose i både DOX-naive og resistente neuroblastom celler, en eller noen få av disse foreslåtte VPR trasé kan ha forårsaket den observerte cytotoksisitet. Vår fremtid innsats vil fokusere på testing som mekanisme for VPR-indusert celledød kunne overvinne apoptotisk motstand, et typisk trekk ved mange kreftceller inkludert neuroblastom. På grunnlag av data som er vist i figur 3C, er det klart at VPR er i stand til å forårsake apoptose som indikert av caspase-3 spalting. Denne observasjonen er i tråd med vår karakterisering av VPR-indusert apoptose i samme neuroblastom celler vist ved hjelp av vedlegg V analyse [35]. Det har vi videre vist at VPR-indusert apoptose i SK-N-SH neuroblastom celler gjennom en mitokondrier avhengig og caspase-9-mediert mekanisme [35].
Vi brukte pre-infeksjon og intra- tumoral injeksjon i vårt musemodell for innføring av VPR inn i neuroblastom tumorer. Disse to metodene ble brukt fordi uttrykk for VPR
in situ
kan raskt drepe celler og dermed hindre testing på selve tumorvekst. Våre resultater viste begge metoder signifikant reduserte tumorvekst etter innføringen av VPR. Til sammenligning DOX-resistente celler viste også tilsvarende nivå av tumorstørrelse reduksjon støtte forutsetningen at VPR uttrykk undertrykker svulst vekst uavhengig av resistent status.
Det er verdt å nevne at i de beskrevne forsøk, vi gjorde ikke teste potensialet VPR effekt på metastatiske neuroblastom-celler. Vi gjorde imidlertid gjennomføre foreløpige farmakologiske studier for å teste potensielle skadevirkning av C57-SCID mus når de ble utsatt for VPR gjennom systematisk hele kroppen injeksjon. I disse forsøkene ble en eskalerende økning på Adv-VPR viruspartikler fra 1 × 10
13 6 × 10
13 av viruspartikler injisert i C57-SCID mus via halevenen. Ingen åpenbare bivirkninger ble observert i de musene i løpet av hele forsøksperioden. Patologiske undersøkelser av ulike organer 3 uker etter viral injeksjon viste ingen klare cytotoksiske effekter som følger av VPR (data ikke vist). Derfor kunne systematisk innføring av VPR også være et alternativ for fremtidig testing.
Konseptet med å bruke HIV-1 VPR som en potensiell antikreftmiddel er ikke ny. Faktisk har andre tidlige studier med våre antydet denne muligheten [36] og en rekke studier har vist at levering av VPR til forskjellige tumorer slik som melanom [37] – [39], hepatom [40], [41] og oral kreft [42] undertrykke tumorvekst
in vivo
. Det som er nytt, imidlertid, er at vi har demonstrert for første gang at VPR er i stand til å undertrykke tumorvekst uansett om det er sensitiv eller resistent overfor en anticancer medikament gjennom induksjon av cellesyklus G2 og apoptose. Dette funn kan potensielt være av betydning på grunn ødeleggelse av medikamentresistente kreftceller gjør det til et potensielt og kraftig ny og alternativ middel mot kreft. Denne type av anticancermiddelet kan bli spesielt nyttig som en supplerende viralt terapeutisk middel for selektiv inhibering av tumorvekst, spesielt når andre behandlinger mislykkes.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
forskjellige humane kreftcellelinjer som representerer ulike typer av kreft, med eller uten medikament resistens mot anticancerlegemiddel doxorubicin (DOX) blir anvendt i denne studien og oppsummert i Tabell 1. Hvis ikke spesifikt er angitt, er disse cellelinjene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle «s medium (DMEM) (Cellgro) eller RPMI 1640 medium (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen). Inkubasjon var ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
Adenoviral infeksjon
Adenoviral vektor (Adv) og Adenoviral vektor inn med
VPR
genet (Adv-VPR) ble vennlig levert av Dr LJ Zhao [17]. Omtrent 1 × 10
6 av testcellene ble infisert med Adv eller Adv-VPR virus. Førti-åtte timer
p.i.
Ble cellene høstet for cellesyklus analyse eller Western blot analyse. Infeksjoner ble utført ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 1,0 til cellesyklusanalyse som vist i tabell 1 og fig. 1. MOI på 2,5 ble brukt for initial celledødsanalyser som vist i fig. 2.Under dette adenovirus førende tilstand, ble mer enn 90% infeksjon effektivitet oppnås med disse viral aksjer (data ikke vist).
Cell syklus analyse
Cellene ble høstet 48 timer
