Abstract
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er en aggressiv kreft og dens prognose fortsatt dårlig. Derfor blir ytterligere effektiv behandling er nødvendig for å forsterke og /eller komplementpågående terapi. CD147, høy uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen, er involvert i metastatisk prosess og er ansett som en god kandidat for målrettet terapi. CD147-specfic bildebehandling kan være nyttig for valg av riktige pasienter. Derfor vurderte vi potensialet i et humant anti-CD147 monoklonalt antistoff 059-053 som en ny positronemisjonstomografi (PET) probe for kreft i bukspyttkjertelen.
Metoder
CD147 uttrykk ble evaluert i fire bukspyttkjertelcancercellelinjer (MIA Paca-2, Panc-1, BxPC-3, og ASPC-1) og en musecellelinje A4 som en negativ kontroll. Cell binding, kompetitiv hemming og internalise analyser ble utført med
125I-,
67Ga-, eller
89Zr-merket 059-053.
In vivo
biodistribusjon av
125I- eller
89Zr-merket 059-053 ble utført på mus som bærer MIA Paca-2 og A4 svulster. PET billeddiagnostikk med [
89Zr] 059-053 ble gjennomført i subkutane og ortotopiske tumor musemodeller.
Resultater
Blant fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer, MIA Paca-2 celler viste den høyeste uttrykk for CD147, mens A4 celler hadde ingen uttrykk. Immunhistokjemisk farging viste at MIA Paca-2 xenografter også sterkt uttrykt CD147
in vivo
. Radiomerket 059-053 spesifikt bundet til MIA Paca-2-celler med høy affinitet, men ikke til A4. [
89Zr] 059-053 opptak i MIA Paca-2 svulster økte med tiden fra 11,0 ± 1,3% injisert dose per gram (ID /g) på dag 1 til 16,9 ± 3,2% ID /g på dag 6, mens [ ,,,0],
125I] 059-053 opptak var relativt lav og redusert med tiden, noe som tyder på at 059-053 ble internalisert inn i kreftceller
in vivo Hotell og
125I ble løslatt fra cellene. PET med [
89Zr] 059-053 tydelig visualisert subkutane og ortotopiske svulster.
Konklusjon
[
89Zr] 059-053 er et lovende PET sonde for avbildning CD147 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen og har potensial til å velge riktige pasienter med CD147-uttrykke svulster som kan få nytte av anti-CD147 terapi
Citation. Sugyo A, Tsuji AB, Sudo H, Nagatsu K, Koizumi M, Ukai Y , et al. (2013) Evaluering av
89Zr-merket humant anti-CD147 monoklonalt antistoff som Positronemisjonstomografi Probe i en musemodell for kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (4): e61230. doi: 10,1371 /journal.pone.0061230
Redaktør: C. Andrew Boswell, Genentech, USA
mottatt: 24 desember 2012; Godkjent: 07.03.2013; Publisert: 05.04.2013
Copyright: © 2013 Sugyo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Institute of Radiologisk Sciences til TS. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en vanlig diagnostisert kreft og den åttende største årsaken til kreftdød verden over, sto for 278 684 av estimerte nye krefttilfeller og 266 669 av estimerte kreftdødsfall [1] (gLOBOCAN 2008, http: //globocan. iarc.fr/). Kreft i bukspyttkjertelen pasienter har mindre symptomer på medisinsk evaluering, og stille natur av denne sykdommen som ikke er klart før sent i sykdomsprosessen bidrar til en svært dårlig prognose. Kun 7% av pasientene stede med lokaliserte, potensielt kureres svulster på diagnose og ca 50% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er diagnostisert ved fremskredne stadier av sykdommen [2]. Den samlede fem års overlevelse blant pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er 6% i USA [2]. Derfor er ekstra effektiv kreftbehandling nødvendig for å forsterke og /eller supplere dagens behandlingsstrategier som kirurgi og kjemoterapi /strålebehandling, spesielt for pasienter med metastatisk kreft.
CD147 (såkalt EMMPRIN) er en 55- kDa transmembranprotein av immunglobulin super og er involvert i mange fysiologiske funksjoner, slik som spermatogenese, embryoimplantasjonen, lymfocyttaktivering, neurale nettverkdannelse ved tidlige stadier og induksjon av monokarboksylatet transportører [3]. CD147 uttrykker i mange typer av tumorer inkludert kreft i bukspyttkjertelen [4]. CD147 induserer ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser (MMP), slik som MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-MT1, og vaskulær endotelial vekstfaktor. Overekspresjon av CD147 i brystkreftceller med ekspresjonsvektoren transfeksjon resulterte i økt tumorvekst og metastase [5]. Disse funnene tyder på at CD147 er involvert i invasjonen, metastase, angiogenese og tumor spredning, og derfor er en god kandidat for målrettet kreftbehandling. Uttømming av CD147 ved RNA-interferens eller spesifikt antistoff redusert spredning, invasjon, metastasering av svulster og blodkardannelse, og derfor kliniske studier med CD147-rettet terapi har blitt utført [3], [6], [7]. Selv om forekomsten av CD147 uttrykk er høy (87%) i bukspyttkjertelkreft [4], er det noen svulster ikke uttrykke CD147, og dermed ikke er egnede kandidater for CD147-rettet behandling. Det er derfor viktig å benytte en ikke-invasiv avbildning metode for å evaluere CD147 status i et individ tumor på tidspunktet for behandlingen planlegging for å velge egnede pasienter for CD147-rettet terapi.
Nylig har vi isolert en ny humant monoklonalt IgG
1 antistoff betegnet som 059-053 mot CD147 fra en stor-skala humant antistoff-bibliotek konstruert ved anvendelse av en fag-display-system som innarbeides en meget effektiv screeningsmetode betegnet isolering av antigen-antistoffkomplekser ved organisk oppløsningsmiddel, med levende kreft i bukspyttkjertelen cellene [8]. Dette antistoffet induserer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) og inhiberer celleproliferasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler [8], [9]. I denne studien, radioaktivt merket vi 059-053, og evaluert
in vitro Hotell og
in vivo
egenskaper som en ny positronemisjonstomografi (PET) probe for å avbilde CD147-uttrykker svulster i et bukspyttkjertelkreft modell.
Materialer og metoder
Cells
Menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer (MIA Paca-2, PANC-en, BxPC-3, og ASPC-1) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). A4-celler, etablert fra mus 3T3-celler transfektert med en human HER2-ekspresjonsvektoren [10], ble anvendt som en negativ kontroll. Cellene ble holdt i RPMI 1640 medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 5% føtalt bovint serum (Sigma) i en fuktet inkubator holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
Subkutan og ortotopiske tumor musemodeller
dyret eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk komité i National Institute of Radiologisk Sciences, og alle dyreforsøk ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer for dyr omsorg og behandling. BALB /c-nu /nu hannmus (5 uker gamle, Clea Japan, Tokyo, Japan) ble opprettholdt under spesifikke patogenfrie forhold. For å indusere en subkutan svulst modell, ble musene inokulert subkutant med MIA Paca-2 (4 × 10
6) og A4 (1 × 10
6) celler i venstre og høyre lår, henholdsvis, under isoflurananestesi. Siden A4-celler vokser raskere enn MIA Paca-2-celler i mus ble det inokuleringen dag av hver cellelinje justert for å sikre at tumorxenografter var av samme størrelse ved tidspunktet for forsøket (ca. 30-dagers intervall mellom de to vaksinasjoner). For å indusere en ortotopisk tumormodell, vi kirurgisk implantert et xenopodet tumor i bukspyttkjertelen som tidligere beskrevet [11]. I korthet ble en subkutan tumor resected aseptisk, nekrotiske vev ble fjernet, og de gjenværende levedyktige tumorvev ble hakket i stykker på omtrent 5 mm i diameter i PBS (Sigma). Resipientmus ble bedøvet med isofluran inhalasjon, huden og bukhuleveggen ble radert ovenfor bukspyttkjertelen, ble pankreas forsiktig eksponert, og en tumor stykke ble transplantert inn i halen i bukspyttkjertelen ved anvendelse av en 6-0 silkesutur (Alfresa Pharma, Osaka, Japan). Bukspyttkjertelen ble returnert til bukhulen, og huden og bukveggen ble avsluttet med en 6-0 silke sutur.
CD147 protein uttrykk analyse
Western blotting og immunfluorescens farging ble gjennomført som tidligere beskrevet [12], [13]. I korthet, for western blotting, ble cellelysatet løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran (Hybond-P, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) og omsettes med et kanin anti-CD147 monoklonalt -antistoff (EPR4053, Abcam, Cambridge, UK) i 1 time ved romtemperatur. Det primære antistoff ble omsatt med en pepperrot peroksidase-koblet anti-kanin-antistoff (GE Healthcare) og membranen ble visualisert ved anvendelse av en ECL-Plus-kit (GE Healthcare). Etter bildene ble tatt med en LAS-3000 bildesystem (FujiFilm, Tokyo, Japan), ble antistoffer på PVDF membran fjernes med stripping buffer og farget membranen med Coomassie Brilliant Blue (ATTO, Tokyo, Japan) som en lasting kontroll. Intensiteten av hvert bånd ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare (National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA). For immunfluorescens farging ble cellene dyrket på dekkglass og fiksert i kald metanol i 5 min. Ikke-spesifikk binding av antistoffet ble blokkert ved å påføre Block Ace-reagens (Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan) med 10% geiteserum i 30 min. Celler ble inkubert med 059-053 som det primære antistoff [8] over natten ved 4 ° C. En sekundær anti-humant antistoff konjugert med Cy3 (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) ble påført i 30 minutter ved romtemperatur. Kjerner ble farget med DAPI i monteringsmedium. Bildene ble oppnådd med en eksponeringstid på 500 ms for CD147 ved hjelp av et fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Intensiteten av CD147-farging i hver cellelinje ble kvantifisert ved anvendelse av ImageJ programvare. For immunhistokjemisk farging, mus med subkutane svulster (MIA Paca-2 og A4) ble avlivet, og svulster ble fjernet og raskt frosset i optimal skjæring temperatur forbindelsen (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan). Tørket seksjoner (10 mikrometer tykke) ble fiksert med kald metanol og ble immunostained med geit anti-CD147 antistoff (AF972, R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Spesifikk binding ble blokkert av Block Ace regent med 10% geit serum. Prøvene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med det primære antistoff. En peroksydase-konjugert sekundært antistoff (Simple Stain MAX-PO, Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) ble påført i 30 minutter ved romtemperatur og deretter visualisert med et diaminobenzidin farging reagens (Simple Stain DAB-oppløsning, Nichirei Biosciences).
Radiomerking merking~~POS=HEADCOMP av antistoff
for
67Ga og
89Zr merking, den menneskelige anti-CD147 monoklonalt antistoff 059-053 (IgG
1) [8] ble konjugert med
p
-isothiocyanatobenzyl-desferrioksamin B (DF; Macrocyclics, Dallas, TX, USA) ved DF til antistoff molforhold på 03:01, slik som tidligere beskrevet [14]. Konjugeringen forholdet mellom DF til antistoff ble anslått til å være fra 1,0 til 1,3
67Ga-DF-konjugert antistoff til
67Ga-DF-forholdet bestemt ved størrelse-utelukkelses-kromatografi ved anvendelse av en PD10 kolonne (GE Healthcare) før rensing. Ikke-konjugert -chelatet ble fjernet ved anvendelse av en Sephadex G-50 (GE Healthcare) spinnkolonne. For
67Ga merking ble DF-konjugert antistoff (45 mikrogram i 10 mL PBS) inkubert med 600 kBq av
67Ga-klorid (70-80 MBq /ml, Nihon Medi-fysikk, Tokyo, Japan) for 1 time ved romtemperatur, og radiomerkede antistoffer ble renset på en Sephadex G-50 spinnkolonne. Den radiokjemiske utbyttet av
67Ga-merkede antistoff var 45% til 63%, den radiokjemiske renheten var høyere enn 96%, og den spesifikke aktivitet var 6 til 8 kBq /ug bestemt ved PD10 kolonnekromatografi. For
89Zr merking,
89Zr ble laget med en (p, n) reaksjon på
89Y (Nye Metaller og kjemikalier, Waltham Abbey, UK) i en alumina keramisk fartøy (Kyocera, Kyoto, Japan) ved vertikal bestråling med NIRS AVF-930 syklotron og renset med en hydroksamat kolonne av en automatisk gjenoppretting /rensing apparat som tidligere beskrevet [15]. DF-konjugert antistoff (100 ug i 20 ul PBS) ble inkubert med 2,8 til 5,2 MBq av
89Zr-oksalat (3,7 til 5,6 GBq /ml i 1 M oksalat, pH 7-8) i 1 time ved romtemperatur , og radiomerkede antistoffer ble renset på en Sephadex G-50 spinnkolonne. Den radiokjemiske utbyttet av
89Zr-merkede antistoff var 54% til 86%, den radiokjemiske renheten var høyere enn 96%, og den spesifikke aktivitet var 16 til 43 kBq /ug bestemt ved tynnskiktskromatografi under anvendelse av 50 mM dietylentriaminpentaeddiksyre ( Sigma, pH 7) som den mobile fase.
125I Merkingen ble utført med Na
125I (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) og kloramin-T (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) som tidligere beskrevet [12], noe som resulterer i spesifikke aktiviteter som strekker seg fra 119 til 669 kBq /ug.
In vitro
analysen
Cell bindende, kompetitiv hemming, og internalisering analysene ble utført som tidligere beskrevet [16]. I korthet, i en cellebindingsanalyse, i serie-fortynnet MIA Paca-2 eller A4-celler i PBS med 1% BSA (Sigma) ble inkubert sammen med det radiomerkede antistoffet på is i 60 min. Etter vasking, ble radioaktiviteten bundet til cellene ble målt. Immunreaktiviteten av radiomerkede antistoffer ble beregnet i henhold til metoden til Lindmo
et al
. [17]. I et konkurrerende inhiberingsanalyse, ble det radiomerkede antistoff inkubert med MIA Paca-2-celler i nærvær av varierende konsentrasjoner av umerket antistoff på is i 60 min. Etter vasking, ble radioaktiviteten bundet til cellene telles. Dissosiasjonskonstant ble estimert ved å bruke data til en ett-site konkurrerende binding modellen ved hjelp GraphPad Prism programvare (Graphpad Programvare, La Jolla, CA, USA). I en internalise assay, ble MIA Paca-2-celler preinkubert i kulturmedium med
125I- eller
67Ga-merket antistoff på is i 60 min. Etter vasking oppsamlede celler ble ytterligere dyrket ved 37 ° C eller på is i ferskt medium uten radiomerkede antistoffer. På forskjellige tidspunkter, ble supernatanten og cellene separert ved sentrifugering. Trikloreddiksyre ble tilsatt til supernatanten på is og deretter separert ved sentrifugering for å bestemme den ikke-proteinbundet fraksjon (supernatant) og proteinbundet fraksjon (pellet). Cellene ble vasket med sur buffer og deretter separert ved sentrifugering for å bestemme både den membranbundne fraksjon (supernatant) og internalisert fraksjon (pellet). Vi har utført disse
in vitro
analyser i duplikat.
Biofordeling
Når subkutane svulster nådd en diameter på ca 10 mm, ble musene injisert intravenøst med blandingen av
89Zr- og
125I-merket antistoff (37 kBq hver). Den totale injiserte proteindose ble justert til 20 ug per mus ved tilsetning av umerket antistoff. Ved 1, 2, 4 og 6 dager etter injeksjon av radiomerket antistoff, ble fem mus ved hvert tidspunkt avlives og blod ble oppnådd fra hjertet. Tumorer og viktige organer ble fjernet og veid, og radioaktivitets-tellinger ble målt ved anvendelse av en gammateller (PerkinElmer). Dataene ble uttrykt som prosent av injisert dose pr gram vev (% ID /g). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Tumoropptak data ble analysert ved ANOVA med Student-Newman-Keuls metode multippel sammenligningstest.
PET /computertomografi (CT) bilde
Vi har utført bildebehandling i to mus med subkutane svulster (MIA paca-2 og A4) med ca. 10 mm i diameter og en mus som bærer en ortotopisk tumor (MIA paca-2 alene) 3 uker etter implantasjon. Mus ble injisert med omtrent 3,7 MBq av
89Zr-merket antistoff i halevenen. Den injiserte proteindose ble justert til 100 ug per mus ved tilsetning av umerket antistoff. PET datainnsamling ble gjennomført på 30 min, og 1, 2, 4 og 6 dager etter administrasjon i 10 til 20 min ved hjelp av en liten dyr PET system (Inveon, Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA) under isoflurananestesi. Kroppstemperaturen ble holdt ved 36 ° C til 37 ° C ved en lampe og en varmepute under skanningen. Bilder ble rekonstruert ved hjelp av en 3D maksimal
a posteriori plakater (18 iterasjoner med 16 undergrupper, beta = 0,2) uten demping korreksjon. Sporstoffopptak ble uttrykt som% ID /g. Regionen av interesse ble manuelt trekkes over svulster og tracer opptak ble kvantifisert ved bruk av ASI Pro (Siemens Medical Solutions). Etter at PET-skanning av en ortotopisk tumor musemodell, ble CT-bilder ervervet med en røntgenkilde satt til 90 kVp og 200 uA ved hjelp av et lite dyr-CT-system (R_mCT2, Rigaku, Tokyo, Japan). Etter bildebehandling, gjennomførte vi biofordelingsstudier eksperimenter for å bekrefte PET resultater.
Resultater
CD147 protein uttrykk i bukspyttkjertelen kreftceller og transplantater
Vi er fast bestemt CD147 protein uttrykk i fire menneskelig kreft i bukspyttkjertelen -cellelinjer (MIA Paca-2, Panc-1, BxPC-3, og ASPC-1) og musa A4-cellelinjen som en negativ kontroll, ved hjelp av western-blotting og farging immunfluorescens. CD147 uttrykkes i de fire menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, men ikke i A4 (figur 1A og B). MIA Paca-2 viste den høyeste ekspresjon, fulgt av ASPC-1, PANC-1, og BxPC-3 som bestemt ved Western-blotting-analyse (figur 1A). MIA Paca-2 viste også den høyeste uttrykk som bestemt ved immunofluorescens-farging, men ekspresjon i ASPC-1, som var nest høyest i western blotting, var lavere enn for PANC-1 (figur 1B). CD147 protein ble hovedsakelig lokalisert på plasmamembranen av CD147-uttrykkende celler (figur 1B). CD147 uttrykk ble ikke påvist i A4-celler ved western blotting eller immunfluorescens analyser. Deretter gjennomførte vi CD147 immunhistokjemisk farging av MIA Paca-2 og A4 subkutane svulster. I MIA Paca-2 svulster, levedyktige kreftceller var intenst farget, men ikke nekrotiske celler eller stroma (figur 1C øvre panel). Ingen protein ekspresjon ble påvist i A4-tumorer (figur 1C nedre panel).
(A) Western blot-analyse av totalt cellelysat ved anvendelse av anti-CD147 antistoff (øvre panel) og Coomassie Brilliant Blue farging av det samme PVDF-membran som en lasting kontroll (nedre panel). Forholdet mellom båndintensitet er vist under panelene. (B) subcellulær lokalisering av CD147-protein bestemt ved immunofluorescens farging med anti-CD147 antistoff (rød) og DAPI nukleinsyre farging (blå). Forholdet mellom CD147 intensitet er vist på høyre side av panelene. (C) CD147 uttrykk i MIA Paca-2 (øverst) og A4 (lavere) xenopodet svulster bestemmes av immunhistokjemisk farging av frosne seksjoner (10 mikrometer tykk).
In vitro
karakterisering av radiomerket 059-053
Vi merket humant anti-CD147 monoklonalt antistoff 059-053 med
125I,
67Ga, eller
89Zr og gjennomførte en cellebindingsanalyse. Binding av [
125I] 059-053, [
67Ga] 059-053, og [
89Zr] 059-053 på 5 × 10
6 MIA Paca-2-celler var 63%, 73 %, og 94%, respektivt (figur 2A). Men binding av [
125I] 059-053 til 5 × 10
6 A4 celler var bare 1,3% (data ikke vist). Den immunoreactive brøkdel av [
125I] 059-053, [
67Ga] 059-053, og [
89Zr] 059-053 i MIA Paca-2-celler ble estimert til å være 0,80, 0,96 og 1,00 hhv. Den dissosiasjonslikevektskonstant og bindingssete av 059-053 ble estimert til å være 15,3 nM og 5,4 x 10
4 seter pr MIA Paca-2 celle, henholdsvis, ved konkurrerende inhiberingsanalyse (figur 2B). Vi undersøkte den timelige endringen i radioaktivitet lokalisering av [
67Ga] 059-053 og [
125I] 059-053 i MIA Paca-2 celler. Den cellemembran-bundet fraksjon hurtig redusert, mens den proteinbundne fraksjon i kulturmediet raskt øket for begge radiomerkede antistoffer (figur 2C og D). Omtrent 10% av [
67Ga] 059-053 ved maksimal ble internalisert etter inkubasjon (figur 2C). Når celler ble inkubert på is, fikk den membranbundne fraksjon ikke endres i minst 3 timer (data ikke vist).
(A) Cellebindingsanalysen for [
89Zr] 059-053 (hvitt trekanter), [
67Ga] 059-053 (hvite sirkler) og [
125I] 059-053 (svarte sirkler). (B) Konkurranse hemming analysen for [
125I] 059-053 (svarte sirkler). Intern analyse for [
67Ga] 059-053 (C) og [
125I] 059-053 (D). Endring i% av total radioaktivitet for hver fraksjon er plottet mot inkubasjonstid ved 37 ° C (svarte sirkler, internalisert fraksjon; hvite sirkler, membran-bundet fraksjon; svarte trekanter, protein-bundet fraksjon i kulturmediet, kryssmerker, ikke- proteinbundet fraksjon i kulturmedium). Disse analyser ble utført i duplikat. Data representerer hver replikere i A og B, og betyr i C.
In vivo
biodistribusjon av radiomerkede 059-053
biodistribusjon eksperimenter med
89Zr- og
125I-merkede 059-053 ble utført i nakne mus som bærer både MIA Paca-2 og A4 xenograft tumorer (n = 5 ved hvert tidspunkt). [
89Zr] 059-053 opptak i MIA Paca-2 svulster var 11,0 ± 1,3% ID /g på dag 1, som økte med tiden nådde 16,9 ± 3,2% ID /g på dag 6 (figur 3A). I motsetning til dette opptak i A4 tumorer (ikke-CD147-uttrykkende) var lav og avtok med tiden (figur 3A). MIA Paca-to-to-A4 opptak forholdet mellom [
89Zr] 059-053 var 1,7 ± 0,2 på dag 1 og øker med tiden (7,1 ± 0,5 på dag 6). Opptaket av [
89Zr] 059-053 i normale store organer, inkludert bukspyttkjertelen var lav og redusert gradvis med tiden unntatt for bein (figur 3A). Svulsten til bukspyttkjertelen opptak forholdet mellom [
89Zr] 059-053 var 9,1 ± 1,5 på dag 1 i MIA Paca-2 svulster, og det økte til 30,0 ± 6,7 på dag 6. MIA Paca-to svulst opptak av [
125I] 059-053 var 4,6 ± 0,5% ID /g ved dag 1 og vedvarte inntil dag 2, (4,6 ± 1,6% ID /g), men sank deretter (figur 3B). Opptaket i normale viktigste organene [
125I] 059-053 redusert gradvis med tiden, inkludert bein (figur 3B). [
89Zr] 059-053 opptak i MIA Paca-2 svulster på alle tidspunkter var signifikant høyere sammenlignet med det i A4 svulster og [
125I] 059-053 opptak i MIA Paca-2 og A4 svulster (
P
0,01)
Prøver ble samlet og veid, og radioaktiviteten ble målt på dag 1 (hvite søyler), 2 (dot barer), 4 (grå søyler) og 6 (svart. barer) etter intravenøs injeksjon av 37 kBq hver på [
89Zr] 059-053 (A) og [
125I] 059-053 (B). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 5). *
P
. 0,01 vs. [
89Zr] 059-053 tumoropptak på hvert tidspunkt analysert av ANOVA med Student-Newman-Keuls metode multippel sammenligningstest
PET avbildning av tumorbærende mus med [
89Zr] 059-053
for å bekrefte resultatet av biodistribusjon studie, utført vi PET avbildning med [
89Zr] 059-053. Serielle PET-bilder i to subkutane tumormodeller som bærer MIA Paca-2 og A4 tumorer ble oppnådd ved 30 minutter, og dagene 1, 2, 4 og 6 etter injeksjon. Ved 30 min, radioaktivitet i blodblandingen var meget høy, mens det i MIA Paca-2 og A4 tumorer var lav med ingen forskjell mellom de to (figur 4A). På dag 1, opptak i MIA Paca-2-tumorer (10,8% ID /g) ble markert øket og høyere enn i de A4 tumorer (6,6% ID /g), og bakgrunnen aktiviteten ble redusert. MIA Paca-2-tumoropptak ytterligere øket fra 12,2% ID /g ved dag 2 til 17,5% ID /g ved dag 6, mens bakgrunnen aktiviteten fortsetter å avta, noe som resulterer i en økning av kontrasten av MIA Paca-2 tumor tid (figur 4A). A4 tumoropptak gradvis redusert fra 6,6% ID /g på dag 1 til 4,1% ID /g på dag 6. Disse dataene var i utgangspunktet i tråd med resultatene i biodistribusjon studien. PET /CT-bilder i orthotopic svulst modellen fås dag 6 viste at PET med [
89Zr] 059-053 kunne visualisere orthotopic implantert svulsten ligger i bukspyttkjertelen halen (figur 4B). Fra PET data i orthotopic modell, tumor opptak av [
89Zr] 059-053 var 8,6% ID /g på dag 6. Fra biofordelingsstudier data etter PET, [
89Zr] 059-053 opptak i samme orthotopic svulst var 15,5% ID /g. Siden ortotopisk tumorstørrelsen var omtrent 5 mm i diameter, kan den partielle volumeffekten påvirke kvantitative data fra PET.
(A) for serie PET-bilder (maks-intensitet-projeksjon) av en naken mus som bærer MIA PaCa- 2 (gul pilspiss) og A4 (hvit pilspiss) xenopodet svulster på 30 min, og dag 1, 2, 4 og 6 etter intravenøs injeksjon av 3,7 MBq [
89Zr] 059-053. PET-bilder av den samme mus er vist ved forskjellige skala innstillinger. (B) Koronale (øverst) og transaksialtomografiscanner (lavere) bilder av PET /CT i mus orthotopic bukspyttkjertelkreft modell (gul pilspiss, MIA Paca-2) på dag 6 etter injeksjon.
Diskusjoner
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige menneskelige kreftformer, ranking femte og fjerde blant kreftrelaterte dødsfall i henholdsvis menn og kvinner, i økonomisk utviklede land [1]. Dens prognose er svært dårlig og 5-års overlevelse for pasienter i USA med lokal og fjernt metastatisk kreft er 22% og 2%, henholdsvis [2]. Derfor blir ytterligere effektiv anticancerterapi kreves, spesielt for pasienter med metastatisk kreft. CD147 svært uttrykker i bukspyttkjertelkreft [4] og er involvert i metastatisk prosessen [3], og derfor regnes som en god kandidat for målrettet kreftbehandling [3]. CD147-spesifikke ikke-invasiv bildediagnostikk kan være nyttig å velge riktige pasienter som mest sannsynlig å dra nytte av anti-CD147 terapi. I denne studien har vi evaluert
in vitro Hotell og
in vivo
egenskapene til en roman humant monoklonalt antistoff 059-053 som gjenkjenner CD147, og merket det med en positronemitter
89Zr, for å utvikle en ny PET probe for å påvise CD147 uttrykk i bukspyttkjertelkreft.
Først vurderte vi CD147 protein uttrykk for fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer (MIA Paca-2, Panc-1, BxPC-3, og ASPC-1) ved western blotting og farging immunofluorescens for å velge en passende bukspyttkjertelkreft cellelinje for å bedømme radiomerkede 059-053. MIA Paca-2 cellelinje viste det høyeste uttrykk som bestemmes av western blotting og immunfluorescens farging analyse. I tillegg fikk vi bekreftet at MIA Paca-2 celler dannet subkutane og ortotopiske svulster i nakne mus og høy CD147 uttrykk i disse svulstene ble bestemt ved immunhistokjemisk farging. A4 celler viste ingen CD147 protein uttrykk enten
in vitro
eller
in vivo
. Derfor valgte vi MIA Paca-2 celler som positiv kontroll og A4 celler som en negativ kontroll for følgende vurdering.
Deretter radiomerket vi 059-053 med
125I,
67Ga, eller
89Zr og evaluert sine
in vitro
egenskaper. Cellebinding og konkurrerende hemming analyser avslørte at 059-053 spesifikt bundet til MIA Paca-2-celler med høy affinitet, men ikke til A4-celler. Den immunreaktive fraksjon av radiomerkede antistoffer var mer enn 0,8, hvilket indikerer at tap av immunreaktivitet av radiomerkingsprosedyrer var minimal. Internalise Analysen viste at proteinbundne fraksjoner i dyrkningsmediet raskt øket etter inkubering ved 37 ° C, og den internalisert fraksjon var lav. Dette tyder på at CD147-antistoff-komplekset er lett løsrevet fra plasmamembranen under vilkår /prosedyrene i dette intern eksperiment. I den foreliggende undersøkelse, selv om vi har benyttet
67Ga på vegne av
89Zr for internalisering analysen, dette resultatet betraktes å være forenlig med det ved hjelp av
89Zr-merket antistoff fordi chelatet (DF) er felles mellom to radiometaller, disse radiometaller med DF-komplekset er kjent for å være stabil
in vitro
og
in vivo product: [18], [19], [20], [21], [22], og biodistribusjon ble rapportert å være lik mellom
68Ga- og
89Zr-merket antistoff [20]. I motsetning til resultatet av internanalyse,
in vivo
distribusjon studien viste at opptaket av [
89Zr] 059-053 i MIA Paca-2 svulster var svært høy og økt med tiden, noe som tyder på at CD147-antistoff-komplekset ikke løsner fra membranen
in vivo
. Videre er en forskjell i tumoropptak mønstre mellom [
89Zr] 059-053 og [
125I] 059-053 antyder sterkt at radiomerket 059-053 ble internalisert i celler etter binding til CD147 på celleoverflaten
in vivo
. Etter at forbrenningen inne i cellene, vil
125I aktivitet bli fjernet fra cellene, mens
89Zr aktivitet ville bli beholdt i celler. Tatt sammen, trypsinering av celler sannsynligvis forårsaket resultatene vi observert i internalisering analysen, selv om varigheten av trypsinering ble gjort så kort som mulig for å minimalisere skade på CD147 på celleoverflaten med trypsin. I den foreliggende sak,
in vivo
distribusjon var ikke fullt rekapitulert av
in vitro
eksperimenter. Det er bemerkelsesverdig at
in vivo
studie med subkutane xenografter vist at [
89Zr] 059-053 høyt akkumulert i MIA Paca-2 svulster, men ikke i A4 svulster. Dette ble bekreftet av serie PET billeddiagnostikk, noe som indikerer at [
89Zr] 059-053 er et lovende PET probe for påvisning av CD147-uttrykker svulster og i valg av riktige pasienter for anti-CD147 terapi. Biofordelingsstudier studier har vist at opptaket av [
89Zr] 059-053 i normale store organer redusert med tiden unntatt for bein, som ikke er sannsynlig å være selve antistoffet opptak, men bein-søkende
89Zr katabolitter akkurat det samme som for andre antigener [21], [22], [23], [24]. Siden vår anti-CD147 antistoff 059-053 ikke binder seg til muse CD147, kan våre resultater i murine modellen ikke fullt ut forutsi fordelingen hos mennesker. CD147 uttrykk er rapportert å være høy i de fleste kreftvevet, men det er begrenset i normalt vev [4]. Scintigrafi med
131I-merket anti-CD147 F (ab «)
2 hos pasienter med leverkreft (HCC) har vist lavere opptak i normale organer enn i HCC vev [25]. Derfor vår anti-CD147 antistoff 059-053 er ventet å vise lav opphopning i normale organer pasienter, selv om ytterligere klinisk studie vil være nødvendig å presist vurdere opptak normal organ.
underhudssykdommer tumormodeller er kraftige verktøy for onkologisk undersøkelser, men disse modellene kan ikke alltid etterligne kliniske funn.
