Abstract
chondroitin sulfate E (CS-E), en svært sulfatert glycosaminoglycan, er kjent for å fremme tumorinvasjon og metastase. På grunn av tilstedeværelsen av CS-E blir detektert i både tumor og stromale celler i bukspyttkjertel ductal adenocarcinoma (PDAC), har flertrinns involvering av CS-E i utviklingen av PDAC vært vurdert. Men sitt engasjement i den tidlige fasen av PDAC progresjon er fortsatt ikke fullt ut forstått. I denne studien, for å klargjøre direkte rolle til CS-E i tumor, men ikke stromal, celler av PDAC, fokuserte vi på karbohydrat sulfotransferase 15 (CHST15), et spesifikt enzym som biosynthesizes CS-E, og undersøkt effekten av CHST15 siRNA på tumorcellevekst
in vitro Hotell og vekst
in vivo
. CHST15 mRNA er sterkt uttrykt i den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer Panc-1, MIA PACA-2, CAPAN-en og CAPAN-2. CHST15 siRNA vesentlig hemmet uttrykk for CHST15 mRNA i disse fire celler
in vitro
. Stanse av den CHST15 genet i cellene var forbundet med betydelig reduksjon av proliferasjon og opp-regulering av cellesyklusen inhibitor-relaterte genet p21
CIP1 /WAF1. I en subkutan xenograft tumormodell av PANC-1 i nakne mus, en enkelt intratumoral injeksjon av CHST15 siRNA nesten fullstendig undertrykket tumorvekst. Reduserte CHST15 protein signaler forbundet med tumor nekrose ble observert med behandling med CHST15 siRNA. Disse resultatene gir bevis for den direkte virkningen av CHST15 på spredning av bukspyttkjertelen kreftceller blant annet gjennom p21
CIP1 /WAF1 veien. Dermed CHST15-CS-E akse-mediert tumor celleproliferasjon kan være en roman terapeutisk mål i den tidlige fasen av PDAC progresjon
Citation. Takakura K, Shibazaki Y, Yoneyama H, Fujii M, Hashiguchi T, ito Z, et al. (2015) Hemming av celle spredning og vekst av kreft i bukspyttkjertelen ved Dempe av karbohydrat sulfotransferaseaktivitet 15
In Vitro Hotell og i en Xenotransplantat Model. PLoS ONE 10 (12): e0142981. doi: 10,1371 /journal.pone.0142981
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 07.02.2015; Godkjent: 29 oktober 2015; Publisert: 07.12.2015
Copyright: © 2015 Takakura et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Mitsui Livet Social Welfare Foundation, gi nummer N /A, SK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. I tillegg til dette, ble de nødvendige utgifter betalt fra de økonomiske ressursene i vår legekontor (Division of Gastroenterology og Hepatology, Department of Internal Medicine, The Jikei University School of Medicine). Stelic Institute Co., Inc. gitt støtte i form av lønn for forfattere (YS, HY, MF, TH), men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet . De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i «forfatterens bidrag» -delen
Konkurrerende interesser: Stelic Institute . Co., Inc. gitt støtte i form av lønn for forfattere (YS, HY, MF, TH). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er godt etablert som en av de mest dødelige solide humane tumorer verdensomspennende [1]. PDAC relatert sykelighet og dødelighet tilfeller har begge vist seg å være økende. Undersøkelse av mekanismene bak de ondartede karakteristikkene av PDAC, inkludert sen diagnose, aggressiv invasjon, tidlig formidling og cellegift-motstand, er stort behov for å etablere effektiv behandling og bedre prognose. Tumor progresjon involverer en flertrinnsprosess, for eksempel proliferasjon, invasjon, metastase og angiogenese, men likevel er disse prosessene forblir dårlig forstått i PDAC. I primær kreft i bukspyttkjertelen celler, er proliferative signaler holdt konstitutivt aktiv ved muterte gener, og den uendelige spredning av genetisk forskjellige under kloner er observert før invasjonen prosessen. Genetiske endringer kan forekomme ved fjerne områder etter metastase [2-4]. Alle stadier av tumorprogresjon er også påvirket av den omkringliggende mikromiljøet der sukker spiller en sentral rolle i endring av tumorceller og i genetiske mutasjoner. Svulstene inneholde ulike glykosaminoglykaner (GAG) som regulerer celle atferd ved å samhandle med ulike molekyler som vekstfaktorer, cytokiner, kjemokiner, proteinaser og deres hemmere [5]. Gags inkludere chondroitin sulfate (CS), heparin sulfat, keratan sulfat, og hyaluronsyre. Sukker ryggrad CS består av gjentatte disakkaridenhetene av D-glukuronsyre acidβ1-3
N
acetyl-D-galactosamine (GalNAc). Under kjedeforlengelse i biosyntesen av CS, har disakkaridenhetene modifisert med bestemte sulfotransferaser ved C-2 av GlcA og C-4 og /eller C-6 av GalNAc i forskjellige kombinasjoner, og viser enorm strukturelle diversitet, å produsere kjennetegnende sulfat mønstre kritisk for binding til en rekke funksjonelle proteiner. Meget sulfat disakkaridenheter som E-enhet, GlcAβ1-3GalNAc (4S, 6S), hvor 4S og 6S står for 4-
O
– og 6-
O
sulfat, henholdsvis, og E-unit-rik CS (CS-E) preparater syntetiseres av et bestemt enzym, karbohydrat sulfotransferaseaktivitet 15 (CHST15), og viser bemerkelsesverdige biologiske aktiviteter [6-12]. Samle bevis har avslørt involvering av CS-E i tumorcelle invasjon og metastasering i lungene [6, 13], eggstokk [7, 14], bryst [15] og hud [16]. Rollen til CS-E i å initiere tumorcelle invasjon ble demonstrert, noe som tyder på potensialet i CS-E som et nøkkelmolekyl i å etablere nye behandlingsformer mot ulike solide svulster inkludert PDAC [17].
CS-E er uttrykt i både tumorceller og stromale celler som omgir svulsten i PDAC pasientens vev [17, 18]. Gitt fordelingsmønsteret til CS-E, er flertrinns og flercellede involvering av CS-E i PDAC progresjon har vært ansett som. En trinnvis undersøkelse er derfor nødvendig for å avsløre de nøyaktige mekanismene for CS-E i de underliggende ondartede karakteristikker av PDAC. Men involvering av CS-E i innledende PDAC progresjon har ennå å bli utforsket. I denne studien, for å undersøke om CS-E-funksjoner direkte på proliferasjonen av PDAC eller ikke, har vi utført blokkerende eksperimenter ved hjelp av små interfererende RNA utformet for å hemme ekspresjonen av CHST15 (CHST15 siRNA) som selektivt inhiberer CS-E-biosyntese. I enkle
in vitro Hotell og
in vivo
xenograft eksperimenter viser vi effekten av CHST15 siRNA på spredning av PDAC og diskutere potensialet i CS-E som et terapeutisk mål for PDAC.
Materialer og metoder
Materialer og reagenser
CHST15 siRNA ble kjøpt fra Ambion, Inc. (TX, USA). CS-E ble oppnådd fra Seikagaku Corporation (Tokyo, Japan), rekonstituert i fosfatbufret saltvann, alikvotert og lagret ved -20 ° C. WST-1 ble erholdt fra Roche Diagnostic GmbH (Mannheim, Tyskland). Lipofectamine
™ RNAiMAX Reagens og Invivofectamine
® 2.0 Reagens ble kjøpt fra Invitrogen (CA, USA).
Cellelinjer og mus
PANC-en, MIA PACA-2, CAPAN-en og CAPAN-2, bukspyttkjertelkreft cellelinjer, ble kjøpt fra ATCC (Rockville, MA, USA). Etter å ha sjekket at cellene var fri for mykoplasma-infeksjon ved bruk av Mycoplasma PCR ELISA-sett (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), PANC-1 og MIA PACA-2-celler ble dyrket i DMEM (SigmaAldrich, CA) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% antibiotika. CAPAN-1 og CAPAN-2-celler ble dyrket i IMDM (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) og McCoys 5A medium Modifisert (Sigma-Aldrich, CA) inneholdende 10% FCS og 1% antibiotika, hhv. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 /luft
Transfeksjon av siRNA
RNA interferens (RNAi) ble utført ved å bruke revers transfeksjonsmetoden:. Før Celleutplating , siRNA (50 nmol), Lipofectamine 2000 og Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) media ble blandet og inkubert i henhold til produsentens instruksjoner. Etter transfeksjon i 48 timer, ble cellene samlet og brukt til andre analyser.
Sanntid semikvantitativ RT-PCR
Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av SV Total RNA Isolation System (Promega, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA utbytte og renhet ble bestemt ved spektrofotometri. Revers transkripsjon ble utført med Moloney Murine Leukemia Virus revers transkriptase (Invitrogen) og tilfeldige heksamer (Promega, WI). Real-time RT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn med DICE termosykler i henhold til produsentens instruksjoner (TAKARA BIO INC., Otsu, Japan). Alle PCR-primere ble utformet og syntetisert ved TAKARA BIO INC. Gene ekspresjonsnivåer ble normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og presentert som vilkårlige enheter. De sense- og antisense-primere anvendt var vist i tabell 1. Og primersekvensene er oppført i Tabell 2. Uavhengige forsøk ble gjentatt tre ganger for hver prøve, og de relative uttrykk nivåer av gener ble analysert.
WST-1 celleproliferasjonsanalyse
For celleproliferasjonsanalyse, PANC-en, MIA PACA-2, CAPAN-en og CAPAN-2 celler transfektert med CHST15 siRNA eller negativ kontroll-siRNA ble sådd i en 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 1 x 10
4 celler /brønn. Celleproliferasjon ble undersøkt etter 60 minutter fra starten av inkubasjon med celleproliferasjon reagent WST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland).
Celleproliferering analysen med HGF og CS-E
PANC-1-celler (1000 celler) ble sådd ut i kulturmedium i et 96-brønn plate på dag før HGF stimulering. Cellene ble stimulert med 5 ng /ml HGF med eller uten 100 mikrogram /ml CS-E, og celleformering ble bestemt ved bruk av WST-1-analysen i 120 minutter ved 37 ° C.
CHST15 siRNA behandling i en PANC-1 xenograft modell
BALB /c nakne mus (6 til 9 uker gamle) ble kjøpt fra CLEA Japan (Tokyo, Japan), og ble opprettholdt under spesifikke patogenfrie forhold. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av The Jikei University School of Medicine (Permit Number: 25-067). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. PANC-1-celler (1 x 10
7 celler) i 100 mL av BD Matrigel
™ Matrix (BD, NJ) ble injisert subkutant i begge flanker av nakne mus [19]. Intratumoral injeksjon av enten 100 mL av 250 nM kontroll siRNA eller CHST15 siRNA kompleks med Invivofectamine
® 2,0 reagens (Life Technologies, CA) ble utført 7 dager etter vaksinasjonen. Tumorstørrelse ble målt hver annen dag. På dag 9 og dag 14 ble musene avlivet og tumorene ble isolert, veiet og benyttet for genekspresjon eller histologiske analyser.
Histologisk analyse
tumorvev ble fiksert i 10% fosfat -buffered formalin. Etter fiksering ble vevene innleiret i paraffin og kuttet slides ble brukt for Hematoxylin-eosin (HE) farging og immunhistokjemisk farging som tidligere beskrevet [20] for CHST15 hjelp av en anti-humant CHST15 antistoff (Sigma-Aldrich) i en fortynning på 01:25. Som et sekundært antistoff, Dako EnVision
™ FLEX /HRP deteksjonsreagensen (Dako, Danmark) ble brukt. Ingen positive signal ble detektert da utelate første antistoff, som støtter spesifisiteten til farving (data ikke vist).
Statistisk analyse
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronikorreksjon eller t-test. En
p
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Target-spesifikke siRNA-indusert CHST15 knockdown i bukspyttkjertelkreft cellelinje
Vi først bekreftet rikelig uttrykk for CHST15 mRNA i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer Panc-1, MIA PACA-2, CAPAN-en og CAPAN-2 ved hjelp av RT-PCR. Deretter ble disse fire celler transfektert med enten målspesifikke siRNA duplekser (CHST15 siRNA) eller en ikke-spesifikk siRNA regulering (siRNA). Genet Slå ble målt ved hjelp av sanntids-RT-PCR, og CHST15 ekspresjon ble redusert i PANC-1-celler med 1%, 85% og 87% i prøvene som er behandlet med target-spesifikke siRNA i 24 timer, 48 timer og 72 timer, respektivt . Ved 48 timer etter transfeksjon, ble det observert doseavhengig undertrykkelse av CHST15 mRNA-ekspresjonsnivåer (data ikke vist). Derfor, i suksessive studier, undersøkte vi effekten av CHST15 siRNA 48 timer etter transfeksjon siRNA. CHST15 ekspresjon ble redusert på MIA PACA-2, CAPAN-1 og CAPAN-2-celler med 75%, 42% og 36% i prøvene som er behandlet med target-spesifikke siRNA i 48 timer, henholdsvis.
Inhibering av pankreatisk kreftcelleformering som induseres av CHST15 siRNA
for å vurdere effekten av CHST15 knockdown (fig 1 A), ble celleformering undersøkt 48 timer etter starten av siRNA transfeksjon ved hjelp av WST-1-assay. Resultatene viste signifikant undertrykkende effekt av CHST15 siRNA på celleformering i PANC-1, MIA PACA-2, CAPAN-1 og CAPAN-2 (figur 1B). En økning i p21-genekspresjon-nivåer ble påvist i CHST15 siRNA-behandlede celler sammenlignet med kontroll siRNA-behandlede celler i PANC-1 og CAPAN-2 (figur 1C).
(A) Relative mengder CHST15 mRNA i kontroll behandlet siRNA og CHST15 siRNA behandlet PANC-1, MIA PACA-2, CAPAN-1 og CAPAN-2-celler (n = 3 i hver) ble vist etter normaliseringen ved hjelp av GAPDH som en intern kontroll. I hver cellelinjer, var det signifikante forskjeller om reduksjon av CHST15 ekspresjon i prøver behandlet med target-spesifikke siRNA i 48 timer. Stjerner (**, ***) p 0,01, P 0,001, henholdsvis mellom kontroll siRNA og CHST15 siRNA. (B) En WST-1-assay. Den midlere grad av spredning i kontroll siRNA behandlede celler (sort kolonne) ble uttrykt som en standard (1,0) og dataene ble vist i forhold til den standard som en spredningsindeks. Mean ± SD (n = 3). Signifikante suppressive virkninger av CHST15 siRNA på celleformering observert i PANC-1, MIA PACA-2, CAPAN-1 og CAPAN-2. Stjerner (*, **) p 0,05, P 0,01, henholdsvis mellom kontroll siRNA og CHST15 siRNA. (C) De relative mengder av p21 mRNA i kontroll siRNA behandlede og CHST15 siRNA behandlet PANC-1-celler (n = 3-5 i hver). Det var en svak økning og en betydelig økning av p21 mRNA i CHST15 siRNA behandlet PANC-1-celler og CAPAN-2-celler sammenlignet med kontroll siRNA, respektivt. Stjerne (*) p 0,05 mellom CHST15 siRNA og kontroll siRNA
Effekt av CHST15 siRNA på bukspyttkjerteltumorvekst i en xenograft modell
Etter å ha bekreftet PANC-en cellevekst i. naken mus på dag 7 etter vaksinasjonen, undersøkte vi undertrykkende effekt av CHST15 siRNA på PANC-en celleproliferasjon
in vivo plakater (figur 2). Etter injeksjon PANC-1 celler i begge flanker av nakne mus, vi administreres CHST15 siRNA inn i hver tumor på dag 7. Den anti-proliferative effekt av CHST15 siRNA ble identifisert mot kontroll siRNA etter dag 9. PANC-1-celler behandlet med CHST15 siRNA vokste saktere enn kontroll siRNA-behandlede celler og ikke-behandlede celler (figur 2A). Disse resultater indikerer at spredning av PANC-1-celler ble undertrykket etter knockdown av CHST15. Sanntid RT-PCR ble utført for å vurdere den gene-undertrykkende effekt, men det var ingen signifikant forskjell i genekspresjon mellom CHST15 siRNA-behandlede og kontroll siRNA-behandlede mus enten på dag 9 (data ikke vist) eller dag 14 (Fig 2B ).
(A) endringen i tumorvolum. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (Ubehandlet; n = 6, kontroll siRNA: n = 12, CHST15 siRNA; n = 10). Stjerner (*, ***) p 0,05, P 0,001, henholdsvis mellom kontroll siRNA og CHST15 siRNA. (B) Relative mengder CHST15 mRNA i ubehandlet, kontroll siRNA behandlet og CHST15 siRNA behandlet xenografter på dag 14. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (Ubehandlet; n = 6, kontroll siRNA: n = 12, CHST15 siRNA; n = 10 ).
Patologisk undersøkelse av bukspyttkjertelen svulsten ved hematoxylin og eosin farging og immunhistokjemi
for å demonstrere effekten av CHST15 siRNA, bukspyttkjertelen svulster i nakne mus ble analysert ved HE farging og CHST15 immunhistokjemisk farging (figur 3). I HE-farging, ble utbredt nekrose observert i CHST15 siRNA-gruppen (fig 3A) sammenlignet med kontrollgruppen siRNA-gruppen (fig 3B). Lokalisering av CHST15 i xenograft ble evaluert ved farging mot human CHST15 protein. CHST15 var sterkt uttrykt av tumorceller som ligger i invasiv front (fig 3A og 3C). Sterk CHST15-farging ble påvist i cytoplasmaet av celler med mesenchymale-lignende morfologi (figur 3E). I sentrum av tumoren, ekspresjonen av CHST15 var relativt lavere i forhold til den invasive fronten (fig 3A og 3C). Svak lokalisering av CHST15 kunne påvises i cellene i ledningen lignende struktur (fig 3F). I motsetning til dette ble en klar tap av CHST15 farging i tumor regioner av CHST15 siRNA-gruppen (fig 3D og 3G) avdekket.
(A, B) tumorer i nakne mus ved dag 19 ble farget med HE ( opprinnelig forstørrelse x 100). Representative bildene ble vist. Utbredt nekrose lesjoner var fremtredende i CHST15 siRNA-behandlede mus (A) sammenlignet med kontroll siRNA-behandlede mus (B). (C, D, E, F, G) Immunhistokjemisk farging av CHST15 (brune, originale forstørrelser × 100 for C, D, x400 for E, F, G) i xenografter på dag 19. Representative bildene ble vist. Selv om nesten alle tumorceller i xenograft var positive for CHST15 i kontroll siRNA behandlede mus (D), var sterkt positivt signal ble observert i invasive foran i stedet for sentrum av tumoren. CHST15-sterkt positive tumorceller oppviste mesenchymale-lignende morfologi (E), mens CHST15-lav-positive celler viste snor-lignende morfologi (F), I motsetning til dette lille antallet gjenværende tumorceller var svakt positiv for CHST15 i CHST15 siRNA behandlede mus (C ).
CS-E fremmet spredning av Panc-1-celler i nærvær av HGF
virkningen av CS-E på proliferasjonen av PANC-1-celler ble bedømt
in vitro plakater (figur 4). Selv HGF er kjent for å fremme proliferasjon av tumorceller, har den lavere dose av HGF anvendt i denne studien ikke induserer signifikant tumorcelle-proliferasjon. Imidlertid spredning indeks av PANC-1 ble betydelig øket med den samme dose av HGF i nærvær av CS-E (figur 4).
A WST-1 analysen ble utført ved anvendelse av PANC-1 celle. Den midlere grad av spredning i PANC-1-celler uten tilsetning av CS-E og HGF (hvite kolonne) ble uttrykt som en standard (1,0) og dataene ble vist i forhold til den standard som en spredningsindeks. Utbredelsen indeksen i PANC-1-celler behandlet med lav dose HGF (svart kolonne) viste ingen statistisk forskjell i kultursystemet. I motsetning til dette spredning indeksen i HGF-behandlede PANC-1-celler signifikant øket ved tilsetning av CS-E (grå søyle). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 6 i hver).
Diskusjoner
Prognosen for PDAC pasienter er fortsatt dystert, og revolusjonerende behandlingsalternativene er sterkt nødvendig. Det er kjent at den høye dødeligheten i forbindelse med PDAC er i hovedsak tilskrives den makeløse aggressivitet på grunn av sin tidlige invasjon og fjernmetastaser. Disse maligne egenskaper er observert i andre avanserte svulster som eggstokkreft. I eggstokkreft, er CS-E påvist i både kreft og stromale celler og er involvert i uforlignelig aggressivitet av kreft og korrelerer med dårlig prognose [21]. Basert på deres tilsvarende fordelingsmønstre, er det tenkt at både tumorcelle-avledet samt stromal celle-avledet CS-E spiller viktige roller i de ulike trinnene i tumorprogresjon i avanserte svulster.
For å undersøke hvilken rolle av CS-E i PDAC, brukte vi CHST15 siRNA, som selektivt hemmer ekspresjon av genet CHST15 og syntesen av CS-E. Vi valgte denne fremgangsmåten fordi den selektive hemming av CS-E ved hjelp av en tilstrekkelig mengde av kjemiske inhibitorer eller antistoffer er fortsatt en utfordring
in vivo
. Vi fokusert på effekten av CHST15 direkte på tumor, men ikke stromale, celleproliferasjon, en primær trinn for tumorprogresjon, i den humane bukspyttkjertelkreft cellelinje PANC-1. I tumor spredning, har gags blitt rapportert å opptre som co-reseptorer for løselige tumor vekstfaktorer. GAG lette dannelsen av ligand-reseptor-komplekser og aktivering av reseptorsignalisering.
Fordi HGF er en av de viktigste løselige faktorer produsert av tumorceller, samt stromale celler i PDAC, vi undersøkt hvorvidt aktiviteten av HGF kunne økes i nærvær av CS-E. Selv ved bruk av en lavere konsentrasjon av HGF, som ikke klarte å indusere tumorcellevekst, ble en signifikant økning i proliferasjon bekreftet i nærvær av CS-E (figur 4). CS-E alene ikke indusere tumor celleproliferasjon ved testet konsentrasjon, noe som indikerer at CS-E forsterker reseptor signalisering for HGF.
Uventet, CHST15 siRNA alene direkte hemmet spredning av Panc-1 celler
i vitro
. En tydelig mekanisme fra co-reseptorer ble også foreslått. Selv om vi ikke undersøke de detaljerte kinetikk i løpet av kulturen, nivåer av cellesyklus-inhibitor-relaterte genet p21
CIP1 /WAF1 økt i PANC-1-celler [22] som viste en betydelig reduksjon i CHST15 mRNA-nivåer etter 48 timer, noe som tyder at CHST15 genet lyddemping endret oppstrøms veier av p21. I denne forbindelse har opp-regulering av p21 blitt rapportert i noen tilstander i kreft i bukspyttkjertelen celler. For eksempel, å blokkere pinnsvin signale indusert oppregulering av P21 [23, 24]. På grunn av at CS-GAG-pinnsvin interaksjonen har blitt rapportert å forbedre pinnsvin signalering [25], er en mulighet for at blokkering av CS-E-syntese kunne bidra til å hemme pinnsvin signalering, som ville føre til en opp-regulering av p21. Videre undersøkelser er nødvendig for å forstå de CHST15-medierte mekanismer som regulerer cancer celleproliferasjon relatert til p21 pathway.
Vi testet også effekten av CHST15 siRNA på tumorvekst ved intratumoral injeksjon i en xenograft modell. Etter etablering av svulsten, en enkelt injeksjon av CHST15 siRNA undertrykte betydelig videre tumorvekst (Fig 2A). Vi observerte ikke signifikant reduksjon av menneskelige CHST15 mRNA nivåer en uke etter CHST15 siRNA injeksjon, på tidspunktet for offer, sammenlignet med negativ kontroll siRNA. I motsetning til dette, histologisk undersøkelse av de xenograft viste tydelig reduksjon av humant protein CHST15-positive tumorceller ved CHST15 siRNA en uke etter enkel injeksjon, noe som indikerer at vellykket inhibering av CHST15 ble oppnådd. En mulig forklaring på den mRNA-proteinet ubalanse er at nivået av tumor-avledet humant CHST15 mRNA nådde en topp på tidligere tidspunkter og minsket deretter til dag 9, hvoretter effekt på mRNA ikke kunne påvises i tilstrekkelig grad. En annen mulighet er at det kritiske nivået av CHST15 mRNA ikke blir tilstrekkelig detektert bare ved hjelp av PCR-metoden. Fordi CHST15-høyt uttrykte tumorceller kan bare påvises i invasiv front, men ikke i sentrum av xenograft, det er ansett som
in vivo
CHST15 siRNA virker hovedsakelig på følgende tumorceller som ligger i invasiv front. Antallet av disse cellene er begrenset blant hele tumorceller, og mRNA-signalene kan ikke i tilstrekkelig grad kan påvises ved PCR som ble anvendt hele xenograft prøven. Når initiering av tumorvekst ble undertrykt av CHST15 siRNA, og senere, ble produksjonen av CHST15 proteinet inhiberes, ytterligere vekstsignaler levert av CHST15-medierte vekstfaktorer kan ha vært effektivt undertrykket. Videre studier for å vurdere tidsforløp og /eller gjentatte siRNA injeksjoner kan avklare
in vivo
underliggende mekanismen mRNA-protein forholdet.
Denne studien viste, for første gang, at CHST15 siRNA kan undertrykke tumorvekst, som regnes som en primær stadium av tumorprogresjon på hovednettstedet. Imidlertid var det flere begrensninger i denne studien. For det første anvendte vi bare PANC-1-celler in vivo, selv om vi brukte tre forskjellige cellelinjer in vitro og observert liknende virkninger av CHST15 siRNA i tumorcelle-proliferasjon. For det andre, vi brukte en hud xenograft modell for enkelt å undersøke effekten av CHST15 siRNA på proliferasjonen og veksten av kreftceller. Ortotrop xenograft modeller vil gi ytterligere informasjon om rollen CHST15 siRNA i tumor celleproliferasjon i en svulst mikromiljøet. Det vil være verdt å forsøke å klargjøre hele bildet av den rollen CHST15 og CS-E i PDAC progresjon ved å analysere cellespesifikke og scene-spesifikke egenskaper.
Ruten av siRNA levering var begrenset til en intratumoral injeksjon i denne studien. Men anser vi at lokal injeksjon har noen fordeler når du arbeider med hypovascular svulster som i PDAC og for siRNA som systemisk levering er fortsatt en utfordring. Egentlig intratumoral injeksjon av siRNAs er for tiden tilgjengelig i kliniske settinger. En endoskopisk ultralyd (EUS) er ikke bare et diagnostisk verktøy, men også en intervensjons og terapeutisk prosedyre. Beviset på at intervensjons EUS er nyttig for PDAC behandling via injeksjon terapi inkludert sirnas har vært jevnt akkumulere [26-30]. Intervensjons EUS vil være en viktig del av tverrfaglig tilnærming til kreftbehandling i nær fremtid. Denne teknikken gjør det mulig å behandle PDAC i en direkte og relativt minimal invasiv måte, med en meget lav forekomst av prosedyremessige komplikasjoner. Vi anser at den kliniske anvendelsen av CHST15 siRNA hjelp EUS-tynn nål injeksjon for PDAC pasienter vil være mulig i en faktisk klinikken.
I sammendraget, vår studie viste at RNAi-mediert nedregulering av CHST15 effektivt hemmer spredning og vekst av pankreatiske tumorceller. Den CHST15 signalveien spiller en viktig rolle i PDAC spredning og vekst, og kan tjene som et potensielt terapeutisk mål for PDAC. Videre studier er nødvendig for å avklare effekt og risikoen for CHST15 genet Slå av CHST15 siRNA i PDAC utvikling og for å muliggjøre bruk i noen kliniske applikasjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Database. . Gene-undertrykkende effekt av CHST15 siRNA på dag-9 svulst i en xenograft modell
Relative mengder CHST15 mRNA i kontroll siRNA behandlet og CHST15 siRNA behandlet xenografter på dag 9. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (kontroll siRNA: n = 7, CHST15 siRNA; n = 5)
doi: 10,1371 /journal.pone.0142981.s001 plakater (docx)
.
