Abstract
Genomisk og proteomikk analyser av normale og kreft vev har gitt rikelig molekylær informasjon for potensiell biomarkør og terapeutiske mål. Vurderer potensielle fordeler i tilgjengelighet til farmakologisk intervensjon, er identifisering av mål bosatt på blodåreendotelets innen svulster spesielt attraktivt. Ved anvendelse av massespektrometri (MS) som et verktøy for å identifisere proteiner som blir over-uttrykt i tumorassosiert endotel i forhold til normale celler, forsøkte vi å oppdage mål som kan bli benyttet i tumorangiogenese kreftterapi. Vi utviklet proteomikk metoder som mulig for oss å fokusere våre studier på oppdagelsen av celleoverflate /utskilte proteiner, som de representerer viktige antistoff terapeutiske og biomarkør muligheter. Først isolert vi endotelceller (ECS) fra humane normale og nyre kreft vev ved FACS bruker CD146 som en markør. I tillegg spredt menneskelige kolon og lungekreft vev og deres tilsvarende normale vev ble dyrket
ex-vivo Hotell og deres endothelial innhold ble fortrinnsvis utvidet, isolert og passert. Celleoverflateproteiner ble deretter fortrinnsvis tatt, kuttet med trypsin og utsatt for MS-baserte proteomikk analyse. Peptider ble først kvantifisert, og deretter sekvenser av forskjellig uttrykt peptider ble løst ved MS-analyse. Totalt 127 unike ikke-overlappende (157 totalt) svulst endotelceller over-uttrykte proteiner identifisert fra direkte isolert nyre-forbundet egenkapitalbevis og de som er identifisert fra
ex-vivo
dyrkede lunge og tykktarm vev inkludert kjente EF markører slike som CD146, CD31, og VWF. Uttrykket analyser av et panel av de identifiserte målene ble bekreftet ved immunhistokjemi (IHC) inkludert CD146, B7H3, Thy-en og ATP1B3. For å finne ut om de proteinene som er identifisert megle noen funksjonell rolle, utførte vi siRNA studier som førte til tidligere uidentifiserte funksjonell avhengighet for B7H3 og ATP1B3
Citation. Mesri M, BIRSE C, Heidbrink J, McKinnon K, merke E, Bermingham CL, et al. (2013) Identifisering og karakterisering av angiogenese Targets gjennom proteomikk Profilering av endotelceller i humane kreftvevet. PLoS ONE 8 (11): e78885. doi: 10,1371 /journal.pone.0078885
Redaktør: Benedetta Bussolati, Senter for molekylær bioteknologi, Italia
mottatt: May 30, 2013; Godkjent: 16 september 2013; Publisert: 13.11.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Denne studien ble finansiert av og utført på Celera, som arbeidsgiver for alle forfattere i løpet av disse studiene. Celera har 3 utstedte patenter i USA for å erklære: 7582441, 8110373 og 8,334,106, som beskriver sammenslutninger av Na-K ATPase beta3 protein i forskjellige ondartede tilstander. Det er ingen produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Angiogenese er veksten av nye blodkar fra pre-eksisterende, og er en viktig prosess naturlig forekommende i kroppen, både i helse og sykdom. Normal fysiologisk angiogenese oppstår hos voksne under sårtilheling og livmor regenerering løpet av menstruasjonssyklusen. Imidlertid kan overdreven patologisk angiogenese også forekomme i tilstander slik som kreft, diabetisk blindhet, aldersrelatert makuladegenerasjon og kroniske inflammatoriske tilstander [1] – [3].
Det har lenge vært kjent at endotelet som utgjør blodkar og omkringliggende stroma i tumorer forskjellig fra det i normalt vev, men bare nylig disse forskjellene har begynt å være kjennetegnet ved det molekylære nivå [4], [5]. Blokkering unormale blodkar i forbindelse med kreft og andre sykdommer ved hjelp antiangiogenic agenter har blitt en stor terapeutisk strategi. Fordi angiogenese er nødvendig for normale fysiologiske prosesser, er markører som kan skille fysiologisk og patologisk angiogenese er nødvendig for selektivt å levere antiangiogene midler til syke vev minimalisere de potensielle bivirkninger.
målproteiner plassert rundt tumorblodkarene og i stroma er spesielt egnet for målrettede kreft strategier i lys av deres tilgjengelighet for intravenøst administrerte legemiddel [4], [6]. Strategier for identifikasjon av tumorassosierte endotelceller markører inkluderer
in vitro
ECS isolater utsettes for kulturbetingelser som etterligner de i normale og tumorvev [7], global profilering av gentranskriptene [8], [9], bioinformatikk analyse av uttrykte sekvens koder [10],
in vivo
rettet mot å bruke fag oppvisningspeptidet bibliotekene [11], [12], silika belegg prosedyre følges ved stripping av membran [13] og
in vivo
biotinylering metoder [14].
A teknisk begrensning på molekyl profilering av ECS er at de representerer en liten prosentandel av cellene i vevet. Vi har utviklet en metode for utvinning, identifikasjon og storskala kartlegging av celleoverflaten proteomet av mikrovaskulær endotelet som det finnes
in vivo
i menneskelige nyre svulster og deres tilstøtende normalt vev. Denne metodikken er basert på flowcytometrisk farging av vaskulære organer med kjente markører for egenkapitalbevis. Fargede celler kan renses effektivt ved hjelp av cellesortering. Ved celle suface protein fangst og tryptisk fordøyelse, blir de resulterende proteolytiske peptider underkastet væske-kromatografi – masse-spektrometri (LC /MS) for å identifisere de tilsvarende proteiner. En sammenlignende analyse av proteiner identifisert i vevsprøver kan avsløre forskjeller i ekspresjon i ulike organer eller tilstander, f.eks normal versus kreft. Videre analyserte vi
ex-vivo
dyrkede celler hentet fra kreft og tilstøtende normal human lunge og tykktarm microvascular egenkapitalbevis.
Metoder
kjemikalier og materialer
Chemical reagenser ble anskaffet fra Aldrich-Sigma (St. Louis, MO). Poros R2 kolonne (Poros R2 /10, 4,6 x 50 mm) og Poros MC-kolonne (2,1 x 30 mm, IMAC kolonne) ble kjøpt fra Applied Biosystems (Framingham, MA) og reversert-fase HPLC-kolonner ble hentet fra Vydac (Hesparia, CA). DC proteinanalyser ble kjøpt fra BioRad (Richmond, CA). Modifisert trypsin ble kjøpt fra Promega (Madison, WI). Antistoffer mot CD146, CD31, CD45, EpCAM, CD105, CD62E, Thy-1 (CD90) og B7H3 (CD276) ble kjøpt fra BD Biosciences. Dil-Ac-LDL ble kjøpt fra Biomedical Technologies Inc, MA.
Tissue prosessering og fenotypisk karakterisering
Menneskelig nyre, tykktarm, lunge og mage vev ble oppnådd fra kommersielle kilder kort tid etter kirurgisk fjerning. Kommersielle kilder inkluderer Asterand (Detroit, MI, www.asterand.com) og BIOOPTIONS (Brea, CA, www.biooptions.com). Normal vev ble tatt fra regionene 10 cm unna bulk svulstvev som hadde klart definert marginer. Vevene ble veiet, skåret i 1 cm terninger med saks, skylt, og hakket i 1 mm stykker. Vevet ble deretter inkubert med vevsfordøyelse medium inneholdende type I-kollagenase, hyaluronidase, DNase I, CaCl
2, og dispase i en time ved 37 ° C med konstant omrøring. Enhver ufordøyd vev ble filtrert gjennom en 40 pm sikt, og røde celler ble fjernet ved inkubering i ACK lysebuffer i 5 min. etterfulgt av celle vasker og celletall. Aliquoter av enkeltcellesuspensjoner ble farget med CD146, CD31, CD45, og EpCAM, for å bestemme profilen til endotelceller, epitelceller og infiltrerende leukocyttceller. Den EpCAM negative, CD146 positiv endothelial innholdet i cellepopulasjon ble deretter sortert og isolert av en MoFlo celle sorter. For flowcytometri, egenkapitalbevis ble farget med Thy-en eller B7H3 antistoffer (BD Biosciences) eller kontroll, og analyse ble utført på en LSR I (BD Biosciences) strømningscytometer.
In vitro
kultur av normale og tumor tykktarm og lunge ECS
Alikvoter av enkeltcellesuspensjoner fra kommersielt erholdt (ovenfor) normale og tumor tykktarm og lunge-vev ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Den endotelceller befolkningen ble så positivt valgt ved hjelp av Dynal er CD31 endotelceller perler per produktvedlegget. De valgte celler ble sådd i T-kolber med Lonza sin EGM ™ -2-MV medier. Dette mediet ble utviklet for å forbedre endotelial cellevekst (Cambrex). Veksten media ble endret etter 2-3 dager til kulturen nådde 90-100%. Cellene ble høstet ved hjelp Lonza er ReagentPack ™. Kolbene ble vasket med HEPES-bufret saltvannsoppløsning, fulgt av trypsin /EDTA inkubasjon for å frigjøre celler og en trypsin nøytraliserende løsning. Den positive utvalg av endotelial celle ble gjentatt for ytterligere å rense den endoteliale cellepopulasjon. De valgte celler ble sådd i T-kolber med Lonza sin EGM ™ -2-MV medier. Disse primære celler førte ikke til generasjon av cellelinjer og deres begrensede ekspansjonskapasitet gitt tilstrekkelig celler bare å fullføre forsøkene beskrevet her.
Cell lysat og peptid forberedelse
Renset egenkapitalbevis ble vasket og inkubert med 1 mM natriumperjodat ved 4 ° C i 10 minutter for å oksydere glykoproteiner [15]. Cellene ble vasket og sjekket for levedyktighet. Celler som var større enn 85% levedyktige som bestemt ved PI utelukkelse hjelp av strømningscytometri. Celler ble lysert i lyseringsbuffer inneholdende 0,05 M HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2% SDS, 5 mM EDTA, 0,5% NP40, og protease-inhibitor cocktail (Sigma) ved virvling og skjæring gjennom en 18-gauge nål. Proteinkonsentrasjonen ble deretter bestemt ved bruk av DC-proteinanalyse-reagens kit (BioRad, Hercules, CA). Oksyderte glykoproteiner ble deretter konjugert til hydrazidet harpiks (Bio-Rad) ved 4 ° C over natten [16]. Etter vasking i rekkefølge med: 2 M NaCl, 2% SDS, 200 mM propanolamin (0,1 M NaOAc, pH 5,5), 40% etanol og 80% etanol; bundne proteinene ble redusert i 2,5 mM dithiothreitol (DTT) (BioRad, Hercules, CA) i 1 time ved 37 ° C og alkylert med ICAT (lys bare «C0») i henhold til fremgangsmåtene anbefalt av produsenten (Applied Biosystems, Framingham, MA).
Alkylerte proteiner ble fordøyd over natten ved 37 ° C ved hjelp av sekvensering karakter, modifisert trypsin (Promega, Madison, WI) med et enzym: substrat-forhold på 1:25. Tryptiske fordøyer ble avsaltet ved 3-cm3 Oasis HLB fast-fase ekstraksjon kolonner (Waters, Milford, MA) og tørket i vakuum.
cysteinene og glykopeptider fangst og prøve opprydding
Peptidene ble rekonstituert i en oppløsning av 10% acetonitril i PBS. Peptidene ble påsatt på en avidin-kolonne (2 ml, Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse av et Vision arbeidsstasjon system (Applied Biosystems) med PBS. Avidin Kolonnen ble vasket med 50 mM ammoniumbikarbonat (EMD, Gibbstown, NJ), 20% metanol, fulgt av en vannvask. Ikke-cystein-inneholdende peptider ble vasket på en R2 /10-kolonne (4,6 x 50 mm, Applied Biosystems) med 5% acetonitril i 0,1% TFA og elueres til fraksjonssamleren med en trinn-gradient til 95% acetonitril, 0,1% TFA. De cystein-inneholdende peptider ble eluert ved anvendelse av 50% acetonitril, 0,1% TFA (Pierce, Rockford, IL), oppsamlet og vakuumtørket. Fangede ICAT-merkede peptider ble spaltet som beskrevet i protokollen gitt av Applied Biosystems. Overskytende og spaltet ICAT reagens ble fjernet ved anvendelse av den samme avidin /R2 opprydding beskrevet ovenfor. Den R2 /10 fraksjoner (cystein-inneholdende peptider) ble tørket under vakuum og lagret ved -80 ° C før LC-MS-analyse.
I tillegg til cystein-inneholdende peptid-fraksjon, peptider bundet til harpiksen var også samlet og analysert. Frigjøring av peptider ble oppnådd gjennom PNGase-F fordøyelse (New England Biolabs, Ipswich, MA). Selv om vi har funnet noen overlapping mellom de proteinene som er identifisert i de to fraksjoner, analyse av både den cystein-inneholdende fraksjon og det harpiksbundne fraksjon resulterte i komplementære dekning av celleoverflateprotein befolkning.
Reversfase LC /MS og LC /MS /MS
Revers fase HPLC-separasjon ble utført på et Agilent 1100-system (Palo Alto, CA) satt til en strømningshastighet på 2 mL /min. Systemet var utstyrt med en C18 forkolonne for avsalting (50 mm x 0,15 mm), en omstillingsventilen, og en C18 analytisk kolonne (150 mm x 0,15 mm) for peptid separasjon. MS og MS /MS-analyser ble utført på en Q-Star massespektrometer (MDS /Sciex, Toronto, Canada). Datainnsamlings tid ble satt til 3 s per-spektrum i løpet av en
m /z
området 400-1500 Da for LC /MS-analyser. Den ion spray spenning ble satt til 5,2 kV.
Peptide identifisering og kvantifisering
Peptide ion topper fra LC /MS kartene ble oppdaget med RESPEKT
TM programvare (PPL, UK), og MASCOT (www.matrixscience.com) ble brukt til å søke MS /MS spektra for peptid /protein identifikasjon med massespektrometri protein sekvens database (msdb, Imperial College London, London, UK). Peptide ion toppene i LC /MS kart fra normale og tumorprøver ble justert basert på massen til kostnad ratio (
m /z
), korrigert retensjonstid (RT) og ladetilstand (
z
). Intensitetene av ioner i hvert kart ble sammenlignet med de midlere intensitetene av disse ioner på tvers av alle kart i innretting. En normaliseringsfaktor ble generert (ved hjelp av ioner med gjennomsnittlige intensitet i 10
th-90
th persentiler) for hvert kart, ved hjelp av ubegrenset ikke-lineær optimalisering, minimalisere summen av forskjellene mellom intensitetene av hver ion og den midlere intensitet for at ion tvers av alle kart. Etter intensitet normalisering, ble peptid ioner med en differensial uttrykk for mer enn tre ganger mellom tumor og normale prøver manuelt kontrollert før LC-MS /MS-baserte peptid-sekvensering.
Immunohistochemistry (IHC)
Immunohistochemistry ble utført av Life biovitenskap på formalinfiksert parafin-embedded vev ved hjelp av microarray. Kreften rekke besto av ensartede kreftceller. De vev ble deparaffinized, og antigen gjenfinning ble gjort ved hjelp av EZ-retriever (Biogenex, San Ramon, California). Prøvene ble på forhånd blokkert med ikke-serum-protein blokken (DAKO A /S, Carpinteria, CA) i 15 minutter. Tilsvarende primære antistoffer ble inkubert over natten ved romtemperatur. Envision Plus-system HRP (DAKO) ble anvendt for deteksjon med 3, 3′-diaminobenzidin som substrat for pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Slides ble deretter manuelt scoret av en patolog og var basert på (i) farging intensitet og (ii) farging frekvens ved. Den negative fargeintensitet ble tildelt score på «0», rødme flekker en score på «1», svak farging en score på «2», moderat farging en score på «3», og sterk farging en score på «4». I tillegg, når 0,1% til 30% celler viste positiv farging, ble fargings kvantifisert som sjelden eller sporadisk, 30% til 75% av cellene viste positiv farging ble kvantifisert som «mange eller hyppig», og større enn 75% av cellene farging positive ble utpekt «mest». Hematoxylin ble anvendt som en mot-flekk. Representative bildene ble anskaffet ved hjelp 40 X objektiv (400 X forstørrelse).
immunfluorescens
Menneskenavlevene endotelceller (HUVECs, Cambrex) ble dyrket på Lab-Tek kammer vev kultur lysbilder. Celler ble inkubert med 10 ug /ml Dil-Ac-LDL ved 37 ° C i vanlige medier i 4 timer. Mediene ble deretter fjernet og cellene ble vasket en gang med probe-fritt medium i 10 minutter, skylles med PBS, og deretter fiksert med 10% bufret formalin fosfat i 5 minutter. Dekk ble montert over lysbilde med et fall på 10% PBS i glyserol før visning.
RNA interferens
Individuell duplex syntetisk siRNA spesifikk for B7H3 og ATP1B3, ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO). For siRNA transfeksjon, HUVECs eller humane mikrovaskulære endotelceller (HMVECs, Cambrex) ble sådd i 96-brønners vevkulturplater ved en tetthet på 10.000 celler /brønn. Transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine Plus 2000 og reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Knockdown av B7H3 mRNA nivåer ble overvåket av kvantitativ RT-PCR 1 dag etter transfeksjon bruker TaqMan Gene Expression analyse (Applied Biosystems). Prosent mRNA uttrykk for knockdown validering ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden [17]. RPLP0 tjente som den endogene kontroll for å normalisere for mal belastning, og celler transfektert med negative kontroll siRNA var referanseprøven. Cellevekst ble vurdert 3 dager etter transfeksjon hjelp Alamar blå reagens (Invitrogen) og SPA-thymidine kit fra GE Healthcare (Piscataway, NJ). Cell apoptose ble målt ved caspase 3/7 aktivitet kit fra Promega (Madison, WI).
Resultater
Evaluering av endothelial innhold i flere krefttyper
For å evaluere den relative EC innhold av svulster på tvers av flere krefttype indikasjoner, enkeltceller oppnådd følgende vev behandling fra tumor og normal tilstøtende vev fra nyre, lunge, tykktarm og mage kreft og ble analysert for EC nærvær (fig 1). ECS blir innviklet i en kompleks vev inneholdende en ekstracellulær matriks av variabel sammensetning og flere ikke-endothelail celletyper slik som epitel-celler og leukocytter. Vår første forsøk på å rense egenkapitalbevis involvert antistoff anerkjennelse av konvensjonelle kjente EF celleoverflatemarkører inkludert CD31, CD105, og CD146. Imidlertid CD31 viste seg å være suboptimal på grunn av sin kryssreaktivitet med hematopoetiske celler. CD105 også kan uttrykkes av aktiverte monocytter og også vist seg suboptimal i å oppdage alle kilder til egenkapitalbevis. Anti-CD146 viste maksimal EC anerkjennelse som bekreftet av dual farging av CD31 og CD146 ved FACS og positiv acetylert LDL (Dil-Ac-LDL) opptak av immunocytochemistry i dyrkede egenkapitalbevis avledet fra tykktarm og lunge vev. Anti-CD146 Ab ble derfor brukt for EC sortering, isolasjon, berikelse og relativ estimering av egenkapitalbevis innholdet i tumorvev. Våre analyser indikerte at nyrevev inneholdt den høyeste prosentandel (0,6 til 33,1) av ECS (figur 2) etterfulgt av lunge (0,8 til 7,2), tykktarm (0,2 til 5,1) og gastriske tumorer (0,2-1, ikke vist i Figur 2) . Totalt 46 avstemt tumor og tilstøtende normale nyrevev ble analysert representative for alle fire stadier av nyrekreft. Innholdet av normal nyre ECS varierte 1,1 til 14,7% sammenlignet med 0,6 til 33,1% i nyrekreft. Den høye innholdet av egenkapitalbevis i nyre svulster var også tydelig i forhold til hver tilsvarende matchet normale tilstøtende egenkapitalbevis som tyder på at nyretumor egenkapitalbevis kan være mer proliferativ forhold til sine mer hvilende normale tilstøtende egenkapitalbevis. Denne trenden var imidlertid ikke tydelig i lunge og tykktarm vev. Siden protein mengden er en begrensende faktor for MS analyse, vi utførte derfor våre funn innsats på nyrekreft som ga den høyeste egenkapitalbevis utvinning fra vev.
B) For isolering av rene EF populasjoner fra kollagenaseklassene spredt vev, den EpCAM negativ, CD146 positiv endothelial innholdet i cellepopulasjon ble sortert, isolert og beriket av en MoFlo celle sorter. Celler ble sendt inn for LC-MS og funksjonen deteksjon enten direkte eller indirekte etter ekspansjon i kultur.
Enkeltceller følgende vev behandling fra tumor og normal tilstøtende fra nyre, lunge og tykktarm vev ble farget med anti -CD146 Ab og analysert for EC tilstedeværelse.
Prøvepreparering og MS kvalitetskontroll
prosjektet fokuserte funn på markører som inneholder kort, tryptically-spaltet 5-25 aminosyre peptider som koder enten en cystein-rest eller en N-bundet glykosyleringssete, som gir bred dekning av proteome. For å evaluere egnetheten MS-systemet, ble en vurdering av reproduserbarhet utført for å bestemme den minimale pålitelig forholdet mellom peptid /protein nivåer for videre kvantitativ analyse. Cystein-inneholdende peptider fra den tryptiske spaltningen ble anriket ved affinitetskromatografi, og LC-MS-kart av peptidblandinger fra to prøver ble samlet inn. I våre forsøk på ICAT (lys bare) etikett tjente som et håndtak for å trekke ut cystein-inneholdende peptider, og dermed forenkle peptidblandingen. Mens de analyserte prøvene teknisk inneholde en etikett, er vår analyse i hovedsak det som er kjent som en «label-free» metoden ved at peptid ion topparealer fra en bestemt prøve og LCMS kartet er sammenlignet med de av en annen prøve og LCMS kartet for relativ kvantifisering. Dermed har vi kaller våre eksperimenter «frikoplet», som betyr at de merkede prøvene ikke er kombinert i en massespektrometrisk analyse som gjøres typisk i en ICAT eller merking arbeidsflyt. Funksjonen lister over, for eksempel normal replikere 1 og 2 Normal replikat ble justert for å generere en intensitetsmatrise. Fig. 3 viser spredningsdiagram av log2-transformert intensiteter (log2 Int) av de vanligste funksjonene i dekoblet eksperimenter (replikere en vs replikere 2). Log2 forhold (forholdet = ion intensitet i prøve 1 /ion intensitet i utvalg 2) av alle vanlige funksjoner ble beregnet. Sammendraget Statistikken vises med boksplott diagram. For forholdet mellom fordeling av dekoblet replikater, er 2SDUL (øvre grense på 2 standardavvik (SD) fra middelverdien), 2SDLL (nedre grense for 2SD fra gjennomsnittet), og gjennomsnittsverdier i lineær skala er vist i fig. 3. Dette reproduserbarhet vurdering indikerte at for gjentatte eksperimenter (Normal eller tumor) 95% av de totale fellestrekk har intensiteter innen en ~ 2-fold forskjell. Derfor er en hvilken som helst forskjell i ekspresjonen forhold som er 2-ganger kan vurderes som uttrykt forskjellig med 95% sikkerhet. I denne studien er imidlertid forhold som var 3 ganger ble betraktet som forskjellig uttrykt
Scatter plott av fellestrekk fra normale og tumorprøver og differensial analyse ved hjelp dekoblet kart er vist.. Relative uttrykk nivåer bestemmes ved å justere peptid ion funksjoner fra forskjellige MS eksperimenter (LC /MS kart). De log2 intensitetene av fellestrekk detektert i (A) Fremgangsmåte replikerer med kontrollprøven; (B) prosess gjentak av tumoren prøven; (C) kontroll vs. tumorprøvene er plottet. Den tilsvarende boksplott (i log2 skala) av forholdet fordeling for hvert datasett vises ved siden av spredningsdiagram. Boksen inneholder 50% av funksjonene, hvor 95% av funksjonene er innenfor de vannrette streker. (D) Utbredelse av kjente EF overflateproteiner ble undersøkt og representanter vises.
Heat kartet global peptid analyse i menneskelig nyre svulst endotelet
Totalt 6 svulster og 2 normale tilstøtende nyreprøver ble bearbeidet for tumor relativ overekspresjon analyse. Totalt 74 celleoverflate /utskilte proteiner, ble identifisert ved MS med minimum tre ganger høyere intensitet i nyretumorassosiert endotel i forhold til normal endotel.
heatmap radene ble sortert ved forholdet mellom den midlere intensitet i tumorprøver til den midlere intensitet av den normale prøver. Varmen kartet viser analysen av 233 cystein som inneholder peptid intensiteter identifisert i nyre svulst endotelet og sortert slik at de forskjellig-uttrykt peptider er på toppen (fig 4). Rader ble bare inkludert hvis det var minst en MS /MS identifisering av et ion i raden. Displayet farger ble bestemt for hver rad separat ved å tildele svart til median intensiteten i raden, grønn til lavest intensitet i raden, og rødt til den høyeste intensitet. I rader med en median på null, blir null verdier vises som svart. Eksempler på identifiserte proteiner er avbildet på kartet varmen.
Varmen kartet viser analysen av peptid intensiteter for de 233 peptider identifisert i nyre svulst endotelet og sortert slik at de forskjellig-uttrykt peptider er på toppen. Displayet farger ble bestemt for hver rad separat ved å tildele svart til median intensiteten i raden, grønn til lavest intensitet i raden, og rødt til den høyeste intensitet.
MS-analyse av proteiner med forhøyet uttrykk i
in vitro
dyrkede humane tykktarm og lunge svulst endothelia
Vi ytterligere kultivert og utvidet normal og svulst egenkapitalbevis
in vitro
fra krefttype som tyder på at ikke ga tilstrekkelig endothelial proteiner fra direkte
in vivo
isolasjon for MS analyse. Disse indikasjonene inkludert tykktarm og lunge kreft. Identiteten til disse cellene som egenkapitalbevis ble bekreftet av dual farging av CD31 og CD146 ved FACS og positiv Dil-Ac-LDL opptak av immunocytochemistry (fig 5). Disse cellene negative for alfa-aktin ekspresjon, en typisk markør av glatte muskelceller. Interessant, bare en brøkdel (20-30%) av
in vitro dyrkede
ECS avledet fra lunge- og colontumorer farget for Dil-AC-LDL-opptaket ved immunocytokjemi (ikke vist) til tross for sin positive ekspresjon av CD31 og CD146 som observert ved FACS (fig 5b). I motsetning til alle de
in vitro
kultivert egenkapitalbevis stammer fra normal lunge og tykktarm farget for Dil-AC-LDL opptak av immunocytochemistry (fig 5a) og farget positivt for CD31 og CD146 som observert ved FACS (fig 5b ). Dette kan tyde på at svulsten egenkapitalbevis kan avvike fenotypisk fra sine vanlige kolleger. Totalt 56 tykktarm og 27 lungecelleoverflate /utskilte proteiner ble identifisert med . 3 ganger overuttrykk av MS i tumor-assosiert endotelet i forhold til normal
(A) Intens punktat fluorescens viser opptaket av DII-Ac-LDL i normal lunge mikrovaskulær egenkapitalbevis. (B) Kultur normale og svulstvev-avledet egenkapitalbevis fra tykktarm og lunge ble farget med EF-spesifikke markører CD146 og CD31, og utsatt for flowcytometri.
Et sammendrag av egenkapitalbevis mål oppdagelsen tvers av tre kreft skriver indikasjoner er vist i tabell 1. i alt 127 unike ikke-overlappet (157 total) tumor endotelcelle over-uttrykte proteiner identifisert fra direkte isolert nyre-assosiert ECS og de som er identifisert fra
ex-vivo
dyrket lunge og tykktarm vev. Vår analyse indikerte at av proteiner identifisert, 4-proteiner overlappes på alle tre typer kreft; 17 proteiner overlappet mellom nyre og tykktarm; 9 proteiner overlappet mellom nyre og lunge; og 8 proteiner overlappet mellom lunge og tykktarm kreft. Listen over MS identifisert mål, deres vev kilde for deteksjon og ekspresjon forhold er vist i tabell S1. I analysere over-uttrykte proteiner, identifiserte vi kjente ECS markører inkludert VWF (5 ganger i løpet av normal, maksimal ratio), PECAM (CD31, 36 ganger), CD36 (16 ganger), og MCAM (CD146, 15 ganger).
Target Validering
For å validere proteiner identifisert ved MS, vi utført flere bekreftende studier inkludert immunhistokjemi (IHC), flowcytometri og RNAi-mediert effekt på EC spredning og /eller apoptose på en undergruppe av proteiner som ble valgt basert på kriterier som druggability av proteiner ved antistoffer, nyhet, og intensiteten av svulst over-uttrykk. Representative data fra et antall proteiner er presentert nedenfor. En representativ MS-analyse av peptid-ioner fra CD146 er vist i fig. 6. Vår MS analyse identifisert 11 peptider som stammer fra CD146 over 7 forskjellige sykdomsindikasjoner inkludert 4 peptider i nyre egenkapitalbevis (data ikke vist).
Den øverste panelet viser de utpakkede ionekromatogrammer nyre ECS prøver fra normal og svulst prøver. Massespektrene er vist i det nedre panel. Den røde pilen viser intensitetsnivået i normal vevsprøve.
Ekspresjon intensitet av et antall proteiner, inkludert CD146, B7H3, Thy-1 og natrium /kalium-ATPase transportere subenhet beta-3 (ATP1B3) ble evaluert ved IHC. Vi analyserte parafinsnitt tatt fra flere uavhengige pasientens vev fra en rekke forskjellige krefttyper, inkludert bryst, lunge, kolon, nyre, eller normale tilstøtende vev. Alle prøver representert ubeslektede tilfelle enn de som brukes for MS-analyser. Representative IHC stainings er avbildet i figur 7. IHC ble utført på seksjoner fra flere normale og karsinom prøver inkludert bryst, lunge og nyreprøver. Interessant, over-ekspresjon av CD146 er funnet i tumorceller mens normal epitel var negativ i flere krefttyper (fig. 7a). Det er bemerkelsesverdig at vår sortering protokollen utelukket CD146 og EpCAM positive epitelceller fra proteomikk analyse. CD146 over-ekspresjon ble ofte detektert i endotel av tumorceller mens normal epitel var jevnt negativ (fig. 7b). IHC bilder av egenkapitalbevis indikere sterk over-uttrykk for B7H3 i bryst, tykktarm, lunge og nyrekreft blodkar i forhold til normal skip (Fig. 7c). Videre er det i mange av de tumorene som ble undersøkt, vi har oppdaget over-ekspresjon av B7H3 protein ved hjelp av selve tumorcellene (data ikke vist). For Thy-1, IHC bilder også antydet betydelig over-ekspresjon i nyre og lunge karsinom fartøy i forhold til normale kar (fig. 7d). IHC bilder som er indikert over-ekspresjon av ATP1B3 i karsinom fartøy i forhold til normale prøver (fig. 7e). Over-ekspresjon av ATP1B3 ble også demonstrert i tumorceller sammenlignet med normale prøver i tykktarm og lunge cancer (data ikke vist).
(A) IHC bilder av normale og karsinom prøver. Over-uttrykk for CD146 er funnet i kreftceller, mens normal epitel var jevnt negativ i flere onkologiske indikasjoner. (B) indikerer betydelig over-uttrykk for CD146 i egenkapitalbevis av karsinom fartøy i forhold til normale prøver. (C) Betydelig over uttrykk for B7H3 i egenkapitalbevis av karsinom fartøyer sammenlignet med normale prøver er avbildet. (D) Betydelig overuttrykk av Thy-en i carcinoma fartøy i forhold til normal vises. (E) IHC bilder av egenkapitalbevis indikere sterk over-uttrykk for ATP1B3 i karsinom fartøy i forhold til normale prøver.
Andre bekreftende studier ble utført av flowcytometri. Fig. 8a viser FACS data for karakterisering av sorterte cellene i løpet av tumor som indikerer tilstedeværelse av epitel-celler og haematolymphoid celler med ingen ekspresjon av CD146 i nyreprøver mens det er betydelig over-ekspresjon av CD146 på endotelial komponent av tumor sammenlignet med tilstøtende normal nyre. Fig. 8b og 8c henholdsvis indikerer at CD146 positive endotelceller i nyre og lungesvulster uttrykke B7H3 og Thy-1 proteiner. For å evaluere potensialet funksjonell rolle ovenfor proteiner, utførte vi siRNA analyser i kultivert egenkapitalbevis. Fordi det var flere begrensninger for gjennomføring av siRNA eksperimenter i tumor egenkapitalbevis vi brukte HUVECs eller HMVECs som tilgjengelige modellsystemer. Evnen til å opprettholde svulst avledet egenkapitalbevis
ex-vivo
var begrenset i passasjen hyppighet og mengde. ECS vi var i stand til å høste var tilstrekkelig for bare MS analyser og ikke tilstrekkelig til å holde i kultur lenge nok til å støtte siRNA studier inkludert nødvendig optimalisering arbeidet for å transfektere med siRNA samt å ha celler for selve analysene. Som vist på fig.
